Vidéo-oculographie chez la souris

Résumé

Vidéo-oculographie est une méthode très quantitative pour étudier les performances du moteur oculaire ainsi que l'apprentissage moteur. Ici, nous décrivons la façon de mesurer la vidéo-oculographie chez la souris. En appliquant cette technique sur la normale, pharmacologiquement traitées ou des souris génétiquement modifiées est un puissant outil de recherche pour explorer la physiologie sous-jacente des comportements moteurs.

Résumé

Les mouvements oculaires sont très importants afin de suivre un objet ou à stabiliser une image sur la rétine au cours du mouvement. Animaux sans fovéa, tels que la souris, ont une capacité limitée pour verrouiller leurs yeux sur une cible. Contrairement à ces mouvements oculaires dirigés cibles, les mouvements oculaires compensatoires oculaires sont facilement obtenue chez des animaux afoveate ^1,2,3,4. Mouvements oculaires compensatoires sont générés par le traitement des informations vestibulaires et optocinétique en un signal de commande qui va conduire les muscles oculaires. Le traitement de l'information vestibulaire et optocinétique peuvent être étudiés séparément et ensemble, ce qui permet la spécification d'un déficit dans le système oculomoteur. Le système oculomoteur peut être testé en évoquant un réflexe optocinétique (OKR), réflexe vestibulo-oculaire (VOR) ou d'un visuel amélioré réflexe vestibulo-oculaire (VVOR). Le OKR est un mouvement réflexe qui compense pour "plein champ" mouvements d'image sur la rétine, tandis que le VOR est un m oeil réflexeOUVEMENT qui compense les mouvements de tête. Le VVOR est un mouvement des yeux réflexe qui utilise à la fois vestibulaire ainsi que des informations optocinétique pour faire la réparation appropriée. Le cervelet contrôle et est en mesure de régler ces mouvements oculaires compensatoires. Par conséquent, oculographie est un outil très puissant pour étudier le comportement du cerveau dans des conditions normales relation ainsi que dans des conditions pathologiques (Fe de vestibulaire, oculaire et / ou d'origine cérébelleuse).

Test du système oculomoteur, comme un paradigme comportemental, est intéressant pour plusieurs raisons. Tout d'abord, le système oculomoteur est un système bien compris de neurones ^5. Deuxièmement, le système oculomoteur est relative ⁶ simple; la quantité de mouvement des yeux possible est limité par sa balle en prise l'architecture («joint unique») et les trois paires de muscles extra-oculaires ^7. Troisièmement, la sortie de comportement et d'entrée sensorielle peut être facilement mesurée, ce qui en fait un système très accessible pour la détermination quantitativeanalyse ^8. De nombreux tests comportementaux n'ont pas ce niveau élevé de la puissance quantitative. Et enfin, à la fois la performance ainsi que la plasticité du système oculomoteur peut être testé, ce qui permet la recherche sur les processus d'apprentissage et de mémoire ^9.

Des souris génétiquement modifiées sont aujourd'hui largement disponibles et ils constituent une source importante pour l'exploration des fonctions cérébrales à différents niveaux ^10. En outre, ils peuvent être utilisés comme modèles à imiter les maladies humaines. Appliquer sur oculographie normale, pharmacologiquement traitées ou des souris génétiquement modifiées est un puissant outil de recherche pour explorer la physiologie sous-jacente des comportements moteurs dans des conditions normales et pathologiques. Ici, nous décrivons la façon de mesurer la vidéo-oculographie chez la souris ^8.

Protocole

1. Préparation

Les expériences suivantes ont été menées en conformité avec la Duch Comité d'éthique pour l'expérimentation animale.

