마우스의 비디오 - oculography

요약

비디오 - oculography 아주 양적 안구 모터의 성능을 조사하는 방법뿐만 아니라 모터 학습입니다. 여기서는 생쥐에서 비디오 oculography을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 정상에서이 기술을 적용 pharmacologically - 치료 또는 유전자 변형 생쥐 것은 모터 행동의 기본 생리를 탐험하기 위해 강력한 연구 도구입니다.

초록

안구의 움직임은 객체를 추적하거나 운동하는 동안 망막에 이미지를 안정화하기 위해 매우 중요하다. 같은 마우스와 같은 fovea없는 동물은, 대상에 자신의 눈을 주시하는 제한된 능력을 가지고. 이러한 목표 감독 안구의 움직임와는 달리, 보상 안구 안구의 움직임을 쉽게 afoveate 동물 ^1,2,3,4에 elicited있다. 보상 안구 움직임은 눈의 근육을 운전하는 명령 신호로 vestibular 및 optokinetic 정보 처리에 의해 생성됩니다. vestibular 및 optokinetic 정보의 처리는 oculomotor 시스템 적자의 사양을 수 있도록 별도로 함께 조사 할 수 있습니다. oculomotor 시스템 optokinetic 반사 (OKR), vestibulo - 안구 반사 (보르) 또는 시각적으로 향상된 vestibulo - 안구 반사 (VVOR)을 evoking하여 테​​스트 할 수 있습니다. 보르는 반사적 눈 미터 반면 OKR은 망막에서 "전체 필드"이미지의 움직임에 대한 보상 반사 운동이다머리의 움직임을 보상 ovement. VVOR는 적절한 보상을 만들뿐만 optokinetic 정보 등 모두 vestibular를 사용하여 반사 안구 운동입니다. 소뇌는 모니터링하고 이러한 보상 안구의 움직임을 조정할 수 있습니다. 따라서 oculography뿐만 아니라 병적인 조건 (vestibular, 안구 및 / 또는 소뇌 원산지 FE)에서 정상 아래 뇌 - 행동의 관계를 조사하기위한 매우 강력한 도구입니다.

oculomotor 시스템을 테스트, 행동 패러다임으로서, 여러 가지 이유가 흥미롭습니다. 첫째, oculomotor 시스템은 잘 이해 신경 시스템 ^5. 둘째, oculomotor 시스템은 상대적으로 간단한 ^{여섯이다;} 가능한 안구 운동의 금액은 그 공 - 인 - 소켓 아키텍처 ( "단일 공동")과 엑스트라 안구 근육 ⁷ 삼쌍에 의해 제한됩니다. 셋째, 행동 출력과 감각 입력을 쉽게 정량이 높은 접근 시스템을지게하고, 측정 가능분석 ^8. 많은 행동 검사 양적 능력이 높은 수준의 부족합니다. 그리고 마지막으로, oculomotor 시스템의 양쪽 성능뿐만 아니라 소성가있게 테스트할 수 학습과 기억 과정 ^{9 일} 연구.

유전자 변형 생쥐는 최근 널리 사용할 수 있으며 그들은 다양한 수준의 ^10시 뇌 기능의 탐사를위한 중요한 원천을 형성하고 있습니다. 또한, 그들은 모델이 인간의 질병을 모방하는 데으로 사용할 수 있습니다. 정상에 oculography 적용 pharmacologically - 치료 또는 유전자 변형 생쥐 것은 정상과 병적인 조건에서 모터 행동의 기본 생리를 탐험하기 위해 강력한 연구 도구입니다. 여기서는 쥐를 ⁸ 비디오 oculography을 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 준비

다음 실험은 동물 실험에 대한 Duch 윤리위원회에 따라 실시되었다.

