成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役

要約

このような半導体量子ドット（QD）のようなナノ粒子は、抗微生物や抗がんアプリケーションのために光活性化剤を作成するために使用することができます。このテクニックは、テルル化カドミウム（CdTe）量子ドットを水可溶化抗生物質にそれらを共役、成長曲線とプレートカウントに基づいて、細菌の阻害アッセイを実行する方法を示します。

要約

量子ドット（QD）は波長の幅広い選択肢によって励起することができる大きさに依存する発光スペクトルを有する蛍光半導体ナノ粒子である。量子ドットは、イメージング、診断、およびそれらの明るい、安定した蛍光^{1,2 3,4,5}による治療のために多くの関心を集めている。量子ドットは、細菌および哺乳類細胞を⁶に結合するためのバイオ活性分子の様々に結合させることができる。

量子も広く細菌の標的殺害の細胞毒性薬として検討されています。乗算耐性菌株の出現は急速に、特にグラム陰性病原体⁷の場合には、公衆衛生の危機となっています。ので、特に特定のナノ材料は、Agの既知の抗菌効果で、細菌⁸にナノ粒子の毒性を調べる試験の何百ものがあります。細菌の研究はスペックだけでなく、半導体ナノ粒子の他のタイプと実行されているially TiO _2の ^9,10-11なく、ZnOを¹²とCuOの^13を含む他人。菌株のいくつかの比較は、通常、グラム陽性とグラム陰性菌株を比較すると、これらの研究で行われてきた。粒子や酸化毒性を引き起こす可能性があり、金属イオンの直接の放出によって活性酸素種のphotogeneration（ROS）次のいずれかのこれらの粒子のすべてに、毒性のメカニズムは酸化に起因しています。これらの材料であっても、別の試験の結果が大きく異なります。いくつかの研究ではグラム陽性菌株は伝えグラム陰性^10を超えると小文字が区別されます。他のものでは、それは反対側の¹⁴です。これらの研究は十分に¹⁵件されています。

すべてのナノ粒子の研究では、粒子の組成、サイズ、表面化学、サンプルのエージング/内訳、波長、パワー、光曝露の期間はすべて劇的に結果に影響を与えることができます。加えて、synthesiの副産物と溶媒は^{、16 17を}考慮する必要があります。ハイスループットスクリーニング技術は、効果的な新しいナノメディシンエージェントを開発することができるように必要とされている。

CdTeの量子ドットは、抗微生物効果を単独で¹⁸または抗生物質との併用を持っています。以前の研究では、CdTeのために抗生物質の結合はコンジュゲート¹⁹からの活性酸素種の減少、生産のために、細菌への毒性を増加させるが、哺乳動物細胞への毒性を減少させることができることを示した。それはカドミウム含有化合物は、ヒトでの使用が承認されることはほとんどありませんが、そのような製剤は、表面や水の殺菌の消毒に使用することができる。

このプロトコルでは、メルカプトプロピオン酸（MPA）とCdTeの量子ドットの可溶化への直接的なアプローチを提供します。量子ドットは1時間以内に使用する準備が整いました。その後、抗菌剤への結合を示しています。

プロトコルの第二部共役および非共役量子ドットを用いた96ウェル細菌の阻害アッセイを示しています。光学密度は、QDのほか、回復期間の直後と同様に評価されるように露光の効果を可能にして、多くの時間にわたって読み込まれます。我々はまた、細菌の生存率を定量化するためのコロニー数を示しています。

プロトコル

1。 QD可溶化

これは、CdTeのために適切な方法です。類似した方法はそのような有するInP / ZnSを²⁰のCdSe / ZnSを²¹としての量子ドットの他のタイプで使用することができます。

