Büyüme Eğrisi ve Plate Count tarafından Kuantum Noktaları ve Bakteriyel Toksisite Tahliller kararlı hale getirilmesi ve Bio-konjugasyon

Özet

Gibi yarı-iletken kuantum noktaları (QDS) gibi Nanopartiküller anti-mikrobik ve anti-kanser maddeler uygulamalar için photoactivatable oluşturmak için de kullanılabilir. Bu teknik nasıl gösterir su çözünür bir antibiyotik onları eşlenik ve büyüme eğrileri ve plaka sayısı dayalı bir bakteriyel inhibisyon testi gerçekleştirmek, kadmiyum tellür (CdTe) QDS.

Özet

Kuantum nokta (QDS) dalga boylarında geniş bir seçim ile heyecan edilebilir boyutuna bağlı emisyon spektrumları ile floresan yarı iletken nano parçacıklar vardır. QDS görüntüleme, teşhis, ve onların parlak, istikrarlı floresans ^{1,2 3,4,5} nedeniyle tedavi için oldukça ilgi çekmiştir. QDS bakteri ve memeli hücreleri ⁶ bağlanmak için biyo-aktif moleküller çeşitli konjuge olabilir.

QDS da yaygın bakteri hedeflenerek öldürülmesi için sitotoksik ajanlar olarak araştırılmaktadır. Çarpma dirençli bakteri suşunun ortaya çıkması hızla özellikle Gram negatif patojenler ⁷ durumunda, bir sağlık krizi haline gelmektedir. Çünkü özellikle belirli nanomalzemeleri, Ag bilinen antimikrobiyal etkisi, bakteri ⁸ nanopartiküllerin toksisite araştıran çalışmaların yüzlerce vardır. Bakteriyel çalışmaları espec, hem yarı iletken nano partiküller diğer türleri ile yapılmıştırially TiO ₂ ^9,10-11, fakat, aynı zamanda ¹² ZnO ve CuO ¹³ dahil olmak üzere diğerleri. Bakteri suşlarının bazı karşılaştırmalar genellikle Gram pozitif bir Gram negatif gerilim karşılaştırarak, bu çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Parçacıkları veya oksidatif toksisiteye neden olabilmektedir metal iyonlarının doğrudan salınımı ile reaktif oksijen türlerinin photogeneration (ROS): ya bu parçacıkların tümü ile, toksisite mekanizmaları oksidasyon atfedilir. Hatta bu malzemeler ile farklı çalışmaların sonuçları büyük ölçüde değişir. Bazı çalışmalarda Gram pozitif test suşu Gram negatif ^10'undan bildirildiğine göre daha duyarlıdır, diğerleri içinde ters ^14'tür. Bu çalışmalar iyi ¹⁵ gözden geçirilmiştir.

Tüm nanoparçacık çalışmalarda, partikül bileşimi, büyüklüğü, yüzey kimyası, örnek yaşlanma / arıza ve dalga boyu, güç ve ışık maruz kalma süresi tüm dramatik sonuçlarını etkileyebilir. Ayrıca, synthesi olaraklar yan ve solventler ^{16 17} düşünülmelidir. Yüksek verimli tarama teknikleri etkili yeni ilaçlar geliştirmek nanotıp edebilmek için gereklidir.

CdTe QDS anti-mikrobik etkileri başına ¹⁸ veya antibiyotikler ile kombinasyon halinde bulunmaktadır. Önceki bir çalışmada, CdTe için antibiyotik kaplin ¹⁹ konjugatları reaktif oksijen türlerinin üretiminin azalması nedeniyle, bakteri toksisitesini artırabilir ancak memeli hücreleri için toksik azaltabilirsiniz gösterdi. Bu kadmiyum içeren bileşikler insanda kullanım için uygun olacağı düşük olmasına karşın, bu preparatlar yüzeyler ya da su sterilizasyon dezenfeksiyon için kullanılabilir.

Bu protokol, biz merkaptopropanoik asit (MPA) ile CdTe QDS çözülebilmesinde için basit bir yaklaşımdır verir. QDS bir saat içinde kullanıma hazır. Biz daha sonra bir antimikrobiyal ajan için kaplin göstermektedir.

