Solubilização e Bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e Contagem

Resumo

As nanopartículas, tais como pontos quânticos de semicondutores (QDs) pode ser usado para criar agentes fotoactiváveis ​​para aplicações anti-microbianos ou anti-cancro. Esta técnica mostra como a água-solubilizar telureto de cádmio (CdTe) QDs, conjugá-los a um antibiótico, e realizar um ensaio de inibição bacteriana baseada em curvas de crescimento e contagem de placa.

Resumo

Os pontos quânticos (QDs) são nanopartículas de semicondutores fluorescentes com tamanho dependente de espectros de emissão que podem ser excitados por uma ampla gama de comprimentos de onda. QDs têm atraído muito interesse para a imagem, diagnóstico e terapêutica devido a sua fluorescência brilhante e estável ^{1,2 3,4,5.} QDs podem ser conjugados com uma variedade de moléculas bio-activas para a ligação a bactérias e células de mamíferos ^6.

QDs também estão sendo amplamente investigada como agentes citotóxicos para o assassinato seletivo de bactérias. O surgimento de multiplicar-estirpes bacterianas resistentes torna-se rapidamente uma crise de saúde pública, particularmente no caso de agentes patogénicos Gram negativos ^7. Por causa do efeito bem conhecido antimicrobiana de nanomateriais certos, especialmente de Ag, existem centenas de estudos que examinam a toxicidade das nanopartículas de bactérias ^8. Estudos bacterianas foram realizados com outros tipos de nanopartículas de semicondutores, bem como, especially TiO ₂ ^9,10-11, mas também ZnO ¹² e outros, incluindo CuO ^13. Alguns comparações de estirpes bacterianas foram realizados nestes estudos, geralmente comparando uma estirpe de bactérias Gram negativas com um positivo de Gram. Com todas essas partículas, mecanismos de toxicidade são atribuídos a oxidação: ou fotogeração o de espécies reactivas de oxigénio (ROS) pelas partículas ou a libertação directa de iões metálicos que podem causar toxicidade oxidativo. Mesmo com esses materiais, resultados de diferentes estudos variam muito. Em alguns estudos a cepa teste do Gram positivo é declaradamente mais sensível do que os ¹⁰ Gram negativa, em outros, é o ¹⁴ oposto. Estes estudos têm sido bem revisada ^15.

Em todos os estudos de nanopartículas, a composição de partículas, o tamanho, a química de superfície, a amostra de envelhecimento / avaria, eo comprimento de onda, a potência ea duração da exposição à luz podem todos afectar dramaticamente os resultados. Além disso, sintetizadosubprodutos s e solventes deve ser considerado ^{16 17.} Técnicas de rastreio de alto rendimento são necessários para ser capaz de desenvolver agentes eficazes de nanomedicina novos.

QDs CdTe têm efeitos anti-microbianos por si só ¹⁸ ou em combinação com antibióticos. Em um estudo anterior, mostramos que o acoplamento de antibióticos para CdTe pode aumentar a toxicidade para as bactérias, mas reduzir a toxicidade para células de mamíferos, devido à diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio a partir das ¹⁹ conjugados. Embora seja improvável que o cádmio contendo-os compostos irão ser aprovado para utilização em seres humanos, tais preparações podem ser utilizadas para a desinfecção de superfícies ou de esterilização da água.

Neste protocolo, damos uma abordagem direta para solubilização QDs CdTe com ácido mercaptopropiónico (MPA). Os QDs estão prontos para uso dentro de uma hora. Nós, então, demonstrar o acoplamento de um agente antimicrobiano.

A segunda parte do protocolodemonstra um ensaio de inibição de 96 poços bacteriana utilizando os QDs conjugados e não conjugada. A densidade óptica é lida durante muitas horas, permitindo que os efeitos da adição QD e exposição à luz a ser avaliada, bem como imediatamente após um período de recuperação. Nós também ilustram uma contagem da colónia para a quantificação de sobrevivência bacteriana.

Protocolo

1. Solubilização QD

Este é um método apropriado para CdTe. Métodos semelhantes podem ser utilizados com outros tipos de QDs tais como InP / ZnS ²⁰ e CdSe / ZnS ^21.