1. 15μMの（最初の励起子のピーク時には光学密度= 2.5）でトルエン中膜CdTe量子ドットの溶液を調製します。
2. ガラスバイアルには、この株式の200μLを転送します。プラスチックを使用しないでください！
3. 800μLトルエン、200 mMホウ酸緩衝液（pH 9）、11.5 Mメルカプトプロピオン酸（MPA）の2μLの1 mLを加える。
4. バイアルをキャップ30〜60秒間激しく、それを振る。
5. 水溶液と有機溶媒相は、自発的に分離されます。水相は、量子ドットの色になります。トルエン層を避けるために、それを削除し、それを破棄します。その後きれいなバイアルに水相を転送します。
6. 500μL、10000、分子量カットオフの遠心フィルターを用いて4回洗浄/フィルタリングすることにより可溶化された量子ドットを浄化する。フィルタがなければなりません13分3000 xgでスピンした。少なくとも最後の2回洗浄するため、所望の最終バッファーで洗浄する。
7. 最終洗浄後、4℃で、所望のpHと店舗で50 mMホウ酸緩衝液で洗浄した量子ドットを中断彼らは1〜2週間は安定になります。
8. 公開され、式²²に基づいて濃度を推定するための吸光度および発光スペクトルを測定します。

代表的な結果：図1は、UVランプの照明の下で膜CdTe量子ドットの画像を示しており、水可溶化前後の発光スペクトルは、キャップの交換からごくわずかの変化を示す。サイズの値は、電子顕微鏡で測定したコアの直径です。

2。抗生物質にQDコンジュゲート

プロトコルのこの部分は、ほとんどの商用量子ドット、金属粒子、さらに¹⁹を含む任意の負に帯電した水可溶化ナノ粒子にも適用可能である。

1. すべての分子が動作するようEITHERの負に帯電した可溶化された量子ドットに自己組み立て、またはそのような第一級アミンとして、結合させることができる反応性基を持っています。この例では、正に荷電共役試薬を必要とせずに自己組み立てされたポリミキシンB（PMB）を使用しています。 60μMでH ₂ OでPMBを溶かす。 （選択された抗生物質がH ₂ Oに溶解しない場合は、0.1から1 mMの濃度でDMSOまたはエタノールに溶解）。これは、10x溶液（H ₂ O）、または100倍溶液（溶媒中）になります。
2. あなたは細菌の毒性実験のために必要になりますどのくらいのQDソリューションを計算します。 4重にウェルあたり0.3 mLを96ウェルプレートの場合は、200 nMの結合体の0.5mLが必要になります。 50mMのホウ酸緩衝液に1μM量子ドットの100μLを含む二つのチューブを準備します。
3. 第一級アミンに結合する場合は、1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル] H _{2 O}のカルボジイミド塩酸塩（EDC）の19 mg / mLの（100 mM）の溶液を調製溶液中でEDCは安定していません、すぐに使用し、残りを捨てる。
4. 10倍の抗生物質溶液（H ₂ O）または共役チューブに100倍溶液（溶媒中）の5μLの50μLを追加します。 PMBの場合：30:1のモル比でCdTeの接合、60μMのPMBの50μLを追加します。 H ₂ OまたはQDのみ制御管に溶媒を追加します。
5. 必要に応じて、コンジュゲートチューブにEDCストック溶液の1μLを追加します。
6. 適切な緩衝液（; Trisなどのアミン含有しないバッファを、彼らはEDCを阻害するとして、ホウ酸緩衝液またはPBS）で0.5mLの共役ボリュームを起動します。
7. 1時間nutatorやロッカーの上にアルミニウム箔と場所で光からシールドチューブ。凝集が発生した場合は、抗生物質の低濃度との結合を繰り返します。粒子が凝集しないまで濃度を上に滴定する。
8. 適切なフィルタを通過させることによって複合体を洗浄します。万の分子量カットオフは、ほとんどの抗生物質ではなく、タンパク質または抗体で動作します。
9. 吸光度または蛍光分光法、ゲル電気泳動、またはフーリエ変換赤外分光（FTIR）：分子に応じて、異なる方法がQD当たりの抗生物質の分子数を推定するために使用することができます。