Protokolün ikinci kısmıKonjuge ve konjuge olmayan QDS kullanılarak 96-kuyucuklu bakteriyel önleme deneyi göstermektedir. Optik yoğunluk QD eklenmesi ve bir geri kazanım süresinden sonra yanı sıra hemen değerlendirilecek ışığa maruz kalma etkilerini izin veren, birçok saat boyunca okunur. Ayrıca bakteriyel yaşam hesaplamak için bir koloni sayısı göstermektedir.

Protokol

1. QD Çözme

Bu CdTe için uygun bir yöntemdir. Benzer yöntemlerle örneğin InP / ZnS ²⁰ ve CdSe / ZnS ²¹ gibi QDS, diğer tipteki kullanılabilir.

1. 15 uM (birinci exciton dorukta optik yoğunluk = 2.5) toluen içinde CdTe QDS çözeltisi hazırlayın.
2. Bir cam şişe içinde bu hisse senedinin 200 ul aktarın. Plastik kullanmayın!
3. 800 uL toluen, 200 mM borat tamponu (pH 9), 1 ml ve 11.5 m mercaptopropionik asit (MPA) 2 uL ekleyin.
4. Flakon Cap ve 30-60 saniye kuvvetlice sallayın.
5. Sulu ve organik çözücü faz kendiliğinden ayıracaktır. Sulu faz QDS rengini hale gelecektir. Toluen katmanı önlemek için, çıkarın ve atın. Daha sonra temiz bir şişeye sulu faz transfer.
6. 500 uL, 10000 molekül ağırlıklı kesim santrifüj filtre kullanarak dört kez yıkama / filtreleyerek çözünmüştür QDS arındırın. Filtreler olmalıdır13 dakika boyunca 3000 xg de döndü. En azından son iki yıkamadan için, istenilen son tamponu ile yıkayın.
7. Nihai yıkamadan sonra, 4 ° C'de pH ve istenen mağazadan 50 mM borat tamponu içinde yıkanmış QDS askıya Onlar 1-2 hafta için kararlı olacaktır.
8. Yayınlanan formüller ²² dayanan konsantrasyonunu tahmin etmek için absorbans ve emisyon spektrumları ölçün.

Temsilci sonuçları: Şekil 1 UV lamba aydınlatma altında CdTe QDS bir görüntü gösterir, ve su çözünürleştirme öncesi ve sonrasında emisyon spektrumları, kap Borsasından önemsiz değişiklik gösteriyor. Boyutu değerleri elektron mikroskobu ile ölçülen çekirdek çapı vardır.

2. Antibiyotik için QD Konjugasyon

Protokolü bu bölümü çoğu ticari QDS, metal parçacıklar ve daha fazlası ¹⁹ dahil herhangi bir negatif yüklü su çözülmüş nanoparçacık, uygulanabilir.

