マウスのビデオ眼球運動記録法

要約

ビデオ眼球運動記録法は、眼球運動性能だけでなく、運動学習を調査するために非常に定量的な方法です。ここでは、マウスでビデオ眼球運動記録法を測定する方法について説明します。通常、薬理学的に処理または遺伝子改変マウスで、この手法を適用すると、モーターの動作の基本的な生理機能を探索する強力な研究ツールです。

要約

目の動きは、オブジェクトを追跡したり、移動中の網膜上に画像を安定させるために非常に重要です。マウスなどの窩ない動物は、ターゲットに彼らの目をロックするための限られた能力を持っています。これらの目標に向け、目の動きとは対照的に、代償性眼眼球運動が容易にafoveate動物^1,2,3,4で誘発されています。代償性眼球運動は目の筋肉を駆動するコマンド信号に前庭と視運動情報を処理することによって生成されます。前庭と視運動情報の処理は、眼球システムの赤字の仕様を可能にする、別々と一緒に調査することができます。動眼神経システムは、視運動性反射（OKR）、前庭動眼反射（VOR）または視覚的に強化された前庭動眼反射（VVOR）を想起させることによってテストすることができます。 VORが反射目のmであるのに対し、OKRは、網膜上で "フルフィールド"画像の動きを補正する反射運動である頭部の動きを補償ovement。 VVORは、適切な補償を行うだけでなく、視運動性の情報を両方の前庭を使用して反射眼球運動である。小脳では、監視し、これらの代償性眼球の動きを調整することができます。したがって、眼球運動記録法だけでな​​く、病的状態（前庭、眼および/または小脳由来のFe）の下で、通常の下で脳と行動の関係を調べるために非常に強力なツールです。

動眼神経システムをテストし、行動のパラダイムとして、いくつかの理由で興味深いものです。まず、眼球運動システムはよく理解神経系⁵である。第二に、眼球運動システムは相対的なシンプルな⁶であり;可能性眼球運動の量は、そのボール·イン·ソケット·アーキテクチャー（ "シングル·ジョイント"）と外眼筋の三対⁷で制限されています。第三に、行動出力と感覚入力を簡単に定量するためのこの非常にアクセス可能なシステムをなす、測定することができます分析^8。多くの行動テストでは、定量的な力のこのような高いレベルを欠いている。そして最後に、パフォーマンスだけでなく、眼球運動系の可塑性の両方が学習と記憶のプロセス⁹の研究を可能にする、テストすることができます。

遺伝子改変マウスは、今日広く利用可能であり、彼らは様々なレベル¹⁰での脳機能の探査のための重要な供給源を形成します。加えて、それらはヒト疾患を模倣するモデルとして使用することができます。正常に眼球運動記録法、薬理学的に処理または遺伝子改変マウスを適用すると、正常および病的条件下でモーターの動作の基本的な生理機能を探索する強力な研究ツールです。ここでは、マウス⁸でビデオ眼球運動記録法を測定する方法について説明します。