代表的な結果は、この例では、PMBの接合は、量子ドットの発光スペクトルの変化によって特徴付けられる。 図2は、PMB添加したCdTe量子ドットのスペクトルを示す。

3。 96ウェルスクリーンのために細菌の準備、抗生物質のIC ₅₀の決定

これは、適切な媒体¹⁸で成長し、ほとんどすべての菌株に適用可能である。録音を続行する必要がある時間の正確な長さは細菌の成長率に依存します。この例では、溶原性培養液（LB）培地中で培養した大腸菌を使用しています 。

1. 適切なQD共役濃度を選択するためには、知っておくことが大切です抗生物質のIC ₅₀単独で量子ドットは有毒である場合、結合させることとします。これは2日接合実験前に開始する必要があります。夕方に、新鮮なコロニーからシード細菌の増殖培地10mLを、適切な滅菌とバイオ技術を使用します。
2. 次の日、1〜2時間の実験の前に、増殖培地のほぼ最大量との明確な底96ウェルプレートのウェルの各々を記入してください。細菌培養の1から50μL（濃度が特定の株の成長にどのくらいの速に依存するであろうとあなたのラボで校正する必要があります）で各ウェルにマルチチャンネルピペット、シードを使用します。
3. プレートリーダーの上にプレートを入れて決定される波長（通常は600 nm）で2時間10分ごとに読み込みするように設定します。細菌があまりにも速く密度が高すぎる成長しないように板を監視します。
4. 細胞はすべてOD = 0.1から0.15に達すると、プレートリーダーからプレートを削除して、録音を停止します。
5. 一人で薬を追加して、一人で量子少なくとも連で異なる濃度。 "暗い"コントロールと点灯するの半分として、板の片面を使用しています。推奨レイアウトは、 図3に示されている。濃度は1非常に小さな細菌を抑制する濃度、およびそれらのすべてを殺すいずれかが含まれてするのに十分広い範囲に及ぶべきである。
6. アルミ箔でプレートの "暗い"側面を保護する。所望の波長でランプに反対側を公開します。我々は、2.4 mWのLED（ 図4）と30〜60分間照射から作られたカスタム96ウェル、440 nmのランプを使用しています。明確な底を持つ黒のプレートは、迷光から未露光の細菌を保護に役立ちます。空の列も公開と非曝露の側面の間で使用される可能性があります。
7. 露光した後、プレートリーダー、記録OD 600が成長率に応じて5から12時間、10分ごとにプレートを置く。温度が<32°C、可能であれば文化の乾燥を避けるために保管してください。
8. 成長曲線をプロットします。選択した時点で対ログ[濃度]とヒルの式を用いて抗生物質のIC _50を決定_します 。

Hはヒル係数である、Y _maxは、成長（理想的には台地上の）最高点であり、y _minは高原にも理想的には、ゼロ点である。それだけでは量子ドットは、使用濃度で細胞に非常に毒性を示すことはほとんどありませんので、値が決定されることはありません。

代表的な結果。記録期間の終了時に、明確な井戸が完了した細胞死を示しますと、細胞密度の勾配は、薬剤の濃度の増加に沿って表示されます。細菌はS字型成長曲線を（ 図5）を示すべきである。最大の高原の場所は緊張する株から大きく異なり、また、温度に依存します。与えられた時点では、することができます代表として選ば ​​れ、値がとログ[抗生物質] IC _50（ 図5 B）を与えるためにプロットされます。 QD毒性を評価するために、生存とログ[QD]もプロットし、それだけでは量子ドットとの有意な殺菌を達成する（ 図5 C）はまれである可能性があります。