1. Herhangi bir molekülün çalışacağını either negatif yüklü çözündürülmüş QDS için kendi kendine toplanır, veya böyle bir primer amin gibi, konjuge olabilen bir reaktif grup sahiptir. Bu örnekte, pozitif yüklü ve konjugasyon reaktifler için gerek kalmadan kendi kendine monte edilir polimiksin B (PMB), kullanıyorsunuz. 60 mM H ₂ O PMB eritin. (Seçilen antibiyotik _H2O çözünmez ise, 0,1-1 mM konsantrasyonunda DMSO ya da etanol içinde çözülür). Bu çözelti, bir 10x _(H2O) veya bir 100X çözeltisi (çözücü içinde) olacaktır.
2. Eğer bakteriyel toksisite denemeleri için gereken ne kadar QD çözüm hesaplayın. 0,3 mL başına iyi quadruplicates içinde bir 96-kuyulu plakalı için, 200 nM konjugat 0.5 mL ihtiyaç duyulmaktadır. 50 mM borat tamponu içinde 1 uM kuantum noktaları 100 uL içeren iki tüp hazırlayın.
3. Bir primer amin üzere bağlantı, bir 19 mg / mL (100 mM) 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] çözeltisi içinde H ₂ O. karbodiimid hidroklorür (EDC) hazırlanması Çözelti içinde EDC stabil değildir; Hemen kullanmak ve geri kalanı çöpe atın.
4. 10x antibiyotik çözeltisi _(H2O) veya konjugatı tüpüne 100X çözeltisi (çözücü olarak) ve 5 uL 50 uL ekleyin. PMB için: 30:1 molar oranında CdTe konjugasyon, 60 uM PMB'nin 50 uL ekleyin. ₂ H, O ya da QD yalnızca kontrol tüpüne solvent ekleyin.
5. Gerekirse, konjuge tüpüne EDC stok solüsyonu 1 uL ekleyin.
6. Uygun tampon (; gibi Tris olarak hiçbir amin içeren tamponlar, onlar EDC engeller olarak borat tamponu veya PBS) ile 0.5 mL konjuge ses getir.
7. 1 saat için bir nutator veya rocker alüminyum folyo ve yer ile ışıktan Shield tüpler. Agregasyonu oluşursa, antibiyotik düşük konsantrasyonlarda konjugasyon tekrarlayın. Parçacıkların toplam istemiyorum kadar konsantrasyonu yukarı doğru titre edilir.
8. Uygun bir filtreden geçirilerek konjugatları yıkayın. 10.000 moleküler ağırlığı kesme en antibiyotikler için değil, proteinler veya antikorlar için çalışır.
9. Absorbans ya floresans spektroskopisi, jel elektroforezi, veya Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FTIR): molekülü bağlı olarak, farklı yöntemler QD başına antibiyotik molekül sayısını hesaplamak için kullanılabilir.

Temsilci sonuçlanır. Bu örnekte, PMB konjugasyon QD emisyon spektrumunu değişiklikler ile karakterize edilir. Şekil 2 PMB ilavesi ile CdTe QDS spektrumları gösterir.

3. 96-Ekran için Bakteriler hazırlanması; Antibiyotik IC ₅₀ Belirlenmesi

Bu, uygun bir ortamda yetiştirilir ¹⁸ hemen hemen herhangi bir bakteri suşunun için de geçerlidir. Kayıtlar devam etmelidir zaman kesin uzunluk bakteriyel büyüme oranı bağlıdır. Örneğimizde, biz lysogeny suyu (LB) orta yetiştirilen Escherichia coli kullanın.

1. Uygun QD konjugatı konsantrasyonları seçmek için, bu bilmek önemlidirAntibiyotik _IC50 başına QDS toksik olup olmadığını konjuge olması ve. Bu 2 gün konjugasyon deneyden önce başlamış olmalıdır. Akşam, taze bir koloni bakteri üremesi orta tohum 10 ml, doğru steril ve biyogüvenlik tekniği kullanılarak.
2. Ertesi gün, 1-2 saat deneyden önce, besi, neredeyse maksimal miktarı ile açık-alt 96-plaka kuyuların her doldurun. Bakteri kültürü 1-50 uL (konsantrasyon türün nasıl büyür hızlı bağlıdır ve laboratuar tarafından kalibre edilmesi gerekecektir) her iyi, çok kanallı pipet, tohum kullanma.
3. Plaka okuyucu üzerine plaka koyun ve kararlı bir dalga boyu (genellikle 600 nm) 2 saat 10 dakikada okunur olarak ayarlayın. Bakteriler çok hızlı çok yoğun büyümeye kalmamanız plaka izleyin.
4. Hücreleri tüm OD = 0.1-0.15 ulaştığınızda, plaka okuyucu plaka kaldırmak ve kayıt işlemini durdurmak.
5. Tek başına ilaç ekleyin ve tek başına QDSen az kopyalardaki farklı konsantrasyonları. "Karanlık" bir kontrol ve aydınlatılmaya bir yarısı olarak plakanın bir tarafı kullanın. Önerilen bir düzeni Şekil 3'te verilmiştir. Konsantrasyonları biri çok az bakteri inhibe konsantrasyon, ve hepsini öldürür içerecek şekilde geniş bir aralığı kapsar yeterli olmalıdır.
6. Alüminyum folyo ile plaka "karanlık" yan koruyun. İstenen dalga boyunda bir lambadan diğer tarafında maruz bırakmaktadır. Biz 2,4 mW LED (Şekil 4) ve 30-60 dakika saçmak yapılmış özel bir 96-440-nm lamba kullanın. Net, altları siyah tabak sokak ışıktan Pozlanmamış bakteri korumaya yardımcı olur. Boş bir sütun da maruz kalan ve un maruz kalan taraf arasında kullanılabilir.
7. Işığa maruz sonra, plaka okuyucu ve kayıt OD 600 büyüme oranına bağlı olarak 5-12 saat boyunca her 10 dakikada bir tabak koyun. Tutmak sıcaklığı <32 ° C kültürlerin kurumasını önlemek üzere mümkünse.
8. Büyüme eğrilerinin çizdirmekSeçilen bir zaman noktasında vs log [konsantrasyonu] ve Tepesi denklem kullanılarak antibiyotik IC ₅₀ belirler:

