免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

要約

免疫応答と行動の間のリンクを理解するために、我々は中に運動行動を測定する方法を説明しますショウジョウバエ細菌感染だけでなく、モニタリングの生存、細菌負荷、及び先天性免疫、NFκBの重要な調節因子でのリアルタイムのアクティビティによって免疫応答をマウントするには、ハエの能力の中に。

要約

免疫応答とホストの動作の間の複雑な相互作用は、種の広い範囲に記載されている。過剰睡眠は、特に、哺乳類¹感染に対する反応として起こることが知られており、また、最近、 キイロショウジョウバエ ²に記載されている。これは、一般的に睡眠が感染時に宿主に有益であり、それは強力な免疫システム^3,4の維持に重要であることが受け入れられている。しかし、この仮説を支持する実験的証拠は^、4限られており、免疫応答時の過剰睡眠の機能は不明なままである。我々は、この複雑な問題に対処するための学際的なアプローチを使用していて、単純な遺伝モデル系、ショウジョウバエキイロショウジョウバエの研究を行ってきた。我々はハエの運動行動と睡眠を測定するための標準的なアッセイを使用し、このアッセイはハエinfecteにおける挙動を測定するために使用される方法を示してい細菌の病原性株でd。このアッセイはまた、感染時に個々のハエの生存期間を監視するのに役立ちます。免疫機能の追加措置は、感染症およびNFκB、 ショウジョウバエの自然免疫応答の中心となる重要な転写因子の活性化をクリアするハエの能力を含んでいます。感染時の生存転帰と細菌クリアランスの両方が一緒に感染に対する抵抗性と寛容の指標である。許容範囲は、感染による被害を制限し、それによりシステム⁵内病原体の高レベルにもかかわらず、生き残るためには、ホストの能力と定義されていて抵抗が、感染をクリアするには、ハエの能力を指します。感染中のNFκB活性のリアルタイム監視は、感染時に生存の分子機構への洞察を提供します。これらの簡単なアッセイにおけるショウジョウバエの使用は睡眠の遺伝学的および分子生物学的解析を容易にと免疫応答とどのようにこれらの2複雑なシステムが相互に影響を受けています。

プロトコル

このプロトコルは、細菌感染にさらさハエから収集された四つの異なる読み出しを取得する2つの設定（ 図1）を使用しています。 2）生存転帰;、3）その場で細菌負荷、4）in vivoにおける NFκBのレポーター活性のリアルタイム測定、これらの出力）はスリープ/スリープ解除の動作を1が含まれています。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝学的ツールとの組み合わせでは、これらの測定は、免疫機能と動作の間の分子リンクに機械論的な洞察を提供します。

1。ハエの自発運動と睡眠を測定

1. ショウジョウバエの活動モニタリングシステム（DAM2、Trikinetics）、インキュベーター、暗い部屋、実験動物および活動チューブの調製を含むハエの自発運動と睡眠を測定するために使用する設定は^、6以前に記載されている。同じアプローチはいくつかのマイナーな修正を加えて、ここで使用されます。
   1. インキュベーターの照明はインキュベーター自体によって制御されます。したがって、コンピュータとインキュベータの間で時間設定を同期させることが重要です。
   2. 活動チューブを脱イオン水でホットプレート上で沸騰することで再利用するために掃除されています。少量の洗剤第一沸騰のために追加され、試験管をよくすすぎ、さらに2回煮沸する。糸がチューブを接続するときに使用している場合、使用される活性チューブ（食品、ワックス、ハエや糸を含む）は、糸の前に除去することなく洗浄することができます。
2. 事前の実験を開始し、後半蛹を含む場所培養は実験的な照明などの環境条件に適応するために3〜4日間インキュベーターでハエを上演した。ライト：暗い場所や、一定の条件は、一般的に睡眠行動を測定するために使用されてきた。この例では、ハエは免疫応答や行動^2,7,8で体内時計の影響を排除するために一定の光に順応する。 図1Aに記載されているように、Trikinetics DAM2活動へのロード1から4日齢のハエは感染の前に^{6を用いて}説明し、3日間以上のレコード監視します。

