Video-oculografia in Mouse

Riepilogo

Video-oculografia è un metodo molto quantitativa per indagare le prestazioni del motore oculare così come apprendimento motorio. Qui, descriviamo come misurare la video-oculografia nei topi. Applicando questa tecnica su normali, trattati farmacologicamente o topi geneticamente modificati è un potente strumento di ricerca per esplorare la fisiologia di base dei comportamenti del motore.

Abstract

I movimenti oculari sono molto importanti al fine di tracciare un oggetto o per stabilizzare l'immagine sulla retina durante il movimento. Gli animali senza fovea, come il mouse, hanno una limitata capacità di bloccare i loro occhi su un bersaglio. In contrasto con questi movimenti oculari destinatari diretti, compensativi movimenti oculari oculari possono essere facilmente raggiunta in animali afoveate ^1,2,3,4. Movimenti oculari compensative sono generati dal trattamento delle informazioni vestibolari e optocinetico in un segnale di comando che guiderà i muscoli oculari. Il trattamento delle informazioni vestibolare e optocinetico possono essere analizzate separatamente e insieme, permettendo la definizione di un deficit del sistema oculomotore. Il sistema oculomotore può essere verificata attraverso l'evocazione di uno optocinetico reflex (okr), riflesso vestibolo-oculare (VOR) o visivamente-enhanced riflesso vestibolo-oculare (VVOR). Il okr è un movimento riflesso che compensa il "pieno campo" i movimenti delle immagini sulla retina, mentre la VOR è una m occhio reflexovement che compensa i movimenti della testa. Il VVOR è un movimento degli occhi riflesso che utilizza sia vestibolare così come le informazioni optocinetico per rendere il risarcimento adeguato. Il cervelletto controlla ed è in grado di regolare i movimenti oculari di compensazione. Pertanto, oculografia è uno strumento molto potente per studiare il comportamento del cervello in rapporto normale, così come in condizioni patologiche (fe di vestibolare, oculare e / o origine cerebellare).

Test del sistema oculomotore, come un paradigma comportamentale, è interessante per diversi motivi. In primo luogo, il sistema oculomotore è un sistema ben compreso neurale ^5. In secondo luogo, il sistema è relativamente semplice oculomotore ^6, la quantità di movimento dell'occhio possibile è limitata dalla sua sfera-in-presa architettura ("singolo giunto") e le tre coppie di muscoli extraoculari ^7. In terzo luogo, l'output comportamentale e l'input sensoriale può essere facilmente misurata, che rende questo un sistema altamente accessibile quantitativaanalisi ^8. Molti test comportamentali manca questo elevato livello di potenza quantitativa. Infine, sia le prestazioni nonché plasticità del sistema oculomotoria può essere testato, consentendo ricerca sui processi di apprendimento e memoria ^9.

Topi geneticamente modificati sono ormai ampiamente disponibili e formano una fonte importante per l'esplorazione delle funzioni cerebrali a vari livelli ^10. Inoltre, possono essere utilizzati come modelli per mimare malattie umane. Applicando oculografia su Normal, trattati farmacologicamente o topi geneticamente modificati è un potente strumento di ricerca per esplorare la fisiologia di base dei comportamenti del motore in condizioni normali e patologiche. Qui, descriviamo come misurare la video-oculografia nei topi ^8.

Protocollo

1. Preparazione

I seguenti esperimenti sono stati condotti in accordo con il Comitato Etico Duch degli esperimenti su animali.

