草食動物によって誘導されたブルーベリー揮発性物質とイントラ植物のシグナリング

要約

植物の揮発性物質を収集するためのプッシュプルの方法が記載されている。方法は、草食動物の摂食、外因性のジャスモン酸メチル、及び機械的損傷によって誘導される揮発性成分の比較ができます。この手法はまた、ブルーベリー、植物内の草食動物で痛んだ枝から揮発成分への曝露に無傷の枝の揮発性の応答を調査するために使用されます。

要約

草食動物によって誘導された植物の揮発性物質（HIPVsは）一般的に草食動物の攻撃の^1,2の後に植物から放出される。これらHIPVsは主に防御的な植物ホルモンであるジャスモン酸（JA）とその揮発性誘導体ジャスモン酸メチル（メジャ^）3,4,5によって規制されている。過去30年間にわたって研究者がHIPVsが撃退するか誘致草食動物を、草食動物の天敵を誘致し、いくつかのケースで彼らは草食動物の攻撃の前に植物の防御を誘導または素数できることを文書化している。最近の論文⁶では、私は違うとはいえ、ブルーベリーの植物からの揮発性物質の放出を誘導マイマイガの幼虫、外因性メジャアプリケーション、および機械的損傷によってその餌を報告した。加えて、ブルーベリーの枝はJAと草食動物（すなわち、直接植物の防御）への抵抗のレベルを増加させることによって、同じ植物の隣接枝から放出さHIPVsに応答し、プライミング揮発性排出によって（すなわち、間接的な植物の防御）。見つける同様のイングスはヤマヨモギ^7、ポプラ^8、アオイマメ⁹の最近報告されている..

ここで、私は草食動物（マイマイガ）給餌、外因性メジャアプリケーション、および機械的損傷によって誘導されるブルーベリー揮発性物質を収集するためのプッシュプル方式を説明します。揮発収集ユニットは、4 L揮発収集チャンバー、2ピースのギロチン、入ってくる空気を浄化する空気供給システム、および揮発性物質^5,6,10を収集するためにスーパーQ吸着剤を充填したトラップに接続された真空システムから構成されています。スーパー- Qトラップで収集された揮発性物質をジクロロメタンで溶出して分離し、ガスクロマトグラフィー（GC）を用いて定量されています。この揮発性の収集方法は、ブルーベリー、植物内の草食動物で痛んだ枝から揮発成分への曝露に無傷の枝の揮発性の応答を調査するために使用さnの私の研究は⁶した。これらのメソッドはここで説明されています。簡単に言えば、損傷していないブルーベリーの枝があちこちにHIPVsにさらされているmは、同じ工場内での分岐を隣接。上記と同じ技法を使用して、HIPVsへの曝露後の枝から放出される揮発性物質を収集し、分析されています。

プロトコル

1。揮発性物質の局所誘導：草食動物の損傷

1. ブルーベリー植物の二つの枝は、スパンポリエステルのスリーブにパックされます。
2. 六マイマイガの幼虫^（2回-3 ^回の齢期）はバッグの内側に配置し、揮発性のコレクションの前に2日間、植物を餌に許可されています。コントロール植物はどんな毛虫を受信しません。
3. 揮発性排出量は、3日目（図1）に（プロトコル＃7）以下のように収集されます。ポリエステルのスリーブは、エスケープから虫を防ぐために植物に残ります。

2。揮発性物質の局所誘導：機械的損傷

1. 植物への機械的な損傷は、マイマイガで除去葉面積の量を模倣するためにパンチされた穴を与えたれている。
2. 植物当たり五葉は1日目および2日目の最後​​にある基本と葉の上部にある2つの7 mmの穴を負傷している。コントロール治療には、機械的な損傷を受けていません。
揮発性の排出量が収集されます。

3。揮発性物質の局所誘導：メジャ

1. ブルーベリー植物が0.1％のTween - 20溶液中メジャのどちらか1または1.5 mM溶液を10 mLで扱われます。
2. メジャは、2オンススプレーボトルを使用して適用されます。コントロール植物は0.1％のTween - 20溶液10 mLを噴霧されています。
3. 植物は、午前16時00時間で治療、および17 cmの直径と揮発性のコレクションの前に35センチの高さプレキシグラス室内の15時間のために温室に保管されています。
4. 下記のように揮発性の排出量が収集されます。