1. Prepara-se uma solução de QDs CdTe em tolueno a 15 mM (densidade óptica = 2,5 no pico exciton primeiro).
2. Transferir 200 uL deste estoque para um frasco de vidro. Não utilize plástico!
3. Adicionar 800 uL de tolueno, 1 mL de tampão de borato 200 mM (pH 9) e 2 uL de 11,5 M de ácido mercaptopropiónico (MPA).
4. Tampe o frasco e agitar vigorosamente durante 30-60 segundos.
5. As fases aquosas e orgânicas-solvente irá separar-se espontaneamente. A fase aquosa irá tornar-se a cor das QDs. Para evitar a camada de tolueno, removê-la e descartá-lo. Em seguida, transferir a fase aquosa para um frasco limpo.
6. Purifica-se os QDs solubilizados por lavagem / filtragem quatro vezes usando um uL 500, 10000 de peso molecular de filtro de centrifugação de corte. Os filtros devem sercentrifugada a 3000 xg durante 13 minutos. Para pelo menos, as duas últimas lavagens, lava-se com o tampão final desejado.
7. Após a lavagem final, suspender as QDs lavadas em tampão de borato 50 mM ao pH desejado e armazenar a 4 ° C. Eles são estáveis ​​durante 1-2 semanas.
8. Medir a absorvância espectros de emissão e estimar a concentração de base em fórmulas publicados ^22.

Os resultados representativos: Figura 1 mostra uma imagem de QDs CdTe sob iluminação lâmpada de UV, e espectros de emissão antes e após solubilização água, mostrando a mudança insignificante da troca da tampa. Os valores de tamanho são o diâmetro do núcleo medido por microscopia electrónica.

2. Conjugação QD a antibióticos

Esta parte do protocolo é aplicável a qualquer carregada negativamente nanopartícula-água solubilizada, incluindo QDs mais comerciais, partículas de metal, e mais ^19.

1. Qualquer molécula que irá trabalhar either de auto-montagem para os QDs negativamente carregadas solubilizados, ou que tem um grupo reactivo que pode ser conjugado, tal como uma amina primária. Neste exemplo, estamos a utilizar polimixina B (PMB), que está carregada positivamente e de auto-montagem sem necessidade de reagentes de conjugação. Dissolve-se o PMB _em H2O a 60 mM. (Se o antibiótico escolhido não é solúvel _em H2O, dissolver em DMSO ou etanol a uma concentração de 0,1-1 mM). Esta será uma solução 10x _(em H2O) ou uma solução de 100x (em solvente).
2. Calcule quanto solução QD você vai precisar para os experimentos de toxicidade bacterianas. Para uma placa de 96 poços com 0,3 mL por poço em quadruplica, 0,5 mL de 200 nM conjugado é necessário. Preparar dois tubos contendo 100 L de 1 mícron pontos quânticos em 50 mM tampão borato.
3. Se o acoplamento com uma amina primária, preparar um mg 19 / mL (100 mM) de solução de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida (EDC) em H ₂ O. EDC em solução não é estável; Usar imediatamente e jogar o resto fora.
4. Adicionar 50 ul de solução 10x antibiótico _(em H2O) ou 5 uL da solução de 100x (em solvente) para o tubo de conjugado. Para PMB: a conjugação CdTe na proporção molar de 30:1, adicionar 50 uL de 60 mM PMB. Adicionar _H2O ou solvente para o tubo de controlo QD só.
5. Se necessário, adicionar 1 mL da solução-mãe de EDC para o tubo de conjugado.
6. Traga o volume conjugado a 0,5 ml com o tampão apropriado (tampão borato ou PBS; nenhum buffers contendo amina, tais como Tris, uma vez que irá inibir a EDC).
7. Tubos de protetor de luz com papel alumínio e coloque em um nutator ou roqueiro durante 1 hora. Se a agregação ocorre, repetir a conjugação com menores concentrações de antibiótico. Titular para cima de concentração até que as partículas não agregada.
8. Lavar os conjugados por passagem através de um filtro apropriado. 10.000 cutoff de peso molecular funciona para a maioria dos antibióticos, mas não para as proteínas ou anticorpos.
9. Dependendo da molécula, diferentes métodos podem ser utilizados para estimar o número de moléculas de antibióticos por QD: absorvância ou espectroscopia de fluorescência, electroforese em gel, ou de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR).