4。抗生物質/量子ドットと96ウェルスクリーンのために細菌の調製

1. 正しい滅菌とバイオ技術を使用して、適切な富栄養培地に新鮮なコロニーから実験、文化の種10mLの、前日。それは非常に不安定でない限り、QD-抗生物質複合体は、この日に準備する必要があります。
2. 実験の前に1-2時間は、増殖培地のほぼ最大量との明確な底96ウェルプレートのウェルの各々を記入してください。細菌培養の1から50μLを各ウェルにマルチチャンネルピペット、シードを使用します。
3. プレートリーダーの上にプレートを入れて、パート3と同じ波長で2時間10分ごとに読み込みするように設定します。
4. 細胞はすべてOD = 0.1から0.15に達すると、プレートリーダーからプレートを削除して、録音を停止します。
5. 少なくとも四重の異なる濃度でQD結合体を追加します。 "暗い"コントロールと点灯するの半分として、板の片面を使用しています。推奨レイアウトは、 図6に示されている。細菌のみのコントロール·ストリップは、 常に文化の場合と同様の問題に含まれるべきである、温度などの成長条件に影響を与えます。単剤のストリップのみとのみQDのも、彼らが制御板は、以前に行わ一致していることを確認するために含まれるべきである。井戸の残りの部分は、適切な統計ができるようにするためにコンジュゲートに専念しています。
6. アルミ箔でプレートの "暗い"側面を保護する。所望の波長でランプに反対側を公開します。
7. 露光した後、プレートリーダー、記録OD 600 5月12日時間は10分ごとにプレートを置く。 <32°C、DRを避けるため、可能であれば温度を保つ文化のYingさん。

代表的な結果 。量子ドットと抗生物質の組み合わせは、単独で抗生物質よりも毒性が低いかもしれません。同様に有毒な、またはより多くの毒性。これは、成長曲線とIC ₅₀の測定値を用いて定量することができます。 図7は、その抗生物質と同等に有毒なだけで、より有毒である複合体の例コンジュゲートの例を示します。

5。平板計数

1. 段階希釈し、コロニーカウントに使用する治療を96ウェルプレートの1以上のウェルを選択してください。
2. PBSまたは生理食塩水（0.9％NaCl）を選択した細菌の各サンプルの希釈を行う。菌液20μLを移し、180μlの生理食塩水で希釈、ピペットチップ、ミックスを変更し、180μLの食塩水に希釈した菌液の20μLを転送します。 6回繰り返します。
3. 適切な各希釈し、プレートから10μLを取る固体培地プレート。それは物事を並べるが容易になりますように長方形の料理が好まれるものの1サンプルの全8濃度は、10センチメートルラウンドペトリ皿上に播種することができます。
4. それは15分間のベンチに乾かします。その後16時間のために細菌のための適切な温度でインキュベートする。
5. コロニーをカウントし、コロニー形成単位を計算する（CFU）によると（＃コロニーのx希釈倍率）/ボリュームメッキ= CFU / mLである。

図8は、例CFUプレートを示しています。

6。代表的な結果

図1 CdTeの量子ドット。 （）のCdTe量子ドットのエイトの製剤は、紫外線の杖（365 nm）と点灯。水可溶化前と後の5選択したサイズの（B）の吸光度と発光スペクトル。破線はトルエンのスペクトルで、実線は水である。

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図2。QD-PMBコンジュゲートのスペクトルとゲル分析。オレンジ色の発光CdTeの量子ドットは、この例を使用しました。量子ドットの他の種類の影響は、各実験のために評価する必要があります。 （A）一般的な吸光度（灰色線）とPMBの結合とPMB 160モル当量を加えた後の排出量（破線）の前に量子ドットの発光スペクトル（黒線）。 PMBの比とQDの発光強度（四角）とピーク波長の位置（三角形）の間（B）の関係。

図3は 、制御成長板のプレートレイアウトを提案した。 PMBとQD濃度の広い範囲が表されます。プレートの半分（青強調表示）が照射されると、同一の半 ​​分は光から保護されています。 ここをクリック拡大図を表示します。