1. Preparazione topi per video-oculografia. Per misurare i movimenti oculari di un topo, la testa del mouse deve essere immobilizzato. Pertanto, una costruzione piedistallo viene effettuata sul cranio del topo (Figura 1).
   1. Anestetizzare il mouse da una miscela di isoflurano (isofluran 1-1,5%, Rhodia Organique fine Ltd, Francia) e l'ossigeno in una camera a gas. Il gas in eccesso viene scavenging. Mantenere l'anestesia tramite cono di naso. Confermare la profondità dell'anestesia tramite un pizzico punta.
   2. Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C con l'uso di un sensore termico anale ed un rilievo di riscaldamento (FHC, Bowdoinham, ME).
   3. Proteggere gli occhi coprendoli con un unguento oculare (duratears, Alcon, Belgio). Accorciare il pelo dorsale del cranio, e pulire l'area chirurgica, con una rotazione di macchia e betadinE o soluzione di clorexidina.
   4. Eseguire un'incisione linea di mezzo per esporre la superficie dorsale craniale del cranio. Rendere la superficie pulita e asciutta.
   5. Applicare una goccia di acido fosforico (acido fosforico gel mordenzante 37,5%; Kerr, CA) sulla superficie dorsale craniale del cranio dal bregma al lambda. Rimuovere il mordenzante dopo 15 secondi e rendere la superficie cranica pulire con soluzione fisiologica e di nuovo asciutto.
   6. Applicare in cima a questa superficie incisa cranica una goccia di OptiBond prime (Kerr, CA) e asciugare all'aria per 30 secondi.
   7. Mettere una goccia di OptiBond adesivo (Kerr, CA) in cima al primo OptiBond e la cura con la luce per 1 minuto (Maxima 480 fotopolimerizzatore a luce visibile, Henry Schein, USA).
   8. Coprire lo strato adesivo con uno strato sottile di Charisma composito (Heraeus Kulzer, Germania). Incorpora due dadi collegati (diametro: 3 mm) in materiale composito. Curare il composito poi con la luce. Se necessario, applicare ulteriori strati di composito e curarli con la luce.
   9. Annuncioministro buprenorfina (0,015 mg / kg, sc) per analgesia post-operatoria. L'animale dovrebbe essere di nuovo in piedi nel giro di circa 5 min. Lasciare il mouse per recuperare in gabbia a casa a temperatura ambiente per almeno 3 giorni dopo l'intervento.
2. Video-oculografia setup per topi (Figura 2).
   1. Posizionare il mouse il limitatore e fissare la testa per il limitatore da due viti (Figura 1). Il mouse non ha bisogno di essere anestetizzati per questa procedura. Tempo di ritenuta non deve superare 1 ora / giorno.
   2. Montare la testa e il corpo restrainer mouse su una piattaforma XY, che a sua volta è montato sulla tavola rotante (diametro: 60 cm). Utilizzando la piattaforma XY la testa mouse può essere posizionato sopra il centro del piatto girevole. Il mouse può essere spostato nel corso degli assi beccheggio, imbardata e rollio. La testa del mouse viene posizionato nella corretta beccheggio, imbardata e l'angolo di rollio allineando l'occhio utilizzando l'immagine visiva dell'occhio generato dal syste iSCANm. In alternativa, la costruzione piedistallo può essere posizionato sulla testa di topo in un telaio stereotassico ^11.
   3. L'unità di rotazione è collegata ad un servo-motore controllato da AC (Harmonic Drive, Paesi Bassi) e la posizione del piatto girevole è controllata da un potenziometro (Bourns inc., CA) fissato all'asse rotante.
   4. Uno schermo cilindrico circostante (diametro: 63 cm, altezza 35 cm) con un modello casuale tratteggiata (ciascun elemento 2 °) copre la piattaforma girevole; questo tamburo è inoltre dotato di un servo-motore controllato da AC (Harmonic Drive, Paesi Bassi) . La posizione dello schermo cilindrico è controllata da un potenziometro (Bourns inc., CA) attaccato al suo asse e lo schermo può essere illuminato da una lampada alogena (20 Watt). Sia lo schermo circostante e la piattaforma girevole sono azionati in modo indipendente.
   5. Il movimento della tavola rotante e schermo circostante è controllato da un computer che è collegato ad un interfaccia I / O (CED limitata, Cambridge, Regno Unito). Tabili e dintorni segnali di posizione dello schermo vengono filtrati (cut-off frequenza: 20 Hz), digitalizzati dal interfaccia I / O e memorizzati su questo computer.
   6. L'occhio del mouse è illuminato da tre emettitori a infrarossi (600 mW, angolo di dispersione: 7 °, picco di lunghezza d'onda: 880 nm, RS Components, Paesi Bassi). Due emettitori sono fissati alla piattaforma girevole e il terzo emettitore è collegato alla telecamera. Questo terzo emettitore produce una riflessione corneale di riferimento (CR), che viene utilizzata durante la procedura di taratura e durante le registrazioni movimento dell'occhio.
   7. Una termocamera ad infrarossi CCD dotata di un obiettivo zoom (Zoom 6000, Navitar inc., NY) è attaccato al giradischi e si concentra sulla testa mouse al centro del piatto girevole. La telecamera può essere sbloccato e può essere straorzate attorno all'asse giradischi oltre esattamente 20 ° durante la procedura di calibrazione.
   8. Il segnale video viene elaborato da un sistema di tracciamento dell'occhio (ETL-200, iSCAN, Burlington, MA). Il sistema utilizza un algoritmo iSCANRithm per monitorare i centri della pupilla e la CR di riferimento. Il sistema può monitorare la pupilla e di riferimento CR in direzione orizzontale e verticale ad una frequenza di campionamento di 120 Hz.
   9. CR riferimento di posizione, la posizione della pupilla e segnali di dimensioni della pupilla vengono digitalizzati da interfaccia I / O e sono memorizzati nel file stesso tavolo e dintorni segnali di posizione dello schermo. L'allievo-tracking sistema video induce un ritardo di segnali movimento dell'occhio di circa 27 ms.