Os resultados representativos. Neste exemplo, a conjugação PMB é caracterizada por alterações no espectro de emissão QD. A Figura 2 mostra os espectros de QDs CdTe com adição PMB.

3. Preparação de bactérias para a tela de 96 poços; Determinação da IC antibiótico ₅₀

Isto é aplicável a quase qualquer estirpe bacteriana crescido no meio adequado ^18. O comprimento exacto do tempo as gravações deve continuar depende da taxa de crescimento bacteriano. No nosso exemplo, usamos Escherichia coli cultivadas em caldo lisogenia (LB) médio.

1. A fim de escolher os adequadas concentrações de conjugado QD, é importante conhecer oIC ₅₀ do antibiótico a ser conjugada e se os QDs sozinhos são tóxicos. Isto deve ser iniciado 2 dias antes da experiência conjugação. À noite, mL semente 10 de meio de crescimento bacteriano a partir de uma colônia fresca, usando técnica estéril e biossegurança correta.
2. No dia seguinte, 1-2 horas antes da experiência, encher cada um dos poços de uma clara de fundo placa de 96 poços com uma quantidade quase-máxima de meio de crescimento. Usando uma pipeta de canais múltiplos de sementes, cada poço com 1-50 uL de cultura bacteriana (a concentração irá depender da rapidez com que o estirpe particular cresce e terá de ser calibrado pelo seu laboratório).
3. Colocar a placa sobre o leitor de placas e ajustá-lo para ler a cada 10 minutos durante 2 horas a um comprimento de onda determinado (normalmente 600 nm). Monitorar a placa para que as bactérias não crescem muito densa muito rapidamente.
4. Quando as células atingem todos os OD = 0,1-0,15, retire a placa do leitor de placa e parar a gravação.
5. Adicionar droga sozinho e sozinho em QDsconcentrações diferentes em pelo menos triplicados. Use um lado da placa como um controlo "escuro" e uma meia para ser iluminada. Um esquema sugerido é dado na Figura 3. As concentrações devem abranger uma ampla gama suficiente para incluir uma concentração que inibe as bactérias muito pouco, e um que mata todos eles.
6. Proteja o lado "negro" da placa com papel alumínio. Expor o outro lado para uma lâmpada no comprimento de onda desejado. Usamos um costume de 96 poços, a lâmpada de 440 nm feita a partir de 2,4 mW LEDs (Figura 4) e irradiam para 30-60 min. As placas pretas com fundo claros ajudam a proteger as bactérias não expostas de luz difusa. Uma coluna vazia pode também ser usado entre os lados expostos e un exposto.
7. Após a exposição à luz, colocar a placa no leitor de placas e OD registo 600 a cada 10 minutos para 5-12 horas, dependendo da taxa de crescimento. Mantenha a temperatura <32 ° C, se possível, para evitar a secagem das culturas.
8. Traçar as curvas de crescimentonum ponto de tempo seleccionado vs log [concentração] e determinar o IC ₅₀ do antibiótico utilizando a equação de Hill:

em que H é o coeficiente de Hill, y _max é o ponto mais alto de crescimento (idealmente em um planalto), e y _min é o ponto de zero, também idealmente em um planalto. É improvável que QDs só por si, mostram a toxicidade muito para as células nas concentrações utilizadas, portanto, um valor não será determinado.

Os resultados representativos. No final do período de gravação, poços claros irá indicar a morte celular completa, e um gradiente de densidade de células deve aparecer ao longo concentrações crescentes da droga. As bactérias devem mostrar as curvas em forma de S de crescimento (Figura 5 A); a localização do patamar máximo irá variar muito de estirpe para estirpe e também depende da temperatura. Um ponto de tempo dado pode serescolhida como representante e os valores representados vs log [antibiótico] para dar o IC ₅₀ (Figura 5 B). Para avaliar a toxicidade QD, sobrevivência versus Log [QD] também pode ser traçado, mas alcançar a morte bacteriana significativa com QDs sozinho é rara (Figura 5 C).