1. 비디오 oculography 위해 쥐를 준비. 마우스의 눈 움직임을 측정하기 위해서는 마우스의 머리는 고정해야합니다. 따라서, 페데 스탈 건설은 마우스 두개골 (그림 1)에서 이루어집니다.
   1. 와 가스실에서 산소, isoflurane의 혼합물 (Rhodia Organique 파인 (주), 프랑스 isofluran 1-1.5 %)으로 마우스를 마취. 과도한 가스 청소한다. 코 콘을 통해 마취를 유지합니다. 발가락이 핀치를 통해 마취의 깊이를 확인합니다.
   2. 항문 thermosensor의 사용과 손난로 (FHC, Bowdoinham, ME)에서 37 ° C에서 체온을 유지합니다.
   3. 눈 연고 (duratears, Alcon, 벨기에)와 그들을 취재하여 눈을 보호합니다. 지느러미 두개골 모피를 면도하고, 스크럽과 betadin의 회전 외과 영역을 청소전자 또는 chlorhexidine 솔루션입니다.
   4. 두개골의 지느러미 두개골 표면을 노출 중간 라인 절개를합니다. 표면이 깨끗하고 건조합니다.
   5. bregma에서 람다의 두개골 지느러미 두개골 표면에, 인산 (커, CA 인의 산성 젤 에천트 37.5 %)의 방울을 적용합니다. 15초 후 에천트를 제거하고 두개골 표면이 다시 염분 및 건조와 함께 청소합니다.
   6. 이 에칭처리된 두개골 표면 OptiBond 소수의 방울 (커, CA)와 30 초 동안 그것을 공기 건조의 상단에 적용합니다.
   7. OptiBond 소수의 꼭대기에서 OptiBond 접착제 (커, CA)의 방울을 놓고 1 분 (맥시멈 480 가시 광선의 경화 장치, 헨리 Schein, 미국)의 빛으로 치료.
   8. 카리스마 합성 (Heraeus Kulzer, 독일)의 얇은 층과 접착 층을 커버. 합성의 두 개의 연결된 너트 (지름 3mm) 포함시킵니다. 라이트와 합성 나중을 치료. 필요한 경우 복합의 추가 레이어를 적용하고 밝은 그들을 치료.
   9. 광고수술 진통제에 대한 장관 buprenorphine (0.015 밀리그램 / kg, SC). 동물은 약 ​​5 분 이내에 힘으로 돌아갈 겁니다. 마우스 수술 후 최소 3 일간 상온에서 홈 새장에 복구하도록 허용합니다.
2. 생쥐를위한 비디오-oculography 설정 (그림 2).
   1. restrainer에 마우스를 놓고 두 개의 나사 (그림 1)에 의해 restrainer로 머리를 고정시킨다. 마우스가이 절차에 대한 anesthetized 될 필요가 없습니다. 금지 시간은 1 시간 / 일 초과할 수 없습니다.
   2. 나아가 턴테이블 (60cm 직경)에 따라 마운트되어 XY 플랫폼에서 마우스 머리 앤 바디 ​​restrainer를 탑재합니다. XY 플랫폼 사용 마우스 머리는 턴테이블의 중앙 위에 배치될 수 있습니다. 마우스는 피치, 편요각 및 롤 축 위에 이동할 수 있습니다. 마우스의 머리는 ISCAN syste에 의해 생성된 눈의 영상을 사용하여 시선을 정렬하여 정확한 피치, 편요각 및 롤 각도에 배치됩니다줄게. 양자 택일로, 페데 스탈 건설은 stereotactic 프레임 ^11에 마우스의 머리에 둘 수 있습니다.
   3. 턴테이블은 AC 서보 제어 모터 (고조파 드라이브 AG, 네덜란드)와 ​​턴테이블의 위치에 붙어있다는 턴테이블 축에 부착된 전위 차계 (Bourns INC., CA)에 의해 모니터링된다.
   4. 원통 주위의 화면 (지름 : 63cm, 높이 : 35 ㎝) 임의의 점선 패턴 (각 요소 2 °)와 함께 턴테이블을 커버,이 드럼은 또한 AC 서보 제어 모터 (고조파 드라이브 AG, 네덜란드)을 갖추고있다 . 원통형 스크린의 게재 순위는 축과 화면 할로겐 조명 (20 와트)에 의해 점등 수에 부착된 전위 차계 (Bourns INC., CA)에 의해 모니터링된다. 주변 스크린과 턴테이블 모두 독립적으로 구동됩니다.
   5. 턴테이블과 주변 화면의 움직임은 I / O 인터페이스 (CED 제한, 캠브리지, 영국)에 연결된 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 고마워, I / O 인터페이스에 의해 디지털 처리되고이 컴퓨터에 저장 : 경과 주변 화면 위치 신호 (20 Hz에서 컷 - 오프 주파수) 필터링됩니다.
   6. 마우스의 눈으로 세 적외선 방사체가 켜져있는 (600 MW, 분산 각도 : 7 °, 최대 파장 : 880 nm의, RS 부품, 네덜란드). 두 개의 적외선 방사체는 턴테이블에 고정되며 세 번째 방출은 카​​메라에 첨부되어 있습니다. 이 세 번째 에미터는 교정 절차를 수행하는 동안과 안구 운동 녹음시 사용되는 참조 각막 반사 (CR)를 생산하고 있습니다.
   7. 줌 렌즈 (줌 6000 Navitar INC., NY)이 장착된 적외선 CCD 카메라는 턴테이블에 첨부되어 턴테이블의 중앙에 마우스 머리에 주력하고 있습니다. 카메라 보정 절차 동안 정확히 20 ° 이상의 잠금을 해제 할 수 있으며, 턴테이블의 축에 대해 yawed 수 있습니다.
   8. 비디오 신호는 안구 추적 시스템 (ISCAN ETL-200, 벌링턴, MA)에 의해 처리됩니다. ISCAN 시스템은 뭔가를 사용하여학생 및 참조 CR의 센터를 추적할 rithm. 시스템은 120 Hz의 샘플 속도로 수평 및 수직 방향으로 학생과 참조 CR을 추적할 수 있습니다.
   9. 참조 CR 위치, 동공 위치와 동공 크기의 신호는 I / O 인터페이스에 의해 디지털화되며 테이블과 주변의 화면 위치 신호와 같은 파일에 저장됩니다. 동영상 동공 추적 시스템은 약 27 MS의 안구 운동 신호의 지연을 유도합니다.