H Hill katsayısı olduğu, y _max büyüme (ideal bir plato üzerinde) en yüksek noktası olan ve y _min bir plato üzerine de ideal, sıfır noktasıdır. Tek başına QDS kullanılan konsantrasyonlarda hücreler çok toksisite gösterecektir olası değildir, bu yüzden bir değer tespit edilmeyecektir.

Temsilci sonuçlanır. Kayıt döneminin sonunda, açık bir kuyu tam hücre ölümü gösterir, ve hücre yoğunluğu bir gradyan ilaç konsantrasyonlarını artan boyunca yer almalıdır. Bakteriler S-şekilli büyüme eğrileri (Şekil 5 A) göstermelidir; maksimum yayla yerini zorlanma gerginlik büyük ölçüde değişebilir ve aynı zamanda sıcaklık bağlı olacaktır. Belirli bir zaman noktası olabilirtemsilcisi olarak seçilir ve değerleri çizilen vs Log [antibiyotik] IC ₅₀ (Şekil 5 B) vermek üzere. QD toksisite değerlendirilmesi için, yaşam vs Günlüğü [QD] Ayrıca çizilen, ama yalnız QDS ile önemli bakteri öldürme ulaşmada (Şekil 5 C) nadirdir olabilir.

4. Antibiyotik / QDS ile 96-Screen için Bakteri hazırlanması

1. Deneme, uygun zengin ortama taze bir koloni kültürü tohumu 10 ml, doğru steril ve biyogüvenlik tekniği kullanmadan önce gün. Oldukça istikrarsız sürece QD-antibiyotik konjuge bu günde hazırlanmalıdır.
2. Deney 1-2 saat önce, besi, neredeyse maksimal miktarı ile net bir-alt 96-plaka kuyuların her doldurun. Bakteri kültürü 1-50 uL her iyi, çok kanallı pipet, tohum kullanma.
3. Plaka okuyucu üzerine plaka koyun ve Bölüm 3 ile aynı dalga boyunda 2 saat 10 dakikada okunur olarak ayarlayın.
4. Hücreleri tüm OD = 0.1-0.15 ulaştığınızda, plaka okuyucu plaka kaldırmak ve kayıt işlemini durdurmak.
5. En az dörderli farklı konsantrasyonlarda QD konjugatları ekleyin. "Karanlık" bir kontrol ve aydınlatılmaya bir yarısı olarak plakanın bir tarafı kullanın. Önerilen bir düzeni Şekil 6'da verilmiştir. Bir bakteri, yalnızca denetim şeridinde her zaman kültürün, sıcaklık durumunda sorunlar dahil edilmelidir, vb büyüme koşulları etkiler. Tek tek ilaç şeridi ve sadece QD ayrıca daha önce yapılan kontrol plakası uyduğundan emin olmak için dahil edilmelidir. Kuyuların kalanı iyi istatistikleri sağlamak amacıyla konjugatları adanmıştır.
6. Alüminyum folyo ile plaka "karanlık" yan koruyun. İstenen dalga boyunda bir lambadan diğer tarafında maruz bırakmaktadır.
7. Işığa maruz sonra, plaka okuyucu ve kayıt OD 600 5-12 saat boyunca her 10 dakikada bir tabak koyun. <32 ° C mümkünse Dr önlemek için sıcaklık tutmakkültürlerin ying.