図4均一プレート照射用のカスタム96-LEDランプ、外観を披露します。典型的なハンドヘルドUVランプを使用してもよいが、均一にプレート全体をカバーしています。

図5。制御成長板の例の結果。 （A）別の薬物濃度の代表的な細菌の増殖曲線は、0から細胞死を完了します。オープンシンボルが与えられた濃度を持つ唯一のPMBであり、固体のシンボルは照射せずに膜CdTe-PMBであり、半充填のシンボルは、照射による膜CdTe-PMBがあります。照射は、PMB-サンプルのみに影響を及ぼさなかった、これらの曲線は、わかりやすくするために省略されていたので。 QD比：すべてPMB-CdTeのコンジュゲートは30:1 PMBがあります。 （B）200分とログ[PMB]で、成長曲線の値のプロットとは、式にフィットします。 （1）。 CONTに光の影響のためにROLは、曲線は、光照射の30分の抗生物質を使用して行われます。 （C）200分対QD濃度で細菌の生存率は、CdTe量子ドットを用いた。いくつかの毒性は、IC ₅₀値を決定するための露光が、あまりにも少しで見られます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図6は、。共役テストプレートのレイアウトを提案した。プレートの青色でハイライト表示された半分は光にさらされるべきであり、強調表示が解除されている半分は保護されています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図7の例共役試験板の結果。 200分での成長曲線の値はPLでしたottedと式に適合します。 （1）。 （A）膜CdTe-PMB複合体は、単独でPMB以上増加した毒性を示しています。 （B）金ナノ粒子のAu-PMB複合体は、単独でPMB上には増加した毒性を示さない。

図8 CFUプレートの例。E. 96ウェルプレートに播種し、大腸菌を 30分間照射の有無にかかわらずQD-PMBで処理した。その後4時間32°Cでインキュベートした。各細菌サンプルの連続希釈液を食塩水で作られた、10μLの100 X 10 ⁷ X希釈液を寒天プレート上に播種した。プレートを37℃でインキュベートしたCとコロニーが16時間後に計数した。プレートは、指定されたように行に沿って希釈を示しています。列は、次のとおりです。（）0.06μMPMB + 2 nMの膜CdTe、（B）0.12μMPMB + 4nmの膜CdTe（C）0.2μMPMB + 6.7 nMの膜CdTe、（D） 0.06μMPMB + 2 nMで照射し、（E）0.12μMPMB + 4 nMのCdTeの照射、（F）0.2μMPMB + 6.7 nMのCdTeのイルラのCdTeのdiated。

ディスカッション

ナノ粒子は、新しい抗微生物剤の創出に有望なアプローチを表しています。成長曲線分析は、成長を阻害細胞から積極的に増殖する細胞を区別する細菌の細胞密度をモニターする方法です。プレートカウントと組み合わせる場合には、複合体の抗生物質の可能性を徹底的に分析が可能になります。 96ウェルフォーマットは、このような露光量として濃度の比較的高いスループットの変動やそ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
緩衝成分＃1ホウ酸塩	フィッシャー	ホウ酸-74から1
緩衝成分第2ホウ酸	Sigma-Aldrich社	四ホウ酸ナトリウムB9876
MPA	Sigma-Aldrich社	M5801
Vivaspin 500	GEヘルスケア	28から9322	利用可能なさまざまなMWCO
ガラスバイアル	フィッシャー	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich社	E6383
ポリミキシンB	Sigma-Aldrich社	P1004
細菌のグラムowth培地（LB）コンポーネント第1位	フィッシャー	NaClのS271
細菌の増殖培地（LB）コンポーネント第2位	BD	トリプトン211705
細菌の増殖培地（LB）コンポーネント第3位	BD	酵母エキス211929
露光用ランプ	カスタム
透明底96ウェルプレート	フィッシャー	07-200-567 07-200-730または
蛍光分光計	モレキュラーデバイス
吸光度プレートリーダー	モレキュラーデバイス
固体メディアのBactoAgar	Bioshop	AGR001.1
ペトリ皿のラウンド	フィッシャー	08-75-12
長方形のペトリ皿	フィッシャー	08から757-11A