2. 동영상 학생 추적을 사용하여 눈 움직임을 보정 및 측정

안구 추적 시스템 translational 모션으로 동공의 움직임을 캡처합니다. 추적 학생의 translational 움직임은 눈의 회전 중심과 안구 (각막 곡률 즉, 중심)의 해부 센터, 안구의 각도 회전에 의한 회전 성분 사이의 축방향 차이로 인해 translational 구성 요소를 포함하고 있습니다. 빼기으로학생 운동 / 위치에서 참조 CR을 접근한, 바람직하지 translational 성분은 안구의 회전에 의한 것입니다 translational 모션 그 결과 신호로부터 제거된다. 그들은 종종 아주 작은 있지만이 뺄셈도 머리와 카메라 사이의 번역을 없애줍니다. 잔여 절연 translational 운동은 다음과 같은 보정 방법 ^8,12에 의해 안구의 각도 회전으로 변환됩니다. 이 교정은 어떤 안구 운동 실험 이전에 수행되었다.

1. 동공의 비디오 이미지가 모니터의 중간에 위치하고 참조 CR의 표현은되도록이면 직접 학생 위 안구의 수직 중간선에 위치하고있는 것을 같은 방법으로 카메라에 마우스 머리의 위치를​​ 조정합니다. 때문에 카메라 / 테이블 축을 통해 각막 곡률 중심을 배치하여 수행할 수 있습니다 각운 카메라 회전에 참조 CR의 움직임을 최소화합니다.
2. 10 ° (즉, 20도에서 최대 피크) 턴테이블의 수직 축을 중심으로 - + / -로 카메라를 여러 번 회전합니다. (학생의 회전 반경을 계산하는 카메라 회전 극단적인 위치에 기록된 추적 동공 (P) 및 참조 CR의 위치를​​ 사용하여 RP; RP = Δ / 죄악 (20 °), Δ = (CR -P),) 그림 3A 참조하십시오.
3. RP 값이 동공 크기에 의존한다는 사실로 인해 동공 크기 보정 ¹² (그림 3B) 구현해야합니다. RP 관계를하고 RP 보정 곡선 (그림 3D)를 작성 - 동공의 크기를 결정하기 위해, (그림 3C 즉, 동공 크기를 조작) 다양한 조명 조건에서 2.2 여러 번 단계를 반복합니다. RP 가치도 수직 안구의 위치에 따라 달라집니다. 실험 수직 안구 운동을 일으킬 것입니다 그렇다면 수직 안구 위치에 대한 보정의 보정이 매우 추천입니다13.
4. 참조 CR 위치, P의 위치와 동공 크기를 측정하여 안구 (E)의 각도 위치를 결정합니다. 참조 CR 위치는 translational 무료 동공 위치를 생성 동공 위치에서 빼는됩니다. 동공 크기를 측정하여 RP 값이 RP 보정 곡선에서 추출 수와 E는 다음과 같은 수식을 사용하여 계산할 수 E = arcsin {(Δ1) / RP} (그림 4A, 어디 Δ1 = (P ₂ - P ₁₎ 및 P _1과 P ₂₎ 참조 CR의 뺄셈에 의해 해결된다.
5. 턴테이블 및 / 또는 주변의 화면 회전의 대형 레퍼토리는 이제 oculomotor 시스템을 자극하는 데 사용할 수 있습니다. 어둠 속에서 비디오 oculography을 수행하기 위해서는 마우스 눈은 동공 팽창을 제한하고 이러한 상황에서 학생 추적을 허용하는 miotic 약물로 pretreated해야합니다. 우리의 실험에서 우리는 pilocarpine (4 %, 연구소 Chauvin, 프랑스)에서 동공 팽창을 제한하기 위해 사용어둠.