1. Préparation des souris pour la vidéo-oculographie. Afin de mesurer les mouvements oculaires d'une souris, la tête de la souris doit être immobilisé. Par conséquent, une construction piédestal est faite sur le crâne de la souris (figure 1).
   1. Anesthésier la souris par un mélange d'isoflurane (1-1,5% isofluran; Rhodia Organique fine Ltd, France) et d'oxygène dans une chambre à gaz. La présence excessive de gaz est piégé. Maintenir l'anesthésie par l'intermédiaire cône de nez. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par un pincement de l'orteil.
   2. Maintenir la température du corps à 37 ° C à l'aide d'une sonde thermique anal et un coussin chauffant (FHC, Bowdoinham, ME).
   3. Protéger les yeux en les couvrant avec une pommade ophtalmique (Duratears, Alcon, Belgique). Rasage de la fourrure dorsale du crâne, et nettoyer la zone chirurgicale avec une rotation de broussailles et de betadine ou une solution de chlorhexidine.
   4. Faire une incision ligne médiane pour exposer la surface dorsale du crâne du crâne. Faire de la surface propre et sèche.
   5. Appliquez une goutte d'acide phosphorique (acide phosphorique gel décapant 37,5%; Kerr, CA) sur la surface dorsale du crâne du crâne, de bregma au lambda. Retirer le gel de mordançage après 15 secondes et rendre la surface crânienne nettoyer avec une solution saline et sec à nouveau.
   6. Appliquer sur le dessus de cette surface gravée crânienne une goutte d'OptiBond Premier (Kerr, CA) et sécher à l'air pendant 30 secondes.
   7. Déposer une goutte de colle OptiBond (Kerr, CA) au sommet de la Premier OptiBond et guérir avec la lumière pendant 1 minute (Maxima 480 unité visible de photopolymérisation; Henry Schein, Etats-Unis).
   8. Couvrir la couche adhésive avec une fine couche de composite Charisma (Heraeus Kulzer, Allemagne). Intégrer deux écrous connectés (diamètre: 3 mm) dans le composite. Cure de la suite composite avec la lumière. Lorsque cela est nécessaire, appliquer des couches supplémentaires de composite et de les guérir avec la lumière.
   9. Annonceministre buprénorphine (0,015 mg / kg, sc) pour l'analgésie postopératoire. L'animal doit être de retour sur ses pieds à l'intérieur d'environ 5 min. Laissez la souris pour récupérer dans la cage à température ambiante pendant au moins 3 jours après la chirurgie.
2. Vidéo-oculographie configuration pour les souris (figure 2).
   1. Placez la souris dans le dispositif de retenue et de fixer la tête pour le limiteur de par deux vis (Figure 1). La souris n'a pas besoin d'être anesthésié pour cette procédure. Le temps de retenue ne doit pas dépasser 1 h / jour.
   2. Monter la souris tête et du corps retardateur sur une plate-forme XY, qui à son tour est monté sur le plateau tournant (diamètre: 60 cm). Utilisation de la plate-forme XY la tête de la souris peut être placé au-dessus du centre du plateau tournant. La souris peut être déplacé au-dessus des axes de tangage, de lacet et de roulis. La tête de la souris est placée dans le tangage, lacet et d'angle de roulis correcte en alignant l'oeil en utilisant l'image visuelle de l'oeil généré par le Syste ISCANm. En variante, la construction socle peut être placé sur la tête de la souris dans un cadre stéréotaxique ^11.
   3. Le plateau tournant est fixé à une AC asservi moteur (harmonique d'entraînement AG, Pays-Bas) et la position de la table tournante est surveillée par un potentiomètre (Bourns inc., CA) fixé à l'axe plateau tournant.
   4. Un écran cylindrique entourant (diamètre: 63 cm, hauteur 35 cm) avec un motif aléatoire pointillés (chaque élément de 2 °) couvre la plaque tournante; ce tambour est également équipé d'une AC asservi moteur (harmonique d'entraînement AG, Pays-Bas) . La position de l'écran cylindrique est surveillée par un potentiomètre (Bourns inc., CA) fixé à son axe et l'écran peut être éclairé par une lumière d'halogène (20 Watt). Les deux l'écran environnante et le plateau sont entraînés de manière indépendante.
   5. Le mouvement du plateau tournant et de l'écran entourant est commandé par un ordinateur qui est connecté à une interface E / S (DEC limitée, Cambridge, Royaume-Uni). Tables et les environs des signaux de position d'écran sont filtrés (fréquence de coupure: 20 Hz), numérisé par l'interface I / O et stockés sur cet ordinateur.
   6. L'oeil de la souris est éclairée par trois émetteurs infrarouges (600 MW, angle de dispersion: 7 °, le pic de longueur d'onde: 880 nm, RS Components, les Pays-Bas). Deux émetteurs infrarouges sont fixés à la table tournante et le troisième émetteur est fixé à l'appareil. Ce troisième émetteur produit une réflexion de référence cornéen (CR), qui est utilisé lors de la procédure d'étalonnage et pendant les enregistrements des mouvements oculaires.
   7. Une caméra infrarouge CCD équipé d'un zoom (Zoom 6000, Navitar inc., NY) est fixé à la platine et se concentre sur la tête de la souris dans le centre du plateau tournant. La caméra peut être déverrouillé et peut être fait une embardée sur l'axe plateau plus exactement de 20 ° au cours de la procédure d'étalonnage.
   8. Le signal vidéo est traité par un système de suivi oculaire (ETL-200, ISCAN, Burlington, MA). Le système utilise un algorithme ISCANrithme de suivre les centres de l'élève et la référence CR. Le système peut suivre l'élève et de référence CR dans le sens horizontal et vertical à une fréquence d'échantillonnage de 120 Hz.
   9. Référence CR position, position de la pupille et des signaux taille de la pupille sont numérisées par l'interface I / O et sont stockés dans le même fichier en tant que table et autour de signaux de position d'écran. La vidéo élève-système de suivi induit un retard des signaux de mouvement des yeux d'environ 27 ms.

