Видео-окулография у мышей

Резюме

Видео-окулография очень количественный метод для исследования глазного производительность двигателя, а также в качестве моторного обучения. Здесь мы опишем, как для измерения видео-окулография у мышей. Применение этого метода на нормальный, фармакологически обработаны или генетически модифицированных мышей, является мощным инструментом исследования для изучения основных физиологии двигатель поведения.

Аннотация

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals^1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).

Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system⁵. Second, the oculomotor system is relative simple⁶; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles⁷. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis⁸. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes⁹.

Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels¹⁰. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice⁸.

протокол

1. Подготовка

Следующие эксперименты были проведены в соответствии с Дач комитет по этике для экспериментов на животных.

1. Подготовка мыши для видео-окулография. Для измерения движения глаз мыши, глава мышь должна быть обездвижен. Таким образом, строительство постамента сделан на череп мыши (рис. 1).
   1. Анестезию мыши смесью ИФ (isofluran 1-1,5%; Rhodia Органический изобразительных Ltd, Франция) и кислорода в газовой камере. Чрезмерное газа очищена. Поддержание анестезии через носовой конус. Подтвердите глубины анестезии с помощью ног крайнем случае.
   2. Поддержание температуры тела на 37 ° C с использованием анальный термодатчик и грелки (ФЭК Bowdoinham, ME).
   3. Защитите глаза, покрывая их глазная мазь (duratears, Alcon, Бельгия). Бритье спинной черепной меха, и очистить хирургические области с вращением от кустарника и betadinэлектронной или раствора хлоргексидина.
   4. Сделайте надрез средней линии, чтобы разоблачить спинной черепной поверхности черепа. Сделать поверхность чистая и сухая.
   5. Нанесите каплю фосфорной кислоты (фосфорная кислота гель травителя 37,5%; Керр, штат Калифорния) на спинной черепной поверхности черепа, темя для лямбда. Удалить травителя через 15 секунд и сделать черепной поверхности очистить физиологическим раствором и сухой снова.
   6. Нанесите на вершине этой травления черепной поверхности капли OptiBond премьер (Kerr, CA) и воздушно-сухой в течение 30 секунд.
   7. Поместите каплю клея OptiBond (Kerr, Калифорния), в верхней части OptiBond премьер и лечение светом в течение 1 минуты (Maxima 480 видимый блок лечение светом, Генри Шайн, США).
   8. Накройте клеевого слоя с тонким слоем харизмы композитный (Heraeus Kulzer, Германия). Вставить две соединенные гайки (диаметром 3 мм) в композиции. Лечение составной потом со светом. При необходимости применять дополнительные слои композита и вылечить их с помощью света.
   9. ОбъявлениеМинистр бупренорфин (0,015 мг / кг, подкожно) для послеоперационного обезболивания. Животное должно быть на ноги в течение примерно 5 мин. Позвольте мыши восстановить в доме клетку при комнатной температуре в течение 3 дней после операции.
2. Видео-окулография установки для мыши (рис. 2).
   1. Наведите на фиксатор и зафиксировать голову фиксатор двумя винтами (рис. 1). Мышь не должна быть анестезии для этой процедуры. Запретительные время не должно превышать 1 часа / день.
   2. Установите мышь головы и тела фиксатор на платформе XY, которая в свою очередь крепится на поворотном круге (диаметр 60 см). Использование платформы XY мыши голова может быть размещен над центром проигрывателя. Мышь может быть перемещена на поле, рыскания и крена оси. Глава мышь находится в правильном тангажа, рыскания и крена, совмещая глазом с помощью визуального образа глаз порожденных ISCAN систем. Кроме того, строительство постамента могут быть размещены на голову мыши в стереотаксической раме ^11.
   3. Проигрыватель подключен к AC серво-управляемый двигатель (Harmonic Drive AG, Нидерланды) и положения поворотного стола контролируется потенциометром (Bourns Inc., Штат Калифорния), подключенных к проигрыватель оси.
   4. Цилиндрический экран окружающих (диаметр 63 см, высота: 35 см) со случайным точечный узор (каждый элемент 2 °) покрывает проигрыватель, это барабан оснащен AC серво-управляемый двигатель (Harmonic Drive AG, Нидерланды) . Положение цилиндрический экран контролируется потенциометром (Bourns Inc., Штат Калифорния), который прилагается к его оси, и на экране может быть освещена галогенной лампы (20 Вт). И окружающие экран и проигрыватель управляются независимо друг от друга.
   5. Движение проигрывателя и окружающие экран управляется компьютером, который подключен к I / O интерфейс (ЦЭР ограничены, Кембридж, Великобритания). ТаBLE и окружающие сигналы положение на экране фильтруется (частота среза 20 Гц), оцифрованные интерфейс ввода / вывода и хранящиеся на этом компьютере.
   6. Глаз мыши подсвечивается тремя инфракрасными излучателями (600 мВт, угол дисперсии: 7 °, максимальная длина волны 880 нм, RS компонентов, Нидерланды). Два инфракрасных излучателей крепятся к поворотным столом и третий излучатель крепится к камере. Этот третий излучатель производит ссылку роговицы отражения (КР), которая используется во время процедуры калибровки и во время записи движения глаз.
   7. Инфракрасная камера оснащена ПЗС-зум (Zoom 6000, Navitar Inc., Нью-Йорк) крепится к проигрыватель и ориентирована на мышь головой в центр поворотного стола. Камера может быть разблокирован и может быть yawed о проигрыватель ось более точно 20 ° во время процедуры калибровки.
   8. Видеосигнал обрабатывается системой отслеживания глаз (ETL-200, ISCAN, Берлингтон, штат Массачусетс). ISCAN система использует алгоритмритма для отслеживания центров ученика и ссылки ЧР. Система может отслеживать ученика и ссылки CR в горизонтальном и вертикальном направлении на частоте дискретизации 120 Гц.
   9. Ссылка CR позиции, позиции ученика и сигналы размер зрачка в цифровую форму на I / O интерфейс и хранятся в одном файле в виде таблицы и окружающие сигналы положение на экране. Видео ученик системы отслеживания вызывает задержку движения глаз сигналы приблизительно 27 мс.