2. Calibrare e misurare i movimenti oculari utilizzando Video Alunno-tracking

Il sistema di tracciamento dell'occhio cattura il movimento della pupilla come traslazione. La traslazione della pupilla monitorati contiene un componente di traslazione assiale dovuto alla differenza tra il centro di rotazione dell'occhio e il centro anatomico dell'occhio (cioè centro di curvatura corneale), e una componente rotazionale dovuta alla rotazione angolare del bulbo oculare. Per sottrarreIng il riferimento CR dal movimento pupilla / posizione, la componente indesiderata traslazionale viene eliminata dal segnale, con conseguente traslazione che è solo a causa della rotazione del bulbo oculare. Anche se sono spesso molto piccola, questa sottrazione elimina anche le traduzioni tra la testa e la telecamera. Il residuo movimento traslatorio isolato viene convertito in rotazione angolare del bulbo oculare con il metodo di calibrazione seguente ^8,12. Questa taratura è stata eseguita prima di ogni esperimento movimento dell'occhio.

1. Regolare la posizione della testa del mouse per la telecamera in modo tale che l'immagine video della pupilla è situata al centro del monitor e che la rappresentazione del CR riferimento si trova sulla linea mediana verticale dell'occhio preferibilmente diretto sopra la pupilla. Minimizzare i movimenti del CR riferimento per rotazioni angolari telecamera, che può essere ottenuto posizionando il centro della curvatura corneale sulla telecamera / tabella asse.
2. Ruotare la telecamera più volte da + / - 10 ° (ossia 20 gradi picco-picco) attorno all'asse verticale della giostra. Utilizzare la posizione della pupilla cingolato (P) e il riferimento CR registrato nelle posizioni estreme della rotazione della telecamera per calcolare il raggio di rotazione della pupilla (Rp; Rp = Δ / sin (20 °), dove Δ = (CR -P), vedi figura 3A).
3. Dato che il valore Rp dipende dalla dimensione della pupilla, una correzione dimensione della pupilla deve essere attuata ¹² (Figura 3B). Ripetere il passaggio 2,2 volte in diverse condizioni di illuminazione (cioè manipolare la dimensione della pupilla, figura 3C) per determinare la dimensione della pupilla - rapporto Rp e comporre una curva di correzione Rp (Figura 3D). Il valore Rp dipende anche dalla posizione dell'occhio verticale. Quando l'esperimento farà sì che i movimenti oculari verticali, quindi una correzione della calibrazione per le posizioni oculari verticali è altamente raccomandabile13.
4. Determinare la posizione angolare dell'occhio (E) misurando la posizione di riferimento CR, la posizione P e il diametro pupillare. La posizione di riferimento CR viene sottratto dalla posizione della pupilla generando una posizione traslazionale pupilla libero. Misurando il diametro pupillare il valore Rp può essere estratto dalla curva di correzione Rp e E può essere calcolato utilizzando la seguente formula E = arcsin {(Δ1) / Rp} (Figura 4A; cui Δ1 = (P _{2-P 1)} e P ₁ e P ₂ sono corrette mediante sottrazione del CR riferimento).
5. Un vasto repertorio di giradischi e / o rotazioni dello schermo circostanti possono ora essere utilizzati per stimolare il sistema oculomotore. Per svolgere oculografia video nel buio, l'occhio mouse deve essere pretrattato con un farmaco miotico per limitare la dilatazione della pupilla e consentire il monitoraggio pupilla in queste circostanze. Nei nostri esperimenti, usiamo pilocarpina (4%, Laboratori Chauvin, Francia) per limitare la dilatazione degli alunni inal buio.