4. Preparação de bactérias para tela de 96 poços com antibiótico / QDs

1. Um dia antes do experimento, 10 mL de sementes da cultura de uma colônia fresca para o meio adequado rico, usando técnica estéril e biossegurança correta. O conjugado QD-antibiótico deve ser preparada neste dia, a menos que seja altamente instável.
2. 1-2 horas antes da experiência, encher cada um dos poços de uma clara de fundo placa de 96 poços com uma quantidade quase-máxima de meio de crescimento. Usando uma pipeta de canais múltiplos de sementes, cada poço com 1-50 uL de cultura bacteriana.
3. Coloque o prato sobre o leitor de placas e configurá-lo para ler a cada 10 minutos durante 2 horas no mesmo comprimento de onda como na Parte 3.
4. Quando as células atingem todos os OD = 0,1-0,15, retire a placa do leitor de placa e parar a gravação.
5. Adicionar conjugados QD em diferentes concentrações em, pelo menos em quadruplicado. Use um lado da placa como um controlo "escuro" e uma meia para ser iluminada. Um esquema sugerido é dada na Figura 6. A faixa de controle de bactérias só deve ser sempre incluída em casos de problemas com a cultura, temperatura, etc afetar as condições de crescimento. A única faixa de droga apenas e só QD também devem ser incluídos para garantir que elas coincidam com a placa de controle feito anteriormente. O resto dos poços são dedicados a conjugados, a fim de permitir a boas estatísticas.
6. Proteja o lado "negro" da placa com papel alumínio. Expor o outro lado para uma lâmpada no comprimento de onda desejado.
7. Após a exposição à luz, colocar a placa no leitor de placas e OD recorde de 600 a cada 10 minutos para 5-12 horas. Mantenha a temperatura <32 ° C, se possível, evitar drying das culturas.

Resultados representativos. A combinação de QDs e antibiótico pode ser menos tóxico do que o antibiótico por si só; igualmente tóxicos; ou mais tóxico. Isto pode ser quantificada utilizando as curvas de crescimento e _de IC50 de medições. A Figura 7 mostra um exemplo de conjugados que igualmente tóxicos como antibiótico por si só, e um exemplo de conjugados que são mais tóxicos.

5. Contagem

1. Escolher um ou mais dos poços da placa de 96 poços tratada de modo a ser utilizados para diluições em série e contagem de colónias.
2. Fazer uma diluição em série de cada uma das amostras seleccionadas bacterianas com PBS ou solução salina (0,9% NaCl). Transferir 20 uL da solução bacteriana e diluir com 180 uL solução salina, alterar a ponta da pipeta mistura, e transferir 20 uL de solução bacteriana diluída para 180 uL solução salina. Repita 6 vezes.
3. Tome 10 uL de cada diluição e placa sobre um adequado placa de mídia sólido. Todos os 8 concentrações de uma amostra pode ser revestida sobre um prato 10 centímetros de Petri redondo, embora pratos rectangulares são preferidos porque é mais fácil para alinhar as coisas.
4. Deixar secar sobre a bancada durante 15 min. então incubar à temperatura apropriada para o seu bactérias durante 16 horas.
5. Contar as colónias e calcular unidades formadoras de colónias (CFU) de acordo com (# de colónias x factor de diluição) / volume chapeado = CFU / mL.

A Figura 8 mostra uma placa de CFU exemplo.

6. Os resultados representativos

Figura 1. QDs CdTe. (A) Oito preparações de QDs CdTe iluminada com uma varinha de UV (365 nm). (B) Espectro de absorção e emissão de cinco tamanhos selecionados antes e depois da água solubilização. As linhas tracejadas são espectros em tolueno, as linhas sólidas são em água.

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Figura 2. A análise espectral e gel de QD-PMB conjugados. QDs laranja emissores de CdTe foram utilizados para este exemplo, os efeitos sobre outros tipos de QDs terá de ser avaliados para cada experiência. (A) absorvância típica (cinza de linha) e espectros de emissão (linha preta) dos QDs antes de conjugação de PMB ea emissão (linha tracejada) após a adição de 160 equivalentes molares de PMB. (B) relação entre a razão do PMB ea intensidade da emissão QD (quadrados) e localização do pico de comprimento de onda (triângulos).

