Solubilisation et Bio-conjugaison de Quantum Dots et des tests de toxicité bactériennes par la courbe de croissance et le comte Plate

Résumé

Les nanoparticules telles que les points quantiques à semi-conducteurs (QDS) peut être utilisé pour créer des agents photo-activables pour les applications anti-microbiens ou anti-cancer. Cette technique montre comment l'eau solubiliser en tellurure de cadmium (CdTe) QDs, les conjuguer à un antibiotique, et d'effectuer un test d'inhibition bactérienne basée sur les courbes de croissance et numération sur plaque.

Résumé

Boîtes quantiques (QDS) sont des nanoparticules semi-conductrices fluorescentes dont la taille dépend de spectres d'émission pouvant être excités par un choix large de longueurs d'onde. QDs ont attiré beaucoup d'intérêt pour l'imagerie, le diagnostic et la thérapie en raison de leur brillante, la fluorescence stable ^{1,2 3,4,5.} BQs peut être conjugué à une variété de molécules bio-actives pour se lier à des bactéries et des cellules mammaliennes ^6.

Les points quantiques sont également largement étudiée comme agents cytotoxiques pour assassinat ciblé des bactéries. L'émergence de multiplier les souches bactériennes résistantes aux devient rapidement une crise de santé publique, en particulier dans le cas de germes à Gram négatif ^7. En raison de l'effet bien connu antimicrobienne de certains nanomatériaux, en particulier Ag, il ya des centaines d'études portant sur ​​la toxicité des nanoparticules à des bactéries ^8. Des études bactériennes ont été effectuées avec d'autres types de nanoparticules semi-conductrices ainsi, spécially TiO ₂ ^9,10-11, mais aussi de ZnO ¹² et autres, y compris CuO ^13. Quelques comparaisons de souches bactériennes ont été effectuées dans ces études, généralement comparant une souche à Gram négatif avec un Gram positif. Avec toutes ces particules, les mécanismes de toxicité sont attribués à l'oxydation: soit l'photogénération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par les particules ou le rejet direct d'ions métalliques qui peuvent causer la toxicité oxydative. Même avec ces matériaux, les résultats des différentes études varient considérablement. Dans certaines études, la souche d'essai à Gram positif est censément plus sensible que les ¹⁰ à Gram négatif, dans d'autres c'est le ^{14 en} regard. Ces études ont été étudiées en ^15.

Dans toutes les études de nanoparticules, la composition des particules, la taille, la chimie de surface, l'échantillon vieillissement / ventilation, et de longueur d'onde, la puissance et la durée d'exposition de lumière peuvent tous affecter les résultats de façon spectaculaire. En outre, SYNTHESIsous-produits s et les solvants doivent être considérées ^{16 17.} Techniques de criblage à haut débit sont nécessaires pour être en mesure de développer des agents efficaces de la nanomédecine nouvelles.

QDs CdTe ont effets anti-microbiens seuls ¹⁸ ou en combinaison avec des antibiotiques. Dans une étude précédente, nous avons montré que le couplage d'antibiotiques pour CdTe peut augmenter la toxicité pour les bactéries, mais de diminuer la toxicité pour les cellules de mammifères, en raison de la production a diminué d'espèces réactives de l'oxygène à partir des conjugués ^19. Bien qu'il soit peu probable que le cadmium composés contenant sera approuvé pour utilisation chez les humains, ces préparations peuvent être utilisées pour la désinfection des surfaces ou la stérilisation de l'eau.

Dans ce protocole, nous donnons une approche simple pour solubiliser les points quantiques de CdTe avec de l'acide mercaptopropionique (MPA). Les points quantiques sont prêts à utiliser moins d'une heure. Nous démontrons ensuite le couplage à un agent antimicrobien.

La deuxième partie du protocoledémontre un test d'inhibition de 96 puits en utilisant des bactéries les boîtes quantiques conjugués et non conjugués. La densité optique est lue pendant plusieurs heures, permettant aux effets de l'ajout QD et exposition à la lumière d'être évalués immédiatement ainsi que, après une période de récupération. Nous présentons aussi un comptage des colonies pour quantifier la survie des bactéries.

Protocole

1. Solubilisation QD

Il s'agit d'une méthode appropriée pour le CdTe. Des méthodes similaires peuvent être utilisés avec d'autres types de boîtes quantiques tels que InP / ZnS ²⁰ et CdSe / ZnS ^21.