4。揮発性物質の全身的誘導：内部信号

1. ブルーベリー植物の下の分岐は、スパンポリエステルのスリーブと袋詰めや袋の内側に六（第²回-3 ^回の齢期）マイマイガの幼虫を置くことによって破損している。
2. 破損した枝は、揮発性の収集チャンバーの外に出たまましばらくbranche損傷した枝の上にSが（ 図2）チャンバ内に配置されます。
3. 毛虫は、2日間底枝を餌に許可されています。
4. 3日目に始まる、揮発性物質が損傷を受けた植物の破損していない部分から収集されます。
5. 揮発性物質を7日間連続収集されます。コントロール植物は同様の方法で扱われていますが、草食動物の被害を受けなかった。

5。血管の接続

1. この研究は、ブルーベリー、植物内で異なるブランチ間の血管の接続性の程度を決定する。
2. 植物から低い枝の端部は、Oriansらに記載されてローダミン- B（Sigma - Aldrich）を染料（0.25％w / v）を、6mLのソリューションが含まれているフローラルウォーターピックをサポートするためにカットされます^。11
3. 植物を通して染料の動きは7日間毎日監視されています。
4. 7日後、赤い染色の量が視覚的に植物の異なる位置から評価される。

6。 HIPVsへの暴露：外部のシグナリング

1. 工場内のブランチのいずれかの隣接するブランチからHIPVsにさらさまたはHIPVsへの曝露を受けていない。
2. HIPVsに支店を公開するには、一つ下の枝は、ポリエステルのスリーブと六（第²回-3 ^回の齢期）マイマイガの幼虫が袋（ 図3）の内部に配置されていると袋詰めしています。
3. 植物は、上述と同様なプレキシグラスのチャンバー内にケージに入れています。昆虫は、隣接する枝を誘導枝から放出される揮発性物質にさらされているように、2日間、植物を餌に許可されています。
4. 露出（3日目）の後、露出した枝は、外側の昆虫外傷のブランチを（ 図2に示すように）残して、揮発性の収集チャンバ内に配置されます。
5. HIPV -露出支店からの揮発性物質は、後述するように収集され、そして下の枝から消費葉面積の量は、サイオン画像ソフト制を用いて測定される再。

7。 HIPVsへの暴露：プライミング

1. 植物がHIPVの曝露後に"プライミング"されているかどうかを判断するために、植物はプロトコル＃5のように扱われます。
2. 植物の半分は誘導隣接するブランチからHIPVsにさらされ、残りの半分が損傷を受けていない枝にさらされている間。
3. 3日目、4つの初期の第²齢のマイマイガの幼虫は、各工場に配置され、下記のように揮発性物質（ 図4）収集されます。
4. 揮発性のコレクションの後、最初に、マイマイガの幼虫だけでなく、3日目に損傷しているもので損傷葉を切除していると葉面積の消費量を測定している。

8。揮発性物質のコレクション

1. HIPV排出量は、プッシュプルシステムを使用して温室でサンプリングされます。草食動物の損傷の治療に毛虫を含む鉢植えの植物の地上部分（茎、枝、そして葉が）、、4 L VOLAの内部に配置されていますタイルのコレクションチャンバー。 2ピースのギロチンは、植物のベースをサポートしています。精製された空気は、2 L /分の速度で、各チャンバーの上部に入ります。
2. 揮発性物質を1​​ L / minの速度でチャンバから空気を引っ張ってアルテックスーパーQ吸着剤30mgので満たされたトラップで収集されます。
3. 揮発性の収集装置は、4つの異なるプラント（図1）から揮発性物質の同時収集を可能にする、4室で構成されています。
4. コレクションは、午前9時から17:00 hに昼間に実施されています
5. コレクションの後、工場からのすべての葉が収穫される、C 60℃でオーブン乾燥、及び計量し、チャンバーは、水道水及び70％エタノールでリンスしている。

9。揮発性物質の分析

1. スーパー- Qトラップから収集された揮発性物質をジクロロメタンで溶出される（150μL）とn -オクタンの400ngのは、内部標準として追加されます。
2. 化合物の分離と定量は、ヒューレットパッカード6890シリーズ上で行われます水素炎イオン化検出器（FID）とAgilent HP - 1カラム（10 mxの0.53ミリメートルX 2.65ミクロン）、およびキャリアガス（一定流量= 5ml /分として彼を使用して装備したガスクロマトグラフ（GC）（図5）、 、速度= 39 cm /秒）。 40で開始温度プログラム° Cが14歳で増加し、1分間保持° C / 180分° C（2分）、その後40℃/ minで200℃、および200℃に保た℃で2分間。
3. 化合物の暫定的な同定は、スペルコMDN - 5Sカラム（30 mxの0.32ミリメートル× 0.25μm）を持つ、およびキャリアガスとして彼を装備フィニガンマット8230質量分析計（MS）、に結合バリアン3400 GCで行われている。 MSは、電子イオン化（EI）および250 ° C（ソースの温度）でのトータルイオンクロマトグラム（TIC）モードで動作させます。プログラムは35℃（1分）、° C / minで170℃、その後15℃〜280℃/ minで4℃上昇で始まった
4. 化合物は、暫定的にNISTライブラリとBのものとスペクトルデータの比較によって同定されていますyのGC保持指数、及び市販の化合物のものとそれらの保持時間を比較することにより。