3. Analisi dei dati

1. Posizioni degli occhi, le posizioni della tabella e le posizioni dello schermo circostanti sono tutti convertiti in posizioni angolari (si veda la Figura 4B e la formula in 2.4). Segnali oculari sono corretti per il loro ritardo di 27 ms indotta dalla elaborazione delle immagini della pupilla-sistema di tracciamento.
2. Posizioni angolari dell'occhio, e la tavola schermo circostante sono differenziate e filtrati con un filtro passa-basso Butterworth utilizzando una frequenza di taglio di 20 Hz.
3. Saccadi vengono rimossi dal segnale di velocità occhio con una soglia di rilevamento di 40 ° / s. I dati vengono rimossi a partire da 20 ms prima e fino a 80 ms dopo aver attraversato la soglia di rilevamento.
4. Tabella, schermo circostante e segnali di velocità oculari sono mediati utilizzando ogni singolo ciclo del percorso (Figura 4C).
5. Segnali mediati sono dotati di una funzione appropriata. In generale, una stimolazione velocità sinusoidale viene utilizzato e la mediatocicli sono dotati di seno o funzione coseno (Figura 4C). Quindi, il guadagno può essere calcolata come il rapporto di velocità occhio velocità stimolo, mentre la fase può essere calcolato come la differenza (in gradi) fra la velocità occhio e velocità stimolo.

4. Risultati rappresentativi

Video-oculografia può essere utilizzato per indagare varie forme di spettacoli oculomotori (cioè reflex optocinetico: okr; riflesso vestibolo-oculare: VOR; visivamente migliore riflesso vestibolo-oculare: VVOR), nonché di apprendimento motorio (adattamento VOR; adattamento okr). Il okr compensa i disturbi a bassa frequenza con feedback visivo. Il okr può essere indotta dalla rotazione ben illuminato schermo circostante (Film 1). Ruotando lo schermo circostante su una gamma di frequenza di 0,2 -1,0 Hz con un'ampiezza di 1,6 ° mostra come il sistema optocinetico è un più efficiente meccanismo di compensazione nell'intervallo a bassa frequenza THAn nella gamma alta frequenza (Figura 5A). Il VOR compensa alta frequenza movimenti della testa utilizzando segnali dagli organi vestibolari. Il VOR può essere indotta ruotando l'animale (cioè giradischi) al buio (Film 2). Ruotando il piatto su una gamma di frequenza di 0,2 -1,0 Hz con un'ampiezza di 1,6 ° dimostra come il vestibolo-oculare sistema più efficiente per generare movimenti oculari di compensazione nella gamma alta frequenza rispetto alla gamma di bassa frequenza (figura 5A) . Quando la legge sul sistema optocinetico e vestibolo-oculare in concerto, le immagini possono essere stabilizzate sulla retina su una vasta gamma di movimenti della testa. Ruotando il piatto su una gamma di frequenza di 0,2 -1,0 Hz con un'ampiezza di 1,6 °, mentre lo schermo circostante è ben illuminato (Film 3) mostra come l'occhio genera "alto guadagno" movimenti di compensazione sulla intera gamma di frequenze (figura 5A ). Tutti questi guadagno e phasi valori sono tipici per i topi, anche se le differenze di genere ¹⁴ e ceppo ^15,16,17 sono stati segnalati.