プロトコル

1。準備

以下の実験は、動物実験ダッチ倫理委員会に準拠して実施した。

1. ビデオ眼球運動記録法のためにマウスを準備しています。マウスの眼球運動を測定するために、マウスの頭が固定化する必要があります。したがって、台座の建設は、マウスの頭蓋骨（ 図1）で行われます。
   1. とガスチャンバー内の酸素、イソフルランの混合物（ローディアOrganiqueファイン株式会社は、フランスisofluran 1から1.5パーセント）で、マウスを麻酔。過度のガスが清掃される。ノーズコーンを介して麻酔を維持しています。つま先のピンチを経由して全身麻酔の深さを確認してください。
   2. 肛門の温度センサーの使用と加熱パッド（FHC、Bowdoinham、ME）で37℃で体温を維持します。
   3. 眼軟膏（duratears、アルコン、ベルギー）とそれらを覆うことによって目を保護します。背側頭部の毛を剃ると、スクラブとbetadinの回転に伴って外科領域をきれいにeまたはクロルヘキシジン·ソリューションを提供します。
   4. 頭蓋骨の背頭蓋表面を露出する中間線の切開を行います。表面は清潔で乾燥したことを確認します。
   5. ブレグマからラムダに頭蓋骨の背頭蓋表面に、リン酸（カー、カリフォルニア州のリン酸ゲルエッチャント37.5％）の低下を適用します。 15秒後にエッチング液を除去し、再び生理食塩水と乾いた頭蓋表面をきれいにしてください。
   6. このエッチングされた頭蓋表面オプチボンド素数のドロップ（カー、CA）、30秒のためにそれを空気乾燥の上に適用されます。
   7. オプチボンド素数の上にオプチボンド接着剤（カー、CA）の低下を置き、1分間（最大480可視光硬化部、ヘンリーシャイン、アメリカ）の光で硬化。
   8. カリスマコンポジット（ヘレウスKulzer、ドイツ）の薄層と接着​​剤層をカバーしています。コンポジットで二つ接続ナット（直径3mm）を埋め込む。光との複合その後を治す。必要な場合には、複合材料の追加層を適用し、光でそれらを治す。
   9. 広告術後鎮痛のために大臣ブプレノルフィン（0.015 mg / kgで、サウスカロライナ州）。動物は約5分以内に、その足で戻っているはずです。マウスは、手術後少なくとも3日間、室温でのホームケージで回復することができます。
2. マウスのビデオ眼球運動記録法の設定（ 図2）。
   1. 制止にマウスを置き、2本のネジ（ 図1）によって制止に頭を固定します。マウスは、この手順では、麻酔する必要はありません。拘束時間は1時間/日を超えてはなりません。
   2. 順番にターンテーブル（：60センチ直径）にマウントされているXYプラットフォーム上でマウスヘッドとボディの制止をマウントしてください。 XYプラットフォームを使用してマウスヘッドがターンテーブルの中央上に配置することができます。マウスは、ピッチ、ヨー、ロールの軸上を移動することができます。マウスの頭部はISCAN systeによって生成された眼の視覚イメージを使って目を合わせて、正しいピッチ、ヨー、ロール角に配置されメートル。また、台座の建設は、定位固定フレーム¹¹にマウスの頭の上に配置することができます。
   3. ターンテーブルは、ACサーボ制御モータ（ハーモニックドライブAG、オランダ）に取り付けられており、ターンテーブルの位置は、ターンテーブルの軸に取り付けられたポテンショメータ（BOURNS株式会社。、CA）によって監視されます。
   4. 円筒形の周囲の画面（直径：63センチメートル、高さ：35 cm）のランダムドットパターン（各要素は2°）とターンテーブルをカバーし、このドラムは、ACサーボ制御モータ（ハーモニックドライブAG、オランダ）が装備されている。円筒状のスクリーンの位置は、その軸と画面がハロゲンライト（20ワット）で点灯することができますに接続されたポテンショメータ（BOURNS株式会社。、CA）によって監視されます。周囲の画面とターンテーブルの両方が独立して駆動されます。
   5. ターンテーブルとその周辺の画面の動きは、I / Oインタフェース（CED限定され、ケンブリッジ、英国）に接続されているコンピュータによって制御されます。 TA、I / Oインタフェースによってデジタル化され、このコンピュータに格納されている：BLEとその周辺の画面の位置信号（20 Hzのカットオフ周波数）フィルタ処理されます。
   6. マウスの目は、3つの赤外線エミッタに照らされた（600 mWで、分散角：7°、ピーク波長：880 nmで、RSコンポーネント、オランダ）。 2つの赤外線エミッタは、ターンテーブルに固定され、サードエミッタがカメラに接続されています。この第三のエミッタは、キャリブレーション手順の中でと眼球運動の記録中に使用されている参照角膜反射（CR）を生成します。
   7. ズームレンズ（ズーム6000、Navitar社株式会社。、NY）を搭載した赤外線CCDカメラがターンテーブルに取り付けられており、ターンテーブルの中央にマウスの頭部に焦点を当てています。カメラキャリブレーション手順の中で正確に20°以上のロックを解除することができ、ターンテーブルの軸の周りyawedすることができます。
   8. ビデオ信号は、アイトラッキングシステム（ISCAN ETL-200、バーリントン、MA）によって処理されます。 iScanシステムは、アルゴリズムを使用しています瞳孔およびリファレンスCRの中心を追跡することがrithm。システムは、120 Hzのサンプリングレートで水平方向と垂直方向に瞳と基準CRを追跡することができます。
   9. 参照CRの位置、瞳孔の位置と瞳孔サイズの信号はI / Oインタフェースによってデジタル化され、テーブルとその周辺の画面の位置信号と同じファイルに格納されています。ビデオ瞳孔追跡システムは約27ミリ秒の眼球運動信号の遅延を引き起こす。