Figura 3. Sugerida layout da placa para placa de controle de crescimento. Uma ampla gama de concentrações de PMB e QD está representado. Uma metade da placa é irradiada (realçado azul), e uma meia idêntica é protegido da luz. Clique aquipara ver maior figura.

Figura 4. Lâmpada personalizado 96-LED para irradiação placa uniforme, mostrando aparência off e on. Uma lâmpada de mão típico UV pode também ser utilizado, mas não vai cobrir a totalidade da placa de modo uniforme.

Figura 5. Exemplos de resultados para o controle da placa de crescimento. (A) representativos curvas de crescimento de bactérias com diferentes concentrações da droga, de 0 a completar a morte celular. Os símbolos abertos são PMB apenas com concentrações dadas; os símbolos a cheio são CdTe-PMB sem irradiação; e os símbolos meia-cheias são CdTe-PMB com irradiação. A irradiação não teve nenhum efeito sobre as amostras PMB-somente, assim estas curvas foram omitidos para maior clareza. Todos os conjugados PMB-CdTe são 30:1 PMB: razões de QD. (B) Parcelas de valores da curva de crescimento em 200 min vs Log [PMB] e se encaixa com a equação. (1). Para control para os efeitos da luz, uma curva é feito com antibiótico apenas com 30 minutos de exposição à luz. (C) a sobrevivência bacteriana em 200 min vs concentração QD, usando QDs CdTe. Alguns toxicidade é visto com exposição à luz, mas muito pouco para determinar um _valor IC50. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6. Sugerida layout para placa de teste conjugado. A metade azul-destaque da placa deve ser exposto à luz, ea metade unhighlighted está protegida. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 7. Exemplo resultados para placa de teste do conjugado. Valores de crescimento curva em 200 min foram plotted e ajuste para a equação. (1). (A) CdTe-PMB conjugados mostram aumento de toxicidade sobre PMB sozinho. (B) de nanopartículas de ouro Au-PMB conjugados não mostram aumento da toxicidade sobre PMB sozinho.

Figura 8. Exemplo de uma placa de CFU. E. coli semeadas numa placa de 96 poços foi tratada com QD-PMB com ou sem irradiação durante 30 min. em seguida, incubadas a 32 ° C durante 4 horas. Diluições em série de cada amostra bacteriana foram feitas com solução salina, e 10 uL de 100 X a 10 ⁷ diluições X foram plaqueadas em placas de agar. As placas foram incubadas a 37 ° C e as colónias foram contadas após 16 horas. A placa mostra as diluições ao longo das linhas como indicado, as colunas são: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 PMB uM + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 iM PMB + 2 nM CdTe irradiadas, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiadas, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe irradiaçãomediado.

Discussão

As nanopartículas representam uma abordagem promissora para a criação de novos agentes anti-microbianos. Análise da curva de crescimento é uma maneira de monitorar a densidade da célula bacteriana que distingue as células-ativamente crescentes de crescimento inibido células. Quando acoplada com contagens de placas, permite uma análise completa do potencial antibiótico de um conjugado. O formato de 96 poços permite variações relativamente alto rendimento de concentração e outras condições, tais como expo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de Catálogo	Comentários (opcional)
Borato componente tampão # 1	Pescador	O ácido bórico A-74-1
Borato componente tampão # 2	Sigma-Aldrich	Tetraborato de sódio B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Vários MWCO disponível
Frascos de vidro	Pescador	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
A polimixina B	Sigma-Aldrich	P1004
Gr bacterianaowth médio Componente (LB) # 1	Pescador	NaCl S271
Meio de crescimento bacteriano (LB) Componente # 2	BD	Triptona 211705
Meio de crescimento bacteriano (LB) Componente # 3	BD	Extracto de levedura 211.929
Lâmpada para exposição à luz	Personalizado
Clara de fundo placas de 96 poços	Pescador	07-200-567 ou 07-200-730
Fluorescência espectrômetro	Molecular Devices
Leitor de placas de absorbância	Molecular Devices
BactoAgar para meios sólidos	Bioshop	AGR001.1
As placas de Petri em volta	Pescador	08-75-12
As placas de Petri rectangulares	Pescador	08-757-11A