3. 데이터 분석

1. 눈 위치, 테이블 위치와 주변 스크린 순위는 모두 (2.4에서 그림 4B와 수식 참조) 각도 위치로 변환됩니다. 안구 신호 학생 추적 시스템의 이미징 처리에 의해 27 MS 유도들의 지연을 위해 수정하고 있습니다.
2. 눈, 테이블과 주변 스크린의 각도 위치는 차별 및 20 Hz의 주파수 해제 잘라내기를 사용 버터월스 로우 - 패스 필터로 걸러집니다.
3. Saccades는 40 ° / s의 탐지 임계값을 사용하여 안구 속도 신호에서 제거됩니다. 데이터가 감지 임계값을 건너 후 20 MS 80 이전까지 MS부터 제거됩니다.
4. 표, 주위의 화면과 눈의 속도 신호는 흔적 (그림 4C)에서 각각의 사이클을 사용하여 평균하고 있습니다.
5. 평균 신호는 적절한 기능을 장착하고 있습니다. 일반적으로 sinusoidal 속도 자극을 사용하여 평균하고 있습니다주기는 부비동이나 cosinus 함수 (그림 4C)가 장착되어있다. 단계는 눈의 속도와 경기 부양 속도의 차이 (온도)로 계산할 수 있습니다 반면 그런 이득은 경기 부양 속도로 안구 속도의 비율로 계산할 수 있습니다.

4. 대표 결과

뿐만 아니라 모터 학습 (보르 적응, OKR 각색) 비디오-oculography 다양한 oculomotor 공연의 형태를 (; :; 보르 시각적으로 향상된가 vestibulo - 안구 반사 VVOR vestibulo - 안구 반사 OKR 즉 optokinetic 반사) 조사하는 데 사용할 수 있습니다. OKR 시각적 피드백을 사용하여 저주파 방해 보상. OKR은 잘 조명 주변 화면 (동영상 1) 회전에 의해 유도된 수 있습니다. 1.6 °의 진폭과 0.2 -1.0 Hz의 주파수 범위 주위의 화면을 회전하면 optokinetic 시스템이 낮은 주파수 범위 THA에서보다 효율적인 보상 메커니즘입니다 방법을 보여줍니다N 높은 주파수 범위 (그림 5A). 보르는 vestibular 기관에서 신호를 사용하여 고주파 헤드의 움직임에 대한 보상. 보르은 (영화 2) 어둠 속에서 동물 (즉 턴테이블)를 회전하여 유도된 수 있습니다. 1.6 °의 진폭과 0.2 -1.0 Hz의 주파수 범위에서 턴테이블을 회전하면 (그림 5A) vestibulo-안구 시스템이 낮은 주파수 범위보다 높은 주파수 범위에서 보상 안구의 움직임을 생성하는보다 효율적인 방법을 보여줍니다 . 콘서트에서 optokinetic 및 vestibulo - 안구 시스템 행위는 이미지가 헤드 움직임의 광범위한 범위에서 망막에 안정 수납니다. 주변 화면이 잘 켜져있는 동안, 1.6 °의 진폭과 0.2 -1.0 Hz의 주파수 범위에서 턴테이블을 회전하면 (영화 3) 눈이 전체 주파수 범위 이상의 "하이 게인"보상 운동을 (그림 5A 생성 방법을 보여줍니다 ). 이 모든 이득과 산도성별 ¹⁴ 변형 ^15,16,17 차이가보고되었다지만 ASE 값은, 마우스를위한 전형입니다.