10。代表的な結果：

二十二揮発性物質は、ブルーベリーの葉（ 図6）から同定された。 図7は、マイマイガで供給することにより、損傷無傷のブルーベリーの葉と葉の代表的なクロマトグラフを示しています。マイマイガの幼虫による機械的損傷や給餌はコントロール（ 図8）と比較してブルーベリーの葉からローカルに揮発性物質の排出量を増加した。毛虫の摂食に比べて、メジャの治療は、マイマイガ（ 図9）により誘発される17化合物のうち11を誘導した。マイマイガなどで損傷を受けた七日、最初の食害（すなわち、内部信号の欠如）（ 図10）後の植物の無傷の葉からの揮発性物質の全身的誘導の証拠は、しかし、ありませんでした。加えて、一週間後に、非常に遅い動き赤色の染料のメンターは、ブルーベリー、植物の枝（ 図11）の間で観察された。単一のブランチ内の葉の間で高い血管の接続があった。しかし、2つの垂直シュート内に整列枝、そしてシュートの反対側にある2つのブランチ間の低接続の間に中間レベルからローレベルへの接続があった。

HIPVs（ 図12）にさらされていないものに対してHIPVsにさらされた枝から放出される揮発性物質の量との間に差はなかった。しかし、HIPVsはブルーベリーの外部防御的な信号として機能します。葉を摂食マイマイガの幼虫は、以前はそれらの供給が非曝露制御の葉（ 図13）上よりも71パーセント少なく葉材料を消費HIPVsにさらされる。さらに、HIPV -露出支店で消費葉面積の量あたりの排出される揮発性物質の量は示す、未露光の枝（ 図14）に比べて4倍高いことがHIPV - EXからの葉枝は草食性（すなわち、それらがプライミングされた）に柔軟に対応したポーズをとった。

図1。プッシュプルシステムは、ブルーベリーの植物からの揮発性物質を収集するために使用されます。植物は、ガラスチャンバ内に配置され、清浄な空気がその上を渡されます。吸着剤材料を含むフィルターは、植物から放出されるトラップの揮発性物質に各チャンバーの側面に装着された。真空は、フィルターを通ってチャンバの内側から空気を引っ張るために使用されます。

図2。ブルーベリー植物から全身性の応答を調べるために、下のブルーベリーの枝がどちらかマイマイガの幼虫（右室）によって破損されたまたは破損していない左（左室）。 2日間（3日目）後に、損傷や破損していない植物から無傷の上部の枝からの揮発性物質を採取した。

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図3。無傷の枝から葉が損傷した枝からHIPVsに応答するかどうかをテストするには、私はブルーベリー、植物のそれぞれの分岐のいずれかを袋詰め。私は、その後の植物の半分の袋の内部にマイマイガの幼虫を置く。私が使用したバッグは、内側から袋の外に揮発性物質の動きを可能にする。植物はHIPVsに無傷の枝を公開するプレキシグラスチャンバ内に置かれた。揮発性物質はその後、露出した枝から採取された。

図4。無傷の枝から葉がHIPVsへの曝露後に"プライミング"されているかどうかをテストするには、図3で説明したように実験が繰り返されたが、マイマイガの幼虫は、それぞれの揮発性の収集チャンバ内のHIPV -露出と未露光枝に配置されました。

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図5。揮発性のコレクションの後、サンプルはブルーベリー植物から放出される揮発性物質を特定し、定量化するガスクロマトグラフ（GC）に注入されています。

図6。少なくとも22の化合物は、ブルーベリーの葉から放出されています。

図7。マイマイガの幼虫によって損傷無傷のブルーベリーの葉と葉からの典型的なクロマトグラフ。揮発性物質は、無傷のブルーベリーの葉からは非常に低い量で放出される。しかし、葉がマイマイガの幼虫によって破損した場合、揮発性物質の放出が劇的に増加した。