1. Préparer une solution de BQs CdTe dans le toluène à 15 um (densité optique = 2,5 au sommet exciton en premier).
2. Transférer 200 ul de ce stock dans un flacon en verre. Ne pas utiliser de plastique!
3. Ajouter 800 ul du toluène, 1 mL de tampon de 200 mM de borate (pH 9) et 2 ul de 11,5 M d'acide mercaptopropionique (MPA).
4. Boucher le flacon et agiter vigoureusement pendant 30-60 secondes.
5. Les phases aqueuses et solvants organiques se sépare spontanément. La phase aqueuse va devenir la couleur des points quantiques. Pour éviter la couche de toluène, le retirer et le jeter. Puis transférer la phase aqueuse dans un flacon propre.
6. Purifier les points quantiques solubilisées par lavage / filtrage quatre fois en utilisant un pl 500, 10000 filtre moléculaire centrifugeuse poids de coupure. Les filtres doivent êtrefilé à 3000 xg pendant 13 minutes. Pour au moins les deux dernières lavages, se laver avec le tampon final désiré.
7. Après le lavage final, de suspendre les boîtes quantiques lavées dans 50 mM tampon borate à pH désiré et conserver à 4 ° C. Ils seront stables pendant 1-2 semaines.
8. Mesurer des spectres d'absorption et d'émission pour estimer la concentration basée sur des formules publiées ^22.

Les résultats représentatifs: Figure 1 montre une image de points quantiques de CdTe sous un éclairage lampe UV, et les spectres d'émission avant et après solubilisation de l'eau, montrant un changement négligeable de l'échange bouchon. Les valeurs de taille sont le diamètre du noyau mesurée par microscopie électronique.

2. Conjugaison QD antibiotiques

Cette partie du protocole est applicable à tout chargé négativement l'eau solubilisée nanoparticules, y compris les points quantiques les plus commerciaux, des particules métalliques, et plus ^19.

1. Toute molécule qui travaillera either auto-assemble les points quantiques de charge négative solubilisées, ou qui a un groupe réactif qui peut être conjugué, tel qu'une amine primaire. Dans cet exemple, nous utilisons la polymyxine B (PMB), qui est chargée positivement et s'auto-assemble sans avoir besoin de réactifs de conjugaison. Dissoudre le PMB en H ₂ O à 60 uM. (Si l'antibiotique choisi n'est pas soluble dans l'H ₂ O, dissoudre dans du DMSO ou de l'éthanol à une concentration de 0,1-1 mM). Ce sera une solution 10x (en H ₂ O) ou une solution 100x (dans un solvant).
2. Calculer la quantité de solution QD vous aurez besoin pour les expériences de toxicité bactériennes. Pour une plaque de 96 puits avec 0,3 ml par puits dans quadruplicates, 0,5 mL de 200 nM conjugué est nécessaire. Préparer deux tubes contenant 100 pi de 1 uM points quantiques dans 50 mM tampon borate.
3. Si le couplage à une amine primaire, de préparer un mg 19 / ml (100 mM) solution de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC) dans H ₂ O. EDC en solution n'est pas stable; Utiliser immédiatement et jeter le reste.
4. Ajouter 50 ul de la solution 10x antibiotiques (en H ₂ O) ou 5 ul de la solution 100x (dans un solvant) sur le tube de conjugué. Pour PMB: Conjugaison CdTe à un rapport molaire de 30:1, ajouter 50 ul de 60 uM PMB. Ajouter H ₂ O ou de solvant pour le tube de contrôle ne QD.
5. Si nécessaire, ajoutez 1 ul de la solution mère d'EDC sur le tube de conjugué.
6. Apportez le volume conjugué à 0,5 mL avec le tampon approprié (tampon borate ou de PBS; aucun tampons contenant des amines comme Tris, car ils inhibent EDC).
7. Tubes protéger de la lumière avec une feuille d'aluminium, et le lieu ou sur un nutator rocker pendant 1 heure. Si l'agrégation se produit, répétez la conjugaison avec des concentrations plus faibles d'antibiotiques. Titrer vers le haut jusqu'à ce que la concentration des particules ne s'agrègent pas.
8. Laver les conjugués en passant par un filtre approprié. 10000 coupure de poids moléculaire fonctionne pour la plupart des antibiotiques, mais pas pour des protéines ou des anticorps.
9. En fonction de la molécule, différentes méthodes peuvent être utilisées pour estimer le nombre de molécules antibiotiques par QD: la spectroscopie d'absorption ou de fluorescence, électrophorèse sur gel, ou spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR).