Temsilci sonuçlanır. QDS ve antibiyotik kombinasyonu tek başına antibiyotik daha az toksik olabilir; eşit toksik; veya daha fazla zehirlidir. Bu büyüme eğrilerinin belirlenmesi ve _IC50 ölçüm kullanılarak ölçülebilir. Şekil 7 bu antibiyotik olarak eşit toksik tek başına, ve daha fazla toksik konjugatların bir örnek konjugatların bir örneğini göstermektedir.

5.. Plate Count

1. Seri seyreltiler ve koloni sayım için kullanılmak üzere tedavi edilen 96-kuyulu plakanın bir veya daha fazla kuyu seçebilir.
2. PBS veya tuzlu su solüsyonu (% 0.9 NaCl) ile birlikte seçilen bakteriyel numuneleri, her bir seri seyreltme edin. Bakteriyel çözümün 20 uL aktarın ve 180 uL tuzlu su ile sulandırın, pipet, mix değiştirmek ve 180 uL serum fizyolojik ile sulandırılmış bakteriyel solüsyon 20 uL aktarın. 6 kez tekrarlayın.
3. Uygun her seyreltme ve plaka 10 uL alın katı ortam plakası. Bir şeyleri sıraya kolay olduğu dikdörtgen yemekleri tercih edilir olsa bir örnek tüm 8 konsantrasyonları, 10 cm yuvarlak Petri tabağına kaplanmış olabilir.
4. O 15 dakika tezgah üzerinde kurumasına izin verin. sonra 16 saat için bakteriler için uygun sıcaklıkta inkübe edin.
5. Için (# kolonilerin x seyreltme faktörü) / hacim kaplama = CFU / mL. Göre koloniler ve koloni oluşturan birim (CFU) hesaplamak

Şekil 8, örnek CFU plakası gösterir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. CdTe QDS. (A) CdTe QDS Sekiz hazırlıkları bir UV değnek (365 nm) ile aydınlatılır. Su çözünürleştirme önce ve sonra seçilen beş boyutları (B) Absorbans ve emisyon spektrumları. Kesikli çizgiler toluen içinde spektrumu olan, düz çizgiler su içinde bulunmaktadır.

files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
Şekil 2. QD-PMB konjugatları Spektral ve jel analizi. Turuncu yayan CdTe QDS Bu örnek için kullanılmıştır; QDS diğer tipleri üzerine etkileri her bir deney için değerlendirilmesi gerekir. (A) Tipik absorbans (gri çizgi) ve PMB konjugasyonu ve PMB 160 molar eşdeğeri eklenmesinden sonra emisyonu (tireli çizgi) önce QDS emisyon spektrumu (siyah çizgi). PMB'nin oranı ve QD emisyon yoğunluğu (kareler) ve pik dalgaboyu yeri (üçgenler) arasındaki (B) ilişki.

Şekil 3. Kontrolü büyüme plağı için plate yerleşimi. PMB ve QD konsantrasyonları geniş bir aralığı temsil edilir. Plakanın yarısı (mavi vurgulanır) aydınlatılır ve özdeş bir buçuk ışıktan korunur. tıklayınızbüyük rakam görüntülemek için.

Şekil 4. Üniforma plaka ışınlanması için özel 96-LED lamba, off görünümü gösteren ve üzerinde. Tipik bir elde tutulan bir UV lambası da kullanılabilir, fakat üniform tüm bord kapsamaktadır olmayacaktır.