Il controllo indipendente sopra il giradischi e lo schermo circonda ci permette di affrontare i topi con una mancata corrispondenza tra le informazioni visive e vestibolari. Dopo esposizione a lungo termine e uniforme delle corrispondenti informazioni visive e vestibolare, il VOR del mouse cambierà per compensare l'ingresso alterato visivo (adattamento VOR; Movie 4). La rotazione del piatto di fase (cioè 180 °) con lo schermo circostante (1 Hz, 1,6 °) aumenta il guadagno VOR (Figura 5B). La variazione del guadagno massimo in VOR, quando si utilizza un paradigma di apprendimento di prova, viene spesso raggiunto dopo 30 minuti.

Figura 1. Schema del limitatore del mouse testa-corpo. Il corpo del mouse viene trattenuto medianteun tubo di plastica cilindrico con un diametro di 35 mm. Il capo del mouse è immobilizzato collegando il piedistallo del mouse per la barra di ferro con due viti. La sbarra di ferro forma un angolo di 30 gradi al fine di posizionare la testa del mouse in campo durante la normale deambulazione. *, Vista dall'alto del piedistallo contenente due dadi.

Figura 2. Schema della configurazione del mouse video-oculografia.

Figura 3. La calibrazione del sistema di video-allievo tracking. A) La telecamera è ruotato diverse volte da + / - 10 ° (cioè 20 gradi picco-picco) attorno all'asse verticale della giostra. La pupilla cingolato (P) e la riflessione corneale di riferimento (CR) registrata nel posizioni estreme della rotazione della telecamera vengono utilizzati per calcolare il raggio di rotazione della pupilla(Rp). B) Il raggio del diametro pupillare dipende dalla dimensione della pupilla. C) Esempio illustra l'effetto della dimensione della pupilla sulla posizione della pupilla durante la procedura di calibrazione (misurato sia in pixel (px)). D) Rapporto tra Rp e il diametro della pupilla misurata in un mouse. I diametri pupillari tredici differenti state realizzate modificando l'intensità della luce circostante.

Figura 4. Misurazione e analisi dei movimenti oculari che utilizzano il video allievo-tracking. A) La posizione della pupilla angolare viene calcolata dal raggio della pupilla (Rp) e la posizione della pupilla (P; posizione corretta per CR). B) Esempio di movimento degli occhi compensativo indotto stimolando il sistema vestibolare e visivo (visivo maggiore VOR). La tavola rotante è stata ruotata sinusoidale a 0,6 Hz con un'ampiezza di 1,6 °, mentre lo schermo circostante era ben illuminato. C) Analisi della registrazionemostrato in B). Il grafico mostra la traccia velocità media del giradischi (blu) e allievo (rosso). Queste tracce mediati sono stati dotati di una funzione sinusoidale (nero).