2。ビデオ瞳孔追跡を用いた眼球運動のキャリブレーションと測定

アイトラッキングシステムは、並進運動のように瞳孔の動きをキャプチャします。追跡された瞳孔の並進運動は、眼と眼の解剖センター（角膜曲率すなわち中央）、眼球の回転角による回転成分の回転中心との間の軸方向の違いによるトランスレーショナルコンポーネントが含まれています。減算によって瞳孔運動/位置から参照CRをING、望ましくない並進成分だけ眼球の回転によるものである並進運動の結果、信号から除去されます。彼らはしばしば非常に小さいですが、この減算は、ヘッドとカメラ間の変換が不要になります。残留単離された並進運動は、次のキャリブレーション方法^8,12によって、眼球の回転角に変換されます。このキャリブレーションは、任意の眼球運動の実験に先立って行われました。

1. 瞳のビデオ画像がモニタの中央に位置されていること、および基準CRの表現が瞳孔上に好ましくは直接目の垂直正中線上に置かれているようにカメラにマウスのヘッド位置を調整します。カメラ/テーブル軸を介して角膜曲率中心を置くことによって達成することができる角度のカメラの回転に起因する基準CRの動きを最小限に抑えることができます。
2. 10°（すなわち、20度のピーク·ツー·ピーク）ターンテーブルの垂直軸周りに+ / - でカメラを数回回転させる。 （瞳孔の回転半径を計算するためにカメラの回転の極端な位置に記録され追跡された瞳（P）と基準CRの位置を使用して、ルピア、RP =Δ/罪（20°）、Δ=（CR -P））、 図3Aを参照してください。
3. Rpの値は瞳孔の大きさに依存するという事実のために、瞳孔径補正は^12（ 図3B）を実装する必要があります。 Rpの関係をおよびRp補正カーブ（ 図3D）を構成する-瞳孔の大きさを決定するために、（ 図3Cすなわち、瞳孔の大きさを操作する）様々な照明条件下で2.2何回も繰り返します。 RPの値は、垂直方向の目の位置に依存しています。実験は、垂直眼球運動の原因になりますときに垂直方向の眼の位置のキャリブレーションの補正は非常にお勧めです13。
4. 参照CRの位置、Pの位置と瞳孔の大きさを測定することにより、眼（E）の角度位置を決定します。参照CRの位置は、並進自由に瞳孔位置を生成する瞳孔位置から減算されます。瞳孔の大きさを測定することによって、RPの値は、RP補正曲線から抽出することができ、Eは、以下の式を用いて計算することができます。E =逆正弦{（Δ1）/ RP}（ 図4A、ここでΔ1=（P _{2-P 1）}とP ₁とP _2）が基準CRの減算によって修正されています。
5. ターンテーブル、および/または周囲の画面回転の大規模なレパートリーは現在、動眼神経系を刺激するために使用することができます。暗闇の中でビデオ眼球運動記録法を実行するために、マウスの目は瞳孔拡張を制限し、このような状況下で瞳孔の追跡を可能にするために縮瞳薬で前処理する必要があります。私たちの実験では、ピロカルピン（4％、研究所ショーバン、フランス）で瞳孔拡張を制限するために使用暗い。

3。データ解析

1. 目の位置は、テーブルの位置と周囲の画面の位置は、すべての（2.4、図4Bおよび式を参照してください）角度位置に変換されます。目の信号が瞳孔追跡システムの画像処理によって27 msの誘導の彼らの遅延を補正しています。
2. 目には、テーブルとその周辺の画面の角度位置が区別と20 Hzのカットオフ周波数を使用してバターワース·ローパス·フィルタでフィルタリングされています。
3. サッケードは、40°/秒の検出しきい値を使用して、目の速度信号から削除されます。データは、検出しきい値を超えた場合の前に、最大20ミリから80ミリ秒に開始し削除されます。
4. テーブル、周囲の画面と目の速度信号がトレイル（ 図4C）で個々のサイクルを使用して平均化されます。
5. 平均信号が適切な関数が備わっています。一般に、正弦波速度の刺激を使用し、平均化されサイクルが洞または余弦関数（ 図4C）が取り付けられています。位相が目の速度と刺激速度の差（度単位）として計算することができるのに対し、その後、ゲインは、刺激の速度に目の速度の比として計算することができます。