Les résultats représentatifs. Dans cet exemple, la conjugaison PMB est caractérisée par des changements dans le spectre d'émission QD. La figure 2 montre les spectres de BQs CdTe avec plus PMB.

3. Préparation de bactéries pour l'écran de 96 puits; Détermination de la antibiotiques IC ₅₀

Ceci est applicable à presque toute souche bactérienne cultivée dans le milieu approprié ^18. La longueur exacte de temps les enregistrements devraient continuer dépend du taux de croissance bactérienne. Dans notre exemple, nous utilisons Escherichia coli cultivées dans un bouillon de lysogénie (LB).

1. Afin de choisir les concentrations appropriées conjugués QD, il est important de connaître laIC ₅₀ de l'antibiotique à être conjugués et si les points quantiques à eux seuls sont toxiques. Cela devrait être commencé 2 jours avant l'expérience de conjugaison. Dans la soirée, des semences de 10 mL de milieu de croissance bactérienne à partir d'une colonie fraîche, en utilisant une technique stérile correcte et la biosécurité.
2. Le lendemain, 1-2 heures avant l'expérience, de remplir chacun des puits d'une claire-96 puits à fond plat avec une quantité presque-maximale de milieu de croissance. En utilisant une pipette multicanaux, des semences chaque puits avec 1-50 ul de la culture bactérienne (la concentration dépendra de la rapidité de la souche particulière se développe et devra être calibré par votre laboratoire).
3. Mettre la plaque sur le lecteur de plaque et le mettre à lire toutes les 10 minutes pendant 2 heures à une longueur d'onde déterminée (généralement 600 nm). Surveiller la plaque de sorte que les bactéries ne se développent pas trop dense trop vite.
4. Lorsque les cellules atteignent tous les OD = 0,1 à 0,15, retirer la plaque du lecteur de plaque et arrêter l'enregistrement.
5. Ajouter médicament seul et seul à points quantiquesdes concentrations différentes dans au moins triple. Utilisation d'un côté de la plaque en tant que "noir" contrôle et une moitié d'être éclairé. Un plan suggéré est donnée à la figure 3. Les concentrations doivent couvrir un éventail suffisamment large pour inclure une concentration qui inhibe les bactéries très peu, et celui qui les tue tous.
6. Protégez le côté "obscur" de la plaque avec une feuille d'aluminium. Exposer l'autre côté à une lampe à la longueur d'onde désirée. Nous utilisons une coutume de 96 puits, 440-nm lampe fabriqué à partir de 2,4 mW LED (Figure 4) et irradient pendant 30-60 min. Les plaques noires avec des fonds clairs aider à protéger les bactéries non exposées de la lumière parasite. Une colonne vide peut également être utilisé entre les parties exposées et non-exposés.
7. Après exposition à la lumière, mettre la plaque dans le lecteur de plaque et l'enregistrement DO 600 toutes les 10 minutes pour 5-12 heures selon le taux de croissance. Maintenir la température <32 ° C si possible pour éviter le dessèchement des cultures.
8. Tracer des courbes de croissanceà un moment choisi en fonction de log [concentration] et de déterminer l'IC ₅₀ de l'antibiotique en utilisant l'équation de Hill:

où H est le coefficient de Hill, y _max est le point culminant de la croissance (idéalement sur ​​un plateau), et y _min est le point zéro, idéalement sur ​​un plateau. Il est peu probable que les points quantiques à eux seuls montrent une toxicité beaucoup à des cellules aux concentrations utilisées, de sorte qu'une valeur ne sera pas déterminé.

Des résultats représentatifs. À la fin de la période d'enregistrement, les puits clairs indiquent la mort cellulaire complète, et un gradient de densité cellulaire doit apparaître le long des concentrations croissantes de la drogue. Les bactéries doivent montrer les courbes de croissance en forme de S (Figure 5); l'emplacement du plateau maximum varie grandement d'une souche à autre et dépend également de la température. Un point de temps donné peut êtrechoisi comme représentant et les valeurs représentées vs Connexion [antibiotiques] pour donner le IC ₅₀ (figure 5 B). Pour évaluer la toxicité QD, la survie vs Connexion [QD] peut également être tracées, mais la réalisation significative bactéricide avec QDs seul est rare (figure 5 C).