턴테이블 및 주변 화면이 이상의 독립적인 컨트롤은 우리 시각과 vestibular 정보 간의 불일치로 쥐를 직면 수 있습니다. 일치하지 않는 시각과 vestibular 정보의 장기와 균일한 노출 후 마우스 보르가 변경된 영상 입력 (; 영화 4 보르 적응)에 대한 보상으로 변경됩니다. 주변 화면 (1 Hz에서 1.6 °)로 (즉, 180 °) 단계의 턴테이블을 회전하면 보르 게인 (그림 5B)을 증가시킵니다. 보르 이득의 최대한의 변화는 한 시범 학습 패러다임을 사용할 때, 종종 30 분 후에 도달된다.

그림 1. 마우스 머리 앤 바디 restrainer의 도식 그리기. 마우스의 시신은 사용하고 구속되어35mm의 직경을 가진 플​​라스틱 원통형 튜브. 마우스의 머리는 두 개의 나사와 철제 막대에 마우스의 받침대를 연결하여 고정합니다. 철 막대 ambulation 동안 정상적인 피치에 마우스의 머리를 배치하기 위해 30 도의의 각도를 만듭니다. * 두 개의 너트를 포함한 받침대 위에 볼 수 있습니다.

그림 2. 마우스 비디오 oculography 설정의 도식 그림.

그림 3. 동영상을 학생 추적 시스템의 보정. 10 ° (즉, 최대 20도 피크) 턴테이블의 수직 축을 중심으로 -) 카메라는 + / -에 의해 회전을 여러 번있다. 추적 동공 (P) 및 카메라 회전 극단적인 위치에 기록된 참조 각막 반사 (CR)은 학생의 회전 반경을 계산하는 데 사용됩니다(RP). B) 동공 직경의 반경은 동공의 크기에 따라 달라집니다. C) 예 (두 픽셀 (픽셀 단위로 측정)) 보정 절차 동안 동공 순위에 동공 크기의 효과를 보여주고 있습니다. D) RP와 동공 직경 사이의 관계는 한 번의 마우스로 측정. 열세 가지 동공 지름은 주변 빛의 강도를 변경하여 수행되었다.

그림 4. 측정 및 동영상 동공 추적을 사용하여 안구의 움직임을 분석. CR 위치에 대해 수정);) 각도 동공 위치가 학생의 반경 (RP)과 학생의 위치 (P로부터 계산됩니다. B) 보상 안구 운동의 예 vestibular 및 영상 시스템 (시각 향상된 보르)을 자극하여 유도된. 주변 화면이 잘 켜지지 동안 턴테이블은 1.6 °의 진폭과 0.6 Hz에서에서 회전 sinusoidally했습니다. C) 녹음의 분석) B에 표시됩니다. 그래프 턴테이블 (파란색)과 동공 (적색)의 평균 속도 추적을 보여줍니다. 이러한 평균 추적은 sinusoidal 함수 (검정)과 함께 장착했다.