2. Calibrage et mesurer les mouvements oculaires à l'aide Vidéo élèves de suivi

Le système de suivi des yeux capte le mouvement de la pupille en un mouvement de translation. Le mouvement de translation de la pupille sur chenilles contient une composante de translation dû à la différence axiale entre le centre de rotation de l'oeil et le centre anatomique de l'oeil (c.-à-centre de courbure de la cornée), et une composante de rotation dû à la rotation angulaire du globe oculaire. Par soustractionpar ce qui CR renvoi du mouvement élève / position, le composant non souhaité de translation est éliminé à partir du signal, ce qui entraîne un mouvement de translation qui est seulement en raison de la rotation du globe oculaire. Bien qu'ils soient souvent très petite, cette soustraction élimine également les traductions entre la tête et la caméra. Le résiduelle de mouvement de translation isolé est converti en la rotation angulaire du globe oculaire par le procédé d'étalonnage suivant ^8,12. Cette calibration a été effectuée préalablement à toute expérience des mouvements oculaires.

1. Ajuster la position de la tête de la souris à la caméra de telle sorte que l'image vidéo de la pupille se trouve au milieu de l'écran et que la représentation de la RT de référence est située sur la ligne médiane verticale de l'oeil de préférence directement au-dessus de la pupille. Minimiser les mouvements du CR référence en raison de rotations de la caméra angulaires, qui peuvent être accomplies en plaçant le centre de la courbure de la cornée sur l'axe de la caméra / table.
2. Faire pivoter la caméra à plusieurs reprises de + / - 10 ° (c. 20 degrés de crête à crête) autour de l'axe vertical de la table tournante. Utiliser les positions de la pupille sur chenilles (P) et le CR référence enregistrées dans les positions extrêmes de la rotation de la caméra pour calculer le rayon de rotation de la pupille (Rp; Rp = Δ / sin (20 °), où Δ = (CR -P), voir figure 3A).
3. En raison du fait que la valeur dépend de la Rp taille de la pupille, une correction de taille de la pupille doit être mis en oeuvre ¹² (figure 3B). Répéter l'étape 2.2 plusieurs fois dans des conditions d'illumination différent (manipulation de la taille de la pupille; figure 3C) afin de déterminer la taille de pupille - relation Rp et composer une courbe de correction Rp (figure 3D). La valeur Rp dépend également de la position de l'oeil à colonnes. Lorsque l'expérience sera de provoquer des mouvements oculaires verticaux, puis une correction de l'étalonnage pour les postes oculaires verticaux est très recommandable13.
4. Déterminer la position angulaire de l'oeil (E) en mesurant la position de référence CR, la position P et la taille de pupille. La position de référence CR est soustraite de la position de la pupille générer une position de la pupille de translation libre. En mesurant la taille de la pupille de la valeur Rp peut être extraite de la courbe de correction Rp et E peuvent être calculées en utilisant la formule suivante: E = arcsin {(Δ1) / Rp} (figure 4A; où Δ1 = (P _{2-P 1)} et P ₁ et P ₂ sont corrigées par soustraction de la référence CR).
5. Un large répertoire de platine et / ou des rotations autour de l'écran peut maintenant être utilisé pour stimuler le système oculomoteur. Afin d'effectuer oculographie vidéo dans l'obscurité, l'œil de la souris doit être prétraité avec un médicament miotique de limiter la dilatation de la pupille et de permettre le suivi des élèves dans ces circonstances. Dans nos expériences, nous utilisons la pilocarpine (4%, les Laboratoires Chauvin, France) afin de limiter dilatation de la pupille dansl'obscurité.