2. Калибровки и измерений движения глаз с помощью видео ученик слежения

Система отслеживания глаз улавливает движение зрачка, как поступательное движение. Поступательное движение гусеничных ученика содержит трансляционной компоненты в связи с осевой разница между вращательными центре глаза и анатомический центр глаза (например, центр кривизны роговицы), а вращательный компонент в связи с углового вращения глазного яблока. По вычитаниев G ссылкой CR от движения ученика / должность, нежелательные поступательной компонент удаляется из сигнала, в результате поступательного движения, что только за счет вращения глазного яблока. Хотя они часто очень мало, это вычитание также устраняет переводы между головкой и камерой. Остаточная изолированных поступательное движение преобразуется в угловое вращение глазного яблока по следующей методике калибровки ^8,12. Эта калибровка была выполнена до любого эксперимента движения глаз.

1. Отрегулируйте положение мыши голову на камеру таким образом, что видео изображение зрачка находится в центре монитора и, что представление ссылка CR расположен на вертикальной средней линии глаз желательно непосредственно над зрачком. Минимизировать движения ссылкой ЧР в связи с углового вращения камеры, которая может быть достигнуто путем размещения в центре кривизны роговицы над камерой / таблица оси.
2. Повернуть камеру несколько раз в пределах + / - 10 ° (т.е. 20 градусов от пика до пика) вокруг вертикальной оси поворотного стола. Используйте позиции гусеничных ученик (P) и ссылка CR записано в крайних положениях поворота камеры для расчета радиуса вращения ученика (Rp, Rp = Δ / грех (20 °), где Δ = (CR -P), см. рис 3А).
3. В связи с тем, что значение Rp зависит от размера зрачка, коррекция размера зрачка должно быть реализовано ¹² (рис. 3В). Повторите шаг 2,2 раз при различных условиях освещения (например, манипулируя размер зрачка, рис 3C) для того, чтобы определить размер зрачка - Rp отношения и составляют кривую Rp коррекции (рис. 3). Величина Rp также зависит от вертикального положения глаз. Если эксперимент приведет к вертикальным движениям глаз, то коррекция калибровки вертикальном положении глаз настоятельно рекомендуется13.
4. Определить угловое положение глаз (E), измеряя положение ссылка CR, P положение и размер зрачка. Позиция ссылки CR вычитается из позиции ученика создании поступательного свободное место ученика. Измеряя размер зрачка значение Rp можно извлечь из кривой коррекции Rp и Е можно рассчитать по следующей формуле E = {арксинус (Δ1) / Rp} (рис. 4а, где Δ1 = (P _{2-P 1)} и P ₁ и P ₂ корректируется путем вычитания ссылкой CR).
5. Большой репертуар проигрыватель и / или окружающей вращения экрана теперь может быть использована для стимулирования глазодвигательных системы. В целях выполнения окулография видео в темноте, мыши глаз необходимо предварительно с мейоза наркотиков ограничить расширение зрачка и позволяет ученику слежения в этих условиях. В наших экспериментах мы используем пилокарпин (4%, лаборатории Chauvin, Франция), чтобы ограничить расширение ученика втемное время суток.