그림 5. 성능 하나 C57Bl6 마우스로 측정 oculomotor 시스템을 학습. (vestibulo - 안구 반사 어둠 속에서 마우스를 회전하여 OKR, 상단 패널) : 보르, 중 판넬) 및 (시각 빛 가운데 마우스를 회전하여) 안구의 움직임은 주변 화면 회전 (optokinetic 반사에 의해 생성되는 강화된 vestibulo - 안구 반사 : 0.2에서 1.6 °의 진폭에서 1.0 Hz에서에 이르기까지 다양한 주파수와 VVOR, 하단 패널). 반사의 이득은 경기 부양 속도로 안구 속도의 비율 (왼쪽 패널)와 반사의 단계로 계산되었다 눈의 속도와 경기 부양 속도 (오른쪽 패널) 사이의 위상 차이로부터 계산되었다. B) 모터 학습하여 수행되었다 adaptively 위상 교육 패러다임의 아웃을 사용 보르도 증가합니다. 마우스는 마우스의 회전 마흔 분 동안 주변 스크린 (1.0 Hz에서 1.6 °의 회전 모두)의 회전과 상 (180 °) 떨어 졌있는 visuovestibular 교육 패러다임의 대상이었다. 10 분마다 보르는 (1.0 Hz에서 1.6 °) 테스트되었습니다. 이 마우스에는 위상 연수 밖 보르 게인을 증가했다.

영화 1. 생쥐에서 OKR을 유도 패러다임을 보여주는 애니메이션은 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

영화 2. 생쥐에서 보르을 유도 패러다임을 보여주는 애니메이션. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

생쥐의 VVOR을 유도 패러다임을 보여주는 영화 3. 애니메이션..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "대상 ="_blank "> 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 4. 생쥐의 보르 적응 (증가)를 유도 위상 교육 패러다임의 visuovestibular 밖을 보여주는 애니메이션. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

생쥐에서 고품질의 비디오 안구 운동 녹음을 얻기 위해서는 몇 가지 요구 사항이 필요합니다. 교정 절차는 위에서 언급한 표준 물질로 진행해야합니다. 예를 들어 중심을 벗어난 교정은 학생이 교정 절차를 수행하는 동안 참조 CR과 수직 중간선에 위치하지 않는 경우, 라인란트의 싼 견적 및 안구 운동의 결과적으로 과대 평가가 발생합니다. 매우 안정 동공의 크기를 보여 시도는 매우 드문이기 때문에 더욱이, 우리는 교정 절차 ¹² 동공 크기의 보정 방법을 통합하는 것이 좋습니다. 재판 도중에도 작은 스트레스는 이미 크게 동공 직경을 변경할 수 있습니다.

안구 운동 실험을 설계할 때 다음과 같은 요소들은 안구 운동 응답에 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에 고려 또는 조절이 가능해야합니다 나이 ^13,18, 성별 ¹⁴ 변형 ^15,16을, 19. 동공과 홍채 사이의 대조가 BALB / C 마우스에서처럼 너무 낮은 경우 동공 탐지 및 추적이 불가능하기 때문에 또한, 실험 동물 색소 붓꽃이 있어야합니다. 매우 긴장하거나 불안한 동물 실험 세트까지하고 억제된 상태 익숙해 사전 실험로 훈련해야합니다. 이 동물은 눈이 덜 폐쇄 혹은 반 폐쇄의 절차 결과 처리 및 실험 도중 눈 체액의 생성을 방지하고 결과적으로 더 나은 학생 추적이 수행됩니다.

마지막으로, 수집하고 데이터를 분석하는 것은 동물마다 두세 시간 전에 필요합니다. 따라서 안구 운동 레코딩 가능성이 선택한 마우스에 적용하여 높은 처리량 선별 검사로서 적합하지 않다 특정 절차 유지됩니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
Isofluran	Rhodia Organique 파인 (주)
생리대	FHC	40-90-8
Duratears	Alcon
인산 겔	커	31,297
Optibond 프라임	커	35,369
Optibond 접착제	커	35,369
카리스마 복합	Heraeus Kulzer
맥시멈 480 광 경화 장치	헨리 Schein
AC 서보 모터 제어	고조파 드라이브 AG
Cylindric 화면
할로겐 라이트 (20 승)	RS 컴포넌트
Potentiometers (정밀)	Bourns INC.	6574
파워 1401 (I / O 인터페이스)	CED 제한
컴퓨터	작은 골짜기
적외선 emmitters	RS 컴포넌트	195-451
ETL-200	ISCAN
줌 렌즈 (줌 6,000)	Navitar INC.
Pilocarpinenitrate (minims)	Laboratoire Chauvin