4. Préparation de bactéries pour l'écran de 96 puits avec des antibiotiques ou points quantiques

1. La veille de l'expérience, 10 ml de graines de la culture à partir d'une colonie fraîche dans le milieu approprié riche, en utilisant une technique stérile correcte et la biosécurité. Le conjugué QD-antibiotique doit être préparé à ce jour, à moins qu'il est très instable.
2. 1-2 heures avant l'essai, remplir chacun des puits d'une claire-bas plaque à 96 puits avec une quantité pratiquement-maximale d'un milieu de croissance. En utilisant une pipette multicanaux, des semences chaque puits avec 1-50 pl de culture bactérienne.
3. Mettre la plaque sur le lecteur de plaque et le mettre à lire toutes les 10 minutes pendant 2 heures à la même longueur d'onde dans la partie 3.
4. Lorsque les cellules atteignent tous les OD = 0,1 à 0,15, retirer la plaque du lecteur de plaque et arrêter l'enregistrement.
5. Ajouter conjugués QD à différentes concentrations dans au moins quatre exemplaires. Utilisation d'un côté de la plaque en tant que "noir" contrôle et une moitié d'être éclairé. Un plan suggéré est donnée à la figure 6. Une bande de contrôle de bactéries ne devraient toujours être inclus dans les problèmes de cas avec la culture, de la température, etc influer sur les conditions de croissance. Une seule bande de seul médicament et QD ne devrait également être inclus afin de s'assurer qu'elles correspondent à la plaque de contrôle fait précédemment. Le reste des puits sont consacrés à conjugués afin de permettre aux bonnes statistiques.
6. Protégez le côté "obscur" de la plaque avec une feuille d'aluminium. Exposer l'autre côté à une lampe à la longueur d'onde désirée.
7. Après exposition à la lumière, mettre la plaque dans le lecteur de plaque et l'enregistrement DO 600 toutes les 10 minutes pour 5-12 heures. Maintenir la température <32 ° C si possible pour éviter drying des cultures.

Des résultats représentatifs. La combinaison de boîtes quantiques et d'antibiotiques peut être moins toxique que le seul antibiotique; également toxique, ou plus toxique. Ceci peut être quantifié à l'aide des courbes de croissance et IC ₅₀ mesures. La figure 7 montre un exemple de conjugués qui tout aussi toxique que seuls antibiotiques, et un exemple de conjugués qui sont plus toxiques.

5. Numération sur plaque

1. Choisissez un ou plusieurs puits de la zone traitée plaque de 96 puits qui seront utilisés pour des dilutions en série et le comptage de colonies.
2. Faire une dilution en série de chacun des échantillons sélectionnés bactériennes avec une solution de PBS ou de solution saline (NaCl 0,9%). Transférer 20 pl de la solution bactérienne et la diluer avec 180 ul de solution saline, changer la pointe de la pipette, mélanger et transférer 20 ul de solution bactérienne diluée à 180 ul de solution saline. Répétez 6 fois.
3. Prenez 10 uL de chaque dilution et la plaque à une échelle appropriée solide plaque de support. Tous les 8 concentrations d'un échantillon peut être étalées sur un 10 cm de Petri plat rond, bien plats rectangulaires sont préférés car il est plus facile d'aligner les choses.
4. Laissez sécher sur le banc pendant 15 min. puis incuber à la température appropriée pour vos bactéries pendant 16 heures.
5. Compter les colonies et calculer des unités formant colonie (UFC) en fonction de (nombre de colonies x facteur de dilution) / volume plaqué = CFU / ml.

La figure 8 montre une plaque UFC par exemple.

6. Les résultats représentatifs

Figure 1. QDs CdTe. (A) Huit préparations de points quantiques de CdTe illuminé avec une baguette UV (365 nm). (B) des spectres d'absorption et d'émission de cinq tailles sélectionnées avant et après l'eau-de solubilisation. Les lignes en pointillés sont des spectres dans le toluène, les lignes pleines sont dans l'eau.

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Figure 2. L'analyse spectrale et le gel des QD-PMB conjugués. QDs CdTe Orange-électroluminescentes ont été utilisés pour cet exemple, les effets sur d'autres types de boîtes quantiques devront être évalués pour chaque expérience. (A) d'absorbance typique (ligne grise) et les spectres d'émission (ligne noire) des boîtes quantiques avant la conjugaison de PMB et l'émission (ligne pointillée) après l'addition de 160 équivalents molaires de PMB. (B) Relation entre le rapport de PMB et l'intensité des émissions QD (carrés) et le pic de longueur d'onde de localisation (triangles).