図8。グラフは無傷の葉、mから放出される22揮発性成分のそれぞれの量を示しています。マイマイガの幼虫によって損傷echanicallyで痛んだ葉、葉。毛虫による除去葉面積の量を模倣する人工的な損傷は、ブルーベリーの葉から揮発性の放射を増加したが、応答は、マイマイガの給餌への葉の揮発性の反応とは異なっていた。

図9。JAの経路は、ブルーベリーの葉の揮発性の放出を調節するかどうかを試験した。植物は、メジャの異なる量で噴霧した。私は外生的に適用されたメジャの増加する濃度は、ブルーベリーの葉から揮発性物質の排出量を増加させることが見つかりました。

図10。グラフは制御ブルーベリーの枝からとマイマイガ損傷した植物（全身反応）から無傷の枝から放出される揮発性成分の合計量を示しています。揮発性物質のために収集された7日間連続のTAL。私も7日間の植物の下側の枝に初期損傷後の揮発性物質のない全身的誘導は認められなかった。

図11。私はブルーベリー、植物内の支店間の血管の接続性の程度を決定するためにローダミン- B（赤色色素）を使用。私はその約を発見した。 80％、20％、5％、染料を含む枝から葉の0％、直接染料、染料を含む支店の支店、そしてブルーベリープラント内の別のシュート内にある支店を含むブランチ上の枝は、それぞれ、だった完全に色素で染色。

図12のグラフはHIPVsと未露光の枝にさらされた枝から放出される揮発性物質の量を示しています。私はHIPVsへの曝露がいななきで揮発性の排出量に影響しなかったことが判明無傷のブルーベリーの枝を退屈。

図13。グラフはHIPVsと未露光の枝にさらされるブルーベリーの枝にマイマイガの幼虫が摂食量を示しています。 HIPV -露出した枝上の幼虫は、未露光の枝上のものと比較して葉の少ない量を消費。

図14。私は消費面積あたりの放出率を計算した、私はHIPV -露出枝が増加揮発性の応答のためにブルーベリーの枝に葉をプライミングHIPVsへの暴露を示し、未露光の枝に比べて揮発性物質の放出率を増加していたことが分かった。

ディスカッション

プッシュプル揮発回収装置は、植物の揮発成分のヘッドスペースのコレクションのための標準メソッドを表すここで説明する。この装置は、マイマイガの幼虫による食害にブルーベリーの葉の揮発性の応答を決定するために使用し、また私がイントラ植物のシグナル伝達におけるHIPVsの役割のための新たな証拠を提供させた。

結果は、その毛虫の摂食、外因的に適用され...

資料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
揮発コレクションチャンバー	分析リサーチシステムズ株式会社	VCC - G6X12DT - 1P	ゲインズビル、フロリダ州
空気圧縮機、20ガロン、オイルフリー、2馬力	西へ	3JR71	グレインジャー、（株）が販売
空気供給システム	分析リサーチシステムズ株式会社	VCS - ADS - 4AFM4C	ゲインズビル、フロリダ州
空気の収集システム	分析リサーチシステムズ株式会社	VCS - MVCS - 4CX1P	ゲインズビル、フロリダ州
真空ポンプ100 - 150V、¼馬力	ガストマニュファクチャリング株式会社	4F740	グレインジャー、（株）が販売
ジャスモン酸メチル	シグマアルドリッチ	J2500	セントルイス、ミズーリ
Tween - 20を	シグマアルドリッチ	93773	セントルイス、ミズーリ
ローダミン- B	シグマアルドリッチ		セントルイス、ミズーリ
プラスチックのスプレーボトルは、2オンス	Setco株式会社		クランブリー、ニュージャージー州
スパンポリエステル袖	ロッキンガムの機会（株）		リーズヴィル、ノースカロライナ州
スーパーQ揮発コレクショントラップ	分析リサーチシステムズ株式会社	VCT-1/4X3-SPQ	ゲインズビル、フロリダ州
サイオンのイメージソフトウェア	サイオン社		メリーランド州フレデリック
ジクロロメタン	シグマアルドリッチ	270997	セントルイス、ミズーリ
ガスクロマトグラフHP 6890	ヒューレットパッカード
ガスクロマトグラフバリアン3400	バリアン
n -オクタン	シグマアルドリッチ	296988	セントルイス、ミズーリ
質量分析計のMAT 8230	フィニガン		サンノゼ、カリフォルニア州
HP - 1 GCカラム	アジレントテクノロジー		パロアルト、 CA
MDN - 5S GCカラム	スペルコ社		ベルフォンテ、ペンシルバニア州