Figura 5. Prestazioni e l'apprendimento del sistema oculomotore misurato in una C57Bl6 mouse. Movimenti A) occhi sono generati da rotazioni dello schermo circostante (optocinetico riflessi: okr, pannelli superiori), ruotando il mouse al buio (riflesso vestibolo-oculare: VOR, pannelli centrali) e ruotando il mouse nella luce (visivamente -enhanced riflesso vestibolo-oculare: VVOR, pannello inferiore) con frequenze da 0,2 a 1,0 Hz ad un'ampiezza di 1,6 °. Il guadagno del riflesso è stata calcolata come il rapporto di velocità occhio velocità stimolo (pannelli di sinistra) e la fase del riflesso è stata calcolata dalla differenza di fase tra la velocità occhio e velocità stimolo (pannelli di destra). B) L'apprendimento motorio è stato realizzato da adattivo aumentando la VOR utilizza un paradigma di fase di addestramento. Il topo è stato oggetto di un paradigma formazione visuovestibular in cui la rotazione del topo era fuori fase (180 °) con la rotazione dello schermo circostante (sia rotante a 1,0 Hz, 1,6 °) per quaranta minuti. Ogni 10 minuti il ​​VOR è stata provata (1.0 Hz, 1.6 °). In questo mouse la fase di formazione è aumentato il guadagno VOR.

Movie 1. L'animazione mostra il paradigma che induce nei topi okr Clicca qui per vedere il film .

Movie 2. L'animazione mostra il paradigma che induce VOR nei topi. Clicca qui per vedere il film .

Movie 3. L'animazione mostra il paradigma che induce VVOR nei topi..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Clicca qui per vedere il film.

Movie 4. L'animazione mostra la visuovestibular fuori del paradigma fase di formazione che induce l'adattamento VOR (aumento) nei topi. Clicca qui per vedere il film .

Discussione

Al fine di ottenere video di alta qualità movimenti oculari registrazioni in topi diversi requisiti sono necessari. La procedura di taratura deve essere eseguita in materia suddetto standardizzato. Per esempio fuori centro calibrazione, quando la pupilla non è posizionato sulla linea mediana verticale con il riferimento CR durante la procedura di calibrazione, si tradurrà in una sottostima della RP e di conseguenza una sovrastima del movimento dell'occhio. Inoltre, si consiglia di integrare la dimensione pupilla metodo di correzione nella procedura di calibrazione ^12, in quanto gli studi che mostrano un diametro pupillare molto stabile sono molto rari. Anche un piccolo fattore di stress durante il processo può già modificare il diametro della pupilla in modo sostanziale.

Quando si progetta un esperimento movimento degli occhi, i seguenti fattori devono essere presi in considerazione o controllati per quanto sono noti per influenzare la risposta movimento degli occhi: ^13,18 età, sesso ¹⁴ e ceppo ^15,16, 19. Inoltre, l'animale sperimentale dovrebbe avere iridi pigmentate in quanto il rilevamento e il monitoraggio degli alunni è impossibile quando il contrasto tra pupilla e iride è troppo bassa, come nel topo BALB / c. Animali estremamente nervoso o ansioso bisogno di essere formati, prima dell'esperimento, per abituarsi al set up sperimentale e la condizione contenuta. Questo animale procedura di gestione dei risultati in meno di chiusura o semi-chiusura degli occhi e impedisce la generazione di fluidi oculari durante l'esperimento, e di conseguenza un monitoraggio allievo migliore è compiuto.

Infine, l'acquisizione e l'analisi dei dati richiede due o tre ore per animale. Pertanto, le registrazioni dei movimenti oculari probabilmente rimarrà una procedura specifica applicata ai topi selezionati e non è adatto come test di screening ad alta produttività.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Isofluran	Rhodia Organique fine LTD
Riscaldamento pad	FHC	40-90-8
Duratears	Alcon
Gel di acido fosforico	Kerr	31297
OptiBond prime	Kerr	35369
OptiBond adesivo	Kerr	35369
Charisma composito	Heraeus Kulzer
Maxima 480 Unità luce di polimerizzazione	Henry Schein
AC servo motore controllato da	Harmonic Drive AG
Cylschermo indric
Luce alogena (20 W)	RS Components
Potenziometri (precisione)	Bourns inc.	6574
Potenza 1401 (interfaccia I / O)	CED limitata
Computer	Conca
Emmitters infrarossi	RS Components	195-451
ETL-200	ISCAN
Zoom (zoom 6000)	Navitar inc.
Pilocarpinenitrate (minime)	Laboratoire Chauvin