4。代表的な結果

ビデオ眼球運動記録法は、眼球運動性能の様々な形態を調査するために使用することができるだけでなく、運動学習（VOR適応; OKR適応）として（すなわち、視運動性反射：反射視覚的に強化された前庭動眼：; VOR VVOR OKR前庭動眼反射）。 OKRは、視覚フィードバックを用いた低周波の外乱を補償する。 OKRはよく照らされた周囲の画面（ 動画1）を回転させることにより誘導することができる。 1.6°の振幅は0.2 -1.0 Hzの周波数範囲にわたって周囲の画面を回転させると視運動性システムは、低周波数範囲THAにおけるより効率的に代償機構である方法を示しています。■高周波数範囲で（ 図5A）。 VORは前庭器官からのシグナルを使用した高周波の頭部の動きを補正します。 VORは、暗闇の中で動物（すなわちターンテーブル）（ 動画2）回転させることによって誘導することができる。 1.6°の振幅は0.2 -1.0 Hzの周波数範囲でターンテーブルを回転させる（ 図5A）前庭動眼システムは低周波数範囲でより高い周波数範囲で補償する眼球運動を生成するより効率的である方法を示しています。コンサートで視運動と前庭動眼システムの行為は、イメージが頭の動きの広い範囲の網膜上に安定させることができます。周囲の画面がよく点灯しているとき、1.6°の振幅0.2 -1.0 Hzの周波数範囲でターンテーブルを回転させる（ 動画3）目が全周波数範囲にわたって"高利得"補償の動きを（ 図5A生成する方法を示しています。 。）すべてのこれらのゲインおよびpH性別¹⁴系統^15,16,17の違いが報告されたものの、ASEの値は、マウスの一般的なものです。

ターンテーブル上の独立制御とその周辺の画面では、視覚と前庭情報間の不一致をマウスに直面することを可能にします。不一致の視覚と前庭情報の長期的かつ均一な露光後、マウスのVORは、変更された視覚入力（; ムービー4 VOR適応）を補うために変更されます。周囲の画面（1 Hzで、1.6°）と位相（すなわち180°）のターンテーブルを回転させると、VOR·ゲイン（ 図5B）を増加させます。一つの試験学習パラダイムを使用してVORゲインの最大の変化は、多くの場合、30分後に達している。

図1マウス、ヘッドとボディの制止の模式図。マウスの本体は、使用が抑制される35ミリメートルの直径を有するプラスチック製の円筒管。マウスの頭部は2本のネジで鉄の棒にマウスの台座を接続することによって固定されている。鉄の棒は、歩行中に、通常のピッチでマウスの頭部を配置するために、30度の角度になります。 * 2個のナットを含む台座の上面図。

図2マウス、ビデオ眼球運動記録法のセットアップの模式図。

図3ビデオ瞳孔追跡システムのキャリブレーション。ターンテーブルの垂直軸周りに10°（ピークすなわち20度のピーク値） - A）カメラは+ /回転させて数回です。追跡された瞳（P）とカメラの回転の極端な位置に記録された参照角膜反射（CR）は、瞳孔の回転半径を計算するために使用され（RP）。 B）瞳孔径の半径は、瞳孔の大きさに依存しています。 C）の例（両方の画素（ピクセル単位で測定））キャリブレーション手順の中で瞳孔位置の瞳孔の大きさの影響を示す。 D）Rpと瞳孔径の関係は、単一のマウスで測定されます。 13異なる瞳孔径は、周囲光の強度を変化させることによって達成された。

図4：ビデオ瞳孔追跡を使用して、眼球運動の測定と分析。 CRの位置を補正）。A）角度の瞳の位置は、瞳孔の半径（RP）と瞳孔の位置（Pから計算されます。 B）代償性眼球運動の例は、前庭と視覚系（視覚強化されたVOR）を刺激することによって誘発した。周囲の画面がよく照らされながら、ターンテーブルは、1.6°の振幅で0.6 Hzの正弦波回転させた。 C）記録の分析）Bに示す。グラフは、ターンテーブル（青）と瞳（赤）の平均速度のトレースを示しています。これらの平均トレースは、正弦関数（黒）を装備しました。