3. Analyse des données

1. Positions de l'œil, les positions de table et des positions d'écran environnantes sont tous convertis en positions angulaires (voir Figure 4B et la formule au point 2.4). Oculaires signaux sont corrigés pour leur retard de 27 ms induite par le traitement de formation d'image du système de pupille de suivi.
2. Positions angulaires de l'oeil, la table et l'écran qui entoure sont différenciées et filtré avec un passe-bas Butterworth du filtre utilisant une fréquence de coupure de 20 Hz.
3. Saccades sont retirés de la vitesse de signal de l'oeil en utilisant un seuil de détection de 40 ° / s. Les données sont supprimées à partir de 20 ms avant et jusqu'à 80 ms après avoir traversé le seuil de détection.
4. Tableau, écran environnante et signaux de vitesse moyenne en utilisant les yeux sont chaque cycle dans le sentier (figure 4C).
5. Signaux moyennées sont équipés d'une fonction appropriée. En général, une stimulation de vitesse sinusoïdal est utilisé et la moyennecycles sont équipés de la fonction sinus ou cosinus (figure 4C). Puis, le gain peut être calculé comme le rapport de vitesse à la vitesse de stimulation oeil, tandis que la phase peut être calculée comme la différence (en degrés) entre la vitesse et la vitesse de stimulation oeil.

4. Les résultats représentatifs

Vidéo-oculographie peut être utilisé pour étudier différentes formes de représentations oculomoteurs (c.-à-réflexe optocinétique: OKR; réflexe vestibulo-oculaire: VOR; visuellement amélioré réflexe vestibulo-oculaire: VVOR) ainsi que du moteur d'apprentissage (adaptation VOR, l'adaptation OKR). Le OKR compense les perturbations basse fréquence en utilisant la rétroaction visuelle. Le OKR peut être induite par la rotation de l'écran ainsi éclairée entourant (Film 1). Rotation de l'écran entourant sur une plage de fréquence de 0,2 -1,0 Hz avec une amplitude de 1,6 ° montre comment le système optocinétique est un mécanisme plus efficace de compensation dans le domaine des basses fréquences than dans la gamme haute fréquence (figure 5A). Le VOR compense les mouvements de tête à haute fréquence en utilisant les signaux des organes vestibulaires. Le VOR peut être induite par la rotation de l'animal (c.-à-plateau) dans le noir (Film 2). La rotation de la platine sur une plage de fréquence de 0,2 -1,0 Hz avec une amplitude de 1,6 ° montre comment le système vestibulo-oculaire est plus efficace pour générer des mouvements oculaires compensateurs dans le domaine des hautes fréquences que dans le domaine des basses fréquences (figure 5A) . Lorsque la loi sur le système optocinétique et vestibulo-oculaire de concert, les images peuvent être stabilisé sur la rétine au cours d'une vaste gamme de mouvements de la tête. La rotation de la platine sur une plage de fréquence de 0,2 -1,0 Hz avec une amplitude de 1,6 °, tandis que l'écran environnante est bien éclairée (Film 3) montre comment l'œil génère "à gain élevé" des mouvements de compensation au cours de la gamme de fréquence (figure 5A ). Tous ces gain et phase valeurs sont typiques pour les souris, bien que les différences entre les sexes ¹⁴ et ^15,16,17 souche ont été signalés.