3. Анализ данных

1. Глаз позиций, позиций таблицы и окружающих позиции экрана все преобразуется в угловое положение (см. рисунок 4B и формула 2.4). Глаз сигналы с поправкой на их задержки 27 мс, индуцированной визуализации обработки ученик-системы слежения.
2. Угловые позиции глаз, стол и окружающие экрана различаются и фильтруют с Баттерворта низкочастотный фильтр, используя частотой среза 20 Гц.
3. Саккады удаляются из глаза сигнал скорости помощью порог 40 ° / с. Данные удаляются, начиная с 20 мс до и до 80 мс после пересечения порога обнаружения.
4. Таблица, окружающие экран и сигналы глаз скорости усредняются использования каждого цикла в след (рис. 4С).
5. Усредненные сигналы оснащены соответствующую функцию. В общем, синусоидальной стимуляции скорость которого используется, и усредненныйциклы оснащены синус или косинус функцию (рис. 4С). Затем, прирост может быть вычислен как отношение скорости глаза на стимулы скорости, в то время как фаза может быть вычислена как разность (в градусах) между скоростью глаза и стимул скорости.

4. Представитель Результаты

Видео-окулография может быть использован для исследования различных форм глазодвигательных выступления (т.е. оптокинетическую рефлекс: ОКР; вестибулоокулярный рефлекс: VOR, визуально расширенные вестибулоокулярный рефлекс: VVOR), а также моторное обучение (VOR адаптации; ОКР адаптации). ОКР компенсирует низкочастотные возмущения использованием визуальной обратной связи. ОКР может быть вызвано вращением хорошо освещенной окружающей экран (видео 1). Поворот экрана окружающих в частотном диапазоне 0,2 -1,0 Гц с амплитудой 1,6 ° показывает, как оптокинетическую система является более эффективной компенсаторный механизм в низкочастотном диапазоне тхап в высокочастотном диапазоне (рис. 5а). VOR компенсирует высокочастотную движениям головы с помощью сигналов от вестибулярных органов. VOR может быть вызвано вращением животных (например, проигрыватель) в темноте (фильм 2). Вращение поворотного стола в диапазоне частот 0,2 -1,0 Гц с амплитудой 1,6 ° демонстрирует вестибулоокулярного система является более эффективной в создании компенсирующих движений глаз в высокочастотном диапазоне, чем в низкочастотном диапазоне (рис. 5а) . Когда оптокинетическую и вестибулоокулярного системы действуют совместно, изображения могут быть стабилизированы на сетчатке в широком диапазоне движений головы. Вращение поворотного стола в диапазоне частот 0,2 -1,0 Гц с амплитудой 1,6 °, в то время как окружающие экран хорошо освещенной (фильм 3) показывает, как глаз порождает «высокий коэффициент усиления" компенсирующие движения во всем диапазоне частот (рис. 5А ). Все эти выгоды и телазы значения характерны для мышей, хотя пол ¹⁴ и штамм ^15,16,17 различий не было.

Независимый контроль за проигрыватель и окружающие экран позволяет противостоять мышей с несоответствием между визуальным и вестибулярной информации. После того, как долгосрочное и равномерное воздействие визуального несоответствия и вестибулярной информации, VOR указателя мыши изменится для компенсации измененной визуальной информации (VOR адаптации; Movie 4). Вращение поворотного стола по фазе (т.е. 180 °) с окружающими экран (1 Гц, 1,6 °) увеличивает усиление VOR (рис. 5В). Максимальное изменение усиления VOR, при использовании одного испытания обучения парадигмы, часто достигается через 30 минут.

Рисунок 1. Схематическое изображение мыши голова и тело фиксатор. Корпус мыши сдерживается использованиецилиндрические трубки диаметром 35 мм. Глава мыши иммобилизованной путем подключения пьедестала мыши на железный прут с двумя винтами. Железный прут под углом в 30 градусов для того, чтобы расположить голову мыши в нормальной тональности во время передвижения. *, Вид сверху на пьедестал, содержащий два ореха.

Рисунок 2. Схематическое изображение мышью видео-окулография установки.

Рисунок 3. Калибровка видео ученик-системы слежения. А) камера поворачивается несколько раз в пределах + / - 10 ° (т.е. 20 градусов от пика до пика) вокруг вертикальной оси поворотного стола. Гусеничный ученик (P) и ссылка роговицы отражения (CR), записанные в крайних положениях поворота камеры используются для расчета радиуса вращения ученика(RP). Б) радиус диаметр зрачка зависит от размера зрачка. C) Пример, демонстрирующий влияние на размер зрачка ученика положение во время процедуры калибровки (как измеряется в пикселях (рх)). D) Взаимосвязь между Rp и диаметр зрачка измеряется в одной мыши. Тринадцать учеников разных диаметров были достигнуты путем изменения интенсивности окружающего освещения.