図5。1 C57BL6マウスで測定した動眼神経システムの性能と学習。 （前庭動眼反射、暗闇の中でマウスを回転させることによって、OKR、トップパネル）：VOR、中央のパネル）と（視覚的に光の中でマウスを回転させることにより）目の動きは、周囲の画面の回転（視運動性反射によって生成されます強化された前庭動眼反射：0.2〜1.6°の振幅で1.0 Hzの範囲の周波数を持つVVOR、下のパネル）。反射のゲインは、刺激の速度に目の速度の比（左パネル）と反射の相として計算された眼の速度と刺激速度（右パネル）の位相差から計算されました。 B）モータ学習によって達成されました適応的に位相の訓練パラダイムのうちを使用してVORを増加させる。マウスは、マウスの回転が40分の周囲の画面（1.0 Hzで、1.6°の回転の両方）の回転位相（180°）の外にされたvisuovestibular訓練パラダイムの対象となった。 10分ごとにVOR（1.0 Hzで、1.6°）テストされています。このマウスでは、位相の訓練のうちVORの利得を増加させた。

ムービー1。マウスでOKRを誘発するパラダイムを示すアニメーションがムービーを表示するには、ここをクリック 。

映画（2）マウスでVORを誘発するパラダイムを示すアニメーション。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。

マウスでVVORを誘発するパラダイムを示すムービー3。アニメーション。.com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "ターゲット=" _blank ">動画を見るにはここをクリックしてください。

ムービー4。マウスでVOR適応（増加）を誘発する位相訓練パラダイムのvisuovestibular外を示すアニメーション。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。

ディスカッション

マウスでは高品質のビデオ眼球運動記録を得るためにいくつかの要件が必要です。キャリブレーションの手順は、上記の標準化された問題で実行する必要があります。たとえば、オフセンターキャリブレーションは、瞳孔がキャリブレーション手順の間に参照CR垂直正中線上に配置されていない場合、RPの過小評価と眼球運動の結果、過大評価になります。非常に安定した瞳孔の大きさを示す試験が非常にまれであるため、さらに、我々は、キャリブレーション手順¹²に瞳孔サイズの補正法を統合することをお勧めします。裁判中であっても、小さなストレスはすでに大幅に瞳孔径を変更することができます。

年齢^13,18、性別^、14と^15,16系統：眼球運動の実験を設計する際には、次の要因は、それらが眼球運動の応答に影響を与えることが知られているので考慮してかに制御する必要があります、19。瞳孔と虹彩とのコントラストは、BALB / cマウスのように、低すぎると瞳孔検出と追跡は不可能であるため、さらに、実験動物では、色素沈着虹彩を持つ必要があります。非常に緊張したり不安に動物が実験的なセットアップと拘束条件に慣れるには、実験前に、訓練する必要があります。この動物は目の小さい閉鎖または半閉鎖にプロシージャの結果を処理し、実験中に目流体の発生を防止し、その結果、優れた生徒の追跡が行われます。

最後に、データを取得し、分析する動物ごとに2〜3時間を必要とします。したがって、眼球運動の記録は、おそらく選択したマウスに適用され、ハイスループットスクリーニングテストとしては適していません具体的な手順のままになります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
Isofluran	ローディアOrganiqueファイン株式会社
加温パッド	FHC	40-90-8
Duratears	アルコン
リン酸ゲル	カー	31297
オプチボンド素数	カー	35369
オプチボンド接着剤	カー	35369
カリスマ性複合材料	ヘレウスKulzer
マキシマ480光硬化ユニット	ヘンリーシャイン
ACサーボ制御モーター	ハーモニックドライブAG
CYLindric画面
ハロゲンライト（20 W）	RSコンポーネント
ポテンショメータ（精密）	BOURNS株式会社。	6574
パワー1401（I / Oインタフェース）	CED限られた
コンピュータ	デル
赤外線emmitters	RSコンポーネント	195から451
ETL-200	ISCAN
ズームレンズ（ズーム6000）	Navitar社株式会社。
Pilocarpinenitrate（minims）	ラボラトリーショーバン