Le contrôle indépendant sur le plateau et l'écran qui entoure nous permet d'affronter les souris avec un décalage entre les informations visuelles et vestibulaires. Après une exposition à long terme et uniforme de l'information visuelle et vestibulaire ne correspondent pas, le VOR de la souris va changer pour compenser l'entrée altérée visuelle (adaptation VOR; Film 4). La rotation de la platine en opposition de phase (c.-à-180 °) avec l'écran qui entoure (1 Hz, 1,6 °) augmente le gain VOR (figure 5B). La variation maximale du gain VOR, lors de l'utilisation d'un paradigme d'un essai d'apprentissage, est souvent atteint après 30 minutes.

Figure 1. Schéma de la souris la tête et du corps de contention. Le corps de la souris est retenu à l'aideun tube cylindrique en matière plastique d'un diamètre de 35 mm. Le chef de la souris est immobilisé en connectant le socle de la souris vers la barre de fer avec deux vis. La barre de fer fait un angle de 30 degrés afin de positionner la tête de la souris dans la hauteur normale lors de la marche. *, Vue de dessus du socle contenant deux écrous.

Figure 2. Schéma de la souris vidéo-oculographie configuration.

Figure 3. Calibration de la vidéo élève-système de suivi. A) L'appareil est tourné à plusieurs reprises de + / - 10 ° (c.-à-20 ° de crête à crête) autour de l'axe vertical de la table tournante. La pupille sur chenilles (P) et la réflexion de référence cornéen (CR) enregistrée dans les positions extrêmes de la rotation de la caméra sont utilisés pour calculer le rayon de rotation de la pupille(Rp). B) Le rayon de l'diamètre de la pupille est dépendante de la taille de la pupille. C) Exemple montrant l'effet de taille de la pupille sur la position des élèves au cours de la procédure d'étalonnage (à la fois mesurée en pixels (px)). D) Relation entre Rp et diamètre de la pupille mesurée en une seule souris. Les diamètres treize élèves différents ont été réalisées en modifiant l'intensité de la lumière environnante.

Figure 4. Mesurer et analyser les mouvements oculaires en utilisant la vidéo-élève suivi. A) la position angulaire pupille est calculé à partir rayon de la pupille (Rp) et la position de la pupille (P; corrigée pour la position CR). B) Exemple de mouvements oculaires compensatoires induite par la stimulation du système vestibulaire et visuelle (visuel amélioré VOR). Le plateau a été tourné sinusoïdale à 0,6 Hz avec une amplitude de 1,6 °, tandis que l'écran environnante était bien éclairée. C) Les analyses de l'enregistrementreprésenté B). Le graphique montre la trace vitesse moyenne de la table tournante (bleu) et de l'élève (en rouge). Ces traces ont été moyennées équipé d'une fonction sinusoïdale (noir).