Şekil 5. Kontrolü büyüme plağı için Örnek sonuçlar. (A) farklı ilaç konsantrasyonu ile Örnek bakteriyel büyüme eğrilerinin, 0 dan hücre ölümü tamamlamak için. Konsantrasyonları ile verilen açık semboller PMB sadece; katı sembolleri ışınlama olmadan CdTe-PMB vardır; ve yarı dolu semboller ışınlama ile CdTe-PMB vardır. Işınlama PMB-sadece numune üzerinde hiçbir etkisi yoktu, bu eğrilerin açıklık için atlanmış çıkarıldı. QD oranları: Tüm PMB-CdTe konjugatları 30:1 PMB vardır. (B) 200 dakika vs Günlüğü [PMB] az büyüme eğrisi değerleri Arsalar ve Eşitlik uyan. (1). Cont içinışık etkileri için rol, bir eğri, sadece ışık maruz kalma 30 dakika ile antibiyotik ile yapılır. CdTe QDS kullanarak 200 dk vs QD konsantrasyonu, (C) Bakteriyel hayatta. Bazı toksik bir IC ₅₀ değeri belirlemek için ışığa maruz kalma, ama çok az görülür. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6. Konjuge testi plaka için yerleşimi. Plaka mavi vurgulanan yarısı ışığa maruz edilmeli ve unhighlighted yarısı korunmaktadır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7. Örnek konjuge testi plaka için sonuçlar. 200 dk büyüme eğrisi değerleri pl edildiotted ve Eşitlik için uygun. (1). (A) CdTe-PMB konjugatları yalnız PMB üzerinde toksisite artış gösterirler. (B) Altın nanoparçacık Au-PMB konjugatları yalnız PMB üzerinde hiçbir artış toksisite göstermektedir.

Şekil 8. Bir CFU plaka örneği. E. Bir 96-kuyulu plakalı tohumlanmış coli 30 dakika süreyle irradyasyonu ile veya olmadan QD-PMB ile muamele edildi. daha sonra 4 saat boyunca 32 ° C'de inkübe edildi. Her bir numune bakteriyel seri seyreltileri, tuzlu su çözeltisi, 10 ve ⁷ X seyreltme için 100 X, 10 uL ile yapılmıştır agar levhalar üzerine ekildi. Levhalar 37 ° C'de ve koloniler 16 saat sonra sayıldı inkübe edildi. Plakası belirtildiği gibi satırları boyunca dilüsyonları göstermektedir; sütun şunlardır: (A) 0.06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B), 0.12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0.2 uM PMB + 6.7 nM CdTe, (D) 0.06 uM PMB + 2 nM ışınlanır, (E) 0.12 mM PMB + 4 nM CdTe ışınlanır, (F) 0.2 mM PMB + 6.7 nM CdTe irra CdTediated.

Tartışmalar

Nanopartiküller yeni bir anti-mikrobiyal ajanlar oluşturulması için umut verici bir yaklaşımı temsil eder. Büyüme eğrisi analizi büyümeyi inhibe hücreleri aktif büyüyen hücreleri ayıran bakteri hücre yoğunluğu izlemek için bir yoldur. Plaka sayısı ile birleştiğinde, bu bir konjugat antibiyotik potansiyelinin tam bir analizini sağlar. 96-formatı, ışığa maruz kalma gibi konsantrasyonu nispeten yüksek verimli varyasyonlar ve diğer koşullar izin, ikincisi bu kuantum noktalar olarak ışık ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Tampon Bileşen # 1 Borat	Balıkçı	Borik asit A-74-1
Tampon Bileşen # 2 Borat	Sigma-Aldrich	Sodyum tetraborat B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	Kullanılabilir Çeşitli MWCO
Cam şişeleri	Balıkçı	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
Polimiksin B	Sigma-Aldrich	P1004
Bakteriyel growth orta (LB) Bileşen # 1	Balıkçı	NaCl S271
Bakteriyel büyüme ortamı (LB) Bileşen # 2	BD	Tripton 211.705
Bakteriyel büyüme ortamı (LB) Bileşen # 3	BD	Maya Ekstraktı 211.929
Işık pozlama için Lamba	Özel
Clear-alt 96-kuyucuğu	Balıkçı	07-200-567 ya 07-200-730
Floresans spektrometresi	Molecular Devices
Absorbans plaka okuyucu	Molecular Devices
Katı ortam için BactoAgar	Bioshop	AGR001.1
Petri yuvarlak	Balıkçı	08-75-12
Dikdörtgen Petri	Balıkçı	08-757-11A