Figure 3. Suggérée disposition de la plaque pour plaque de croissance de contrôle. Une large gamme de concentrations de PMB et QD est représenté. Une moitié de la plaque est irradiée (surlignée en bleu), et une moitié identique est protégé de la lumière. Cliquez icipour agrandir la figure.

Figure 4. Personnalisée 96-lampe LED pour l'irradiation plaque uniforme, montrant l'aspect hors et sous tension. Un type à main lampe UV peut également être utilisé, mais ne couvrira pas la totalité de la plaque uniformément.

Figure 5. Exemples de résultats pour la plaque de croissance de contrôle. (A) représentant les courbes de croissance bactérienne avec différentes concentrations en médicament, de 0 à compléter la mort cellulaire. Les symboles ouverts sont PMB seulement avec des concentrations donnée, les symboles pleins sont CdTe-PMB sans irradiation, et les symboles sont remplis de demi-CdTe-PMB avec l'irradiation. L'irradiation n'a eu aucun effet sur les échantillons PMB-seulement, de sorte que ces courbes ont été omis pour plus de clarté. Tous les conjugués PMB-CdTe sont 30:1 PMB: ratios QD. (B) Parcelles de valeurs de la courbe de croissance à 200 min vs Connexion [PMB] et s'inscrit à l'équation. (1). Pour control pour les effets de la lumière, une courbe se fait avec des antibiotiques seulement avec 30 min d'exposition de la lumière. (C) la survie bactérienne à 200 min vs concentration QD, en utilisant les points quantiques de CdTe. Certains toxicité est observée avec exposition à la lumière, mais trop peu pour déterminer une valeur IC _50. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6. Disposition suggérée pour plaque d'essai conjugué. La moitié bleu en surbrillance de la plaque doit être exposée à la lumière, et la moitié unhighlighted est protégé. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7. Exemple de résultats pour plaque d'essai conjugué. Valeurs de la courbe de croissance à 200 min étaient plotted et en forme à l'équation. (1). (A) CdTe-PMB conjugués présentent une augmentation de la toxicité sur PMB seul. (B) or nanoparticules Au-PMB conjugués ne montrent aucune augmentation de la toxicité sur PMB seul.

Figure 8. Exemple d'une plaque UFC. E. coli ensemencées dans une plaque de 96 puits a été traitée avec QD-PMB avec ou sans irradiation pendant 30 min. ensuite incubées à 32 ° C pendant 4 heures. Des dilutions en série de chaque échantillon bactérien ont été faites avec une solution saline, et 10 uL de 100 X 10 X ⁷ dilutions ont été étalées sur des plaques de gélose. Les plaques ont été incubées à 37 ° C et les colonies ont été comptées après 16 heures. La plaque montre les dilutions le long des lignes comme indiqué; les colonnes sont les suivants: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe irradiés, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiés, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe irrairradiées.

Discussion

Les nanoparticules représentent une approche prometteuse pour la création de nouveaux agents anti-microbiens. Analyse de la courbe de croissance est un moyen de contrôler la densité des cellules bactériennes qui distingue les cellules activement croissantes de-croissance des cellules inhibées. Lorsque couplée avec un nombre de plaques, il permet une analyse approfondie du potentiel antibiotique d'un conjugué. Le format de 96 puits permet des variations relativement à haut débit de concentration et d'au...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Borate composant tampon n ° 1	Pêcheur	L'acide borique A-74-1
Borate composant tampon n ° 2	Sigma-Aldrich	B9876 tétraborate de sodium
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Divers MWCO disponibles
Flacons en verre	Pêcheur	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polymyxine B	Sigma-Aldrich	P1004
Gr bactérienneoissance milieu (LB) Composante n ° 1	Pêcheur	NaCl S271
Milieu de croissance bactérienne (LB) Composante n ° 2	BD	Tryptone 211705
Milieu de croissance bactérienne (LB) Composante n ° 3	BD	211929 Extrait de levure
Lampe pour exposition à la lumière	Coutume
Clear-fond plaques à 96 puits	Pêcheur	07-200-567 ou 07-200-730
Spectromètre à fluorescence	Molecular Devices
Lecteur de plaque d'absorbance	Molecular Devices
BactoAgar pour les milieux solides	Bioshop	AGR001.1
Des boîtes de Pétri autour	Pêcheur	08-75-12
Des boîtes de Pétri rectangulaires	Pêcheur	08-757-11A