Figure 5. Performance et de l'apprentissage du système oculomoteur mesurée dans un C57BL6 souris. Mouvements oculaires Une) sont générés par des rotations de l'écran qui entoure (optocinétiques réflexes: OKR, les panneaux du haut), en faisant tourner la souris dans le noir (réflexe vestibulo-oculaire: VOR, panneaux du milieu) et en faisant tourner la souris à la lumière (visuellement amélioré par réflexe vestibulo-oculaire: VVOR, panneau inférieur) avec des fréquences allant de 0,2 à 1,0 Hz à une amplitude de 1,6 °. Le gain de l'évent a été calculée comme le rapport de vitesse à la vitesse de stimulation oeil (à gauche) et la phase de l'évent a été calculé à partir de la différence de phase entre la vitesse et la vitesse de stimulation oeil (panneaux de droite). B) Apprentissage moteur a été accompli par adaptative augmentation de la VOR à l'aide d'un paradigme de la phase de formation. La souris a été soumis à un paradigme de formation visuovestibular dans lequel la rotation de la souris est en opposition de phase (180 °) avec la rotation de l'écran entourant (à la fois rotatif à 1,0 Hz, 1,6 °) pendant quarante minutes. Toutes les 10 minutes, le VOR a été testée (1,0 Hz, 1,6 °). Dans cette souris sur la phase de formation a augmenté le gain VOR.

Film 1. Animation montrant le paradigme qui induit chez la souris OKR Cliquez ici pour voir le film .

Movie 2. Animation montrant le paradigme qui induit chez la souris VOR. Cliquez ici pour voir le film .

Movie 3. Animation montrant le paradigme qui induit VVOR chez la souris..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Cliquez ici pour voir le film.

Movie 4. Animation montrant la sortie visuovestibular de paradigme phase de formation qui induit l'adaptation VOR (augmentation) chez la souris. Cliquez ici pour voir le film .

Discussion

Afin d'obtenir de haute qualité vidéo des enregistrements des mouvements oculaires chez les souris à plusieurs exigences sont nécessaires. La procédure d'étalonnage doit être effectuée dans l'affaire mentionnée ci-dessus standardisé. Par exemple hors centre d'étalonnage, lorsque l'élève n'est pas positionné sur la ligne médiane verticale avec la référence CR au cours de la procédure d'étalonnage, se traduira par une sous-estimation de la RP et par conséquent une surestimation du mouvement des yeux. En outre, nous recommandons l'intégration de la méthode de correction élève taille dans la procédure d'étalonnage ^12, parce que les essais qui montrent une taille de la pupille très stable sont très rares. Même un facteur de stress petit au cours du procès peut déjà modifier le diamètre de la pupille de façon substantielle.

Lors de la conception d'une expérience des mouvements oculaires, les facteurs suivants doivent être pris en compte ou contrôlées pour parce qu'ils sont connus pour affecter la réponse des mouvements oculaires: l'âge ^{13,18, 14} et entre les sexes souche ^15,16, 19. En outre, l'animal expérimental devrait avoir iris pigmentés puisque la détection et le suivi des élèves est impossible lorsque le contraste entre l'élève et de l'iris est trop faible, comme chez la souris BALB / c. Animaux extrêmement nerveux ou anxieux doivent être formés, avant l'expérience, pour s'habituer à l'installation expérimentale et de l'état sobre. Cet animal de manutention résultats de la procédure en moins de fermeture ou semi-fermeture des yeux et empêche la génération de fluides oculaires pendant l'expérience, et par conséquent un meilleur suivi des élèves est accompli.

Enfin, l'acquisition et l'analyse des données nécessite deux à trois heures par animal. Par conséquent, les enregistrements des mouvements oculaires restera probablement une procédure spécifique appliqué à des souris sélectionnées et ne convient pas comme un test de criblage à haut débit.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Isofluran	Rhodia Organique fine LTD
Coussin chauffant	FHC	40-90-8
Duratears	Alcon
Gel d'acide phosphorique	Kerr	31297
Optibond Premier	Kerr	35369
Optibond adhésif	Kerr	35369
Charisme composite	Heraeus Kulzer
Maxima 480 unité de photopolymérisation	Henry Schein
AC servo-contrôlé du moteur	Harmonic Drive AG
Cylécran Indric
Lumière halogène (20 W)	RS Components
Potentiomètres (précision)	Bourns inc.	6574
Puissance 1401 (interface I / O)	DEC limitée
Informatique	Dell
Emmitters infrarouge	RS Components	195-451
ETL-200	ISCAN
Objectif à zoom (zoom 6000)	Navitar inc.
Pilocarpinenitrate (minimes)	Laboratoire Chauvin