Рисунок 4. Измерение и анализ движения глаз с помощью видео ученик слежения. А) угловое положение ученика рассчитывается исходя из радиуса зрачка (RP) и положение ученика (P, с поправкой на положение CR). B) Пример компенсационных движения глаз индуцированных стимулирования вестибулярной и зрительной системе (визуально расширение VOR). Проигрывателя вращался синусоидально 0,6 Гц с амплитудой 1,6 °, в то время как окружающие экран был хорошо освещен. C) Анализ записипоказано в B). График показывает усредненную след скорость проигрывателя (синий) и ученика (красный). Эти усредненные следы были оснащены синусоидальной функции (черный).

Рисунок 5. Производительность и обучения глазодвигательного системы измеряются в одной C57Bl6 мыши. А) Движения глаз генерируются вращения окружающих экрана (оптокинетическую рефлекс: ОКР, верхние панели), поворачивая мышь в темноте (вестибулоокулярный рефлекс: VOR, средняя панель) и, поворачивая мышь в свет (визуально повышенной вестибулоокулярный рефлекс: VVOR, нижняя панель) с частотами от 0,2 до 1,0 Гц с амплитудой 1,6 °. Усиление рефлекса рассчитывается как отношение скорости глаза на стимулы скорости (слева панели) и фаза рефлекса вычисляется разность фаз между скоростью глаза и стимул скорости (справа панели). B) Мотор обучение осуществлялось адаптивного повышения VOR использованием в фазе парадигмы обучения. Мышь подвергается visuovestibular парадигма обучения, в которых вращение мыши вышел из фазы (180 °) с вращением окружающих экран (как вращающийся на 1,0 Гц, 1,6 °) в течение сорока минут. Каждые 10 минут VOR был проверен (1,0 Гц, 1,6 °). В этом мыши не в фазе подготовки увеличила прибыль VOR.

Фильм 1. Анимация показывает, что парадигма вызывает ОКР у мышей Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 2. Анимация показывает, что парадигма вызывает VOR у мышей. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Фильм 3. Анимация показывает, что парадигма вызывает VVOR у мышей..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 4. Анимация показывает visuovestibular в фазе подготовки парадигмы, которая вызывает VOR адаптации (увеличение) у мышей. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Обсуждение

Для получения видео высокого качества записи движений глаз у мышей несколько требований необходимо. Процедура калибровки должна быть выполнена в вышеупомянутых стандартизированных вопрос. Например, за пределами центра калибровки, когда ученик находится не на вертикальной средней линии со ссылкой CR во время процедуры калибровки, приведет к недооценке RP и, следовательно, переоценке движения глаз. Кроме того, мы рекомендуем интеграции коррекции размера зрачка метод калибровки ^12, потому что исследования, которые показывают очень стабильный размер зрачка, очень редки. Даже небольшой стресс во время судебного разбирательства может уже изменить диаметр зрачка существенно.

При разработке эксперимента движения глаз, следующие факторы должны быть приняты во внимание или под контролем, потому что они, как известно, влияет на ответ движение глаз: возраст ^13,18, пол ¹⁴ и штамм ^15,16, 19. Кроме того, экспериментальные животные должны быть пигментированы ирисы, поскольку обнаружение и сопровождение ученика невозможно, когда контраст между учеником и радужной оболочки является слишком низкой, как в BALB / с мышью. Очень нервный или тревоги животные должны быть обучены, до эксперимента, чтобы привыкнуть к экспериментальной установки и сдержанный состоянии. Это животное обработки процедура приводит к меньшему закрытия или полу-закрытие глаз и препятствует генерации глаз жидкости во время эксперимента, и, следовательно, лучше ученик слежение осуществляется.

Наконец, сбора и анализа данных требуется два-три часа на одно животное. Таким образом, записи движения глаз, вероятно, останется конкретные процедуры, применяемой в избранное мышей, и не подходят в качестве скринингового теста высокой пропускной способностью.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Isofluran	Rhodia Органический изобразительных ООО
Грелки	FHC	40-90-8
Duratears	Alcon
Гель фосфорной кислоты	Керр	31297
OptiBond премьер	Керр	35369
OptiBond клей	Керр	35369
Харизма композитных	Heraeus Kulzer
Maxima 480 фотополимеризации блок	Генри Шайн
AC серво-управляемый двигатель	Harmonic Drive AG
Cylindric экран
Галогенная лампа (20 Вт)	RS Components
Потенциометры (точность)	Bourns Inc.	6574
Мощность 1401 (интерфейс ввода / вывода)	КНИ ограниченной
Компьютеры	Лощина
Инфракрасный emmitters	RS Components	195-451
ETL-200	ISCAN
Зум (увеличение 6000)	Navitar вкл.
Pilocarpinenitrate (гран)	Лаборатория Chauvin