2。細菌の病原性株とハエに感染

1. ここで説明されたプロトコルは、S.に対して特異的である成長し、維持するのは簡単ですマルセッセンス 、。他の細菌種に対する長期保管および培養条件のためのプロトコルが異なります。S.マルセッセンスを -80℃で15から50パーセントのグリセリンに格納されています1.5 mlのマイクロチューブにオートクレーブし、50％グリセロールの1ボリュームに-長期保存のために準備するために、一晩細菌培養の2倍量（1.0 OD ₆₀₀ = 0.5）を混ぜます。これは17％の最終グリセロール濃度になります。 -80℃でチューブ℃で保存細菌のソース用に短期を準備するために、無菌200μlのピペットチップで凍結ストックをこすりとLB寒天プレート上で三方連勝を行う。 37＆dで一晩静置し例えば、C分離したコロニーを取得する。 4℃でプレートを保存する
   スケジュールされた感染前のある日、5 mlのLB培地を含む培養チューブに無菌200μlのピペットチップと水没先端を含むLB寒天プレートからシングルコロニーを拾う。それが指数増殖期に達するまで細菌の一晩、または37℃、250rpmでインキュベーターシェーカー内部まで16時間を栽培しています。 OD ₆₀₀における分光光度計を用いて濃度を測定する。この段階での濃度は0.5〜1の範囲である。濃度が高すぎると、菌を継代培養し、最適な濃度を得るために別のいくつかの時間のために成長します。炎源の近くに手順を実行します。いくつかの細菌株は抗生物質耐性用に設計され、成長し、適切な抗生物質のために選択されている培地に添加する。S.はマルセッセンス （ATCC＃8100）は、抗生物質耐性ではないので、抗生物質なしで無菌培地で栽培されています。滅菌技術を検証するために、モックcultuを行うコントロールとして細菌ずに再。
   ハエに感染するソリューションは、細菌（= 0.1 OD ₆₀₀に希釈したもの）と、PBS中の1％の食品着色料（ブリリアントブルーFCF）が含まれています。感染溶液及びPBS中1％青い食品着色料で使用されてLB培地と同等の量を追加することで、噴射制御のためのソリューションを用意してください。氷の上でソリューションを格納します。
2. ハエを注入するためのガラス針を準備します。マイクロピペットプラー（ナリシゲ）を使用して細かい先端にガラスキャピラリーを（OD = 1ミリメートルは、id = 0.58ミリメートル、WPI）引き出します。解剖顕微鏡下では、開口部が注射器で吸引して適用することによって、注射液で埋めるのに十分な大きさであるように、針の先端を断つために細かい鉗子を使用していますが、注入プロセスの間にフライへのダメージを最小限に抑えるのに十分に小さい。先端を破った後に、チップサイズは40〜50μm程度である必要があります。ガラス針は、チューブの長さと3ccのプラスチックシリンジに接続されています。注射媒体の流れを正圧またはs適用手動で制御されるシリンジではじめ。注射器装置は感染および制御注射の両方に使用されているように、注射液とゴム管を汚染しないようにします。
3. CO _2のパッドの上にそれらを置くことによって、ハエを麻酔。 CO _2はパッドを加湿するとパッドの上にハエの操作が複雑になる可能性があり、静電気を低減するために、水の密閉容器を介して渡されます。背側胸部の胚盤の上の領域にガラス針をつつくことでハエを注入します。フライへの注射媒体の受け渡しは食品着色料によって検証されます - ハエは、システムを介して食品着色料の普及に青に変わります。第3節で説明したようにハエが受け取る細菌の投与量は、下記に定量することができる。いくつかの実験的なデザインは、PBSおよび食品着色料ではなく細菌なしでハエを注入することにより無菌傷害を受け取るコントロールの基が挙げられる。

3。細菌負荷を決定する

evaluatinする一つのアプローチグラム細菌感染に対する免疫応答は、細菌負荷の感染後を決定することである。D.ショウジョウバエは、全体のフライは、個々の内総細菌数を推定するために均質化することができるので、このパラメータを決定するのに最適なモデルです。このプロトコルの背後にある理論的根拠は、ルリア培地（LB）をシャーレに寒天培地（LBプレート）などの固体培地上で増殖させたときに、単一の細菌が目に見える区別コロニーを形成しているということです。したがって、ホモジネートの連続希釈液を生成し、LBプレート上に希釈したホモジネートを広め、LB液体培地で感染したハエを均質化することにより、その場に感染する細菌細胞の数を決定することができる。 PBSおよび食品着色料ではなく細菌なし注入ハエの対照群は、感染が他の細菌種で汚染されていないことを確認するために使用されるべきである。この状態でLB寒天プレート上にコロニーがあってはならない。

1. このために使用されるすべての材料をオートクレーブ実際の均質化ステップを実行する前に手順。これは、均質化のために使用はさみ、LB培地、および乳棒で切断200μlのピペットチップが含まれています。ハエを均質化する前に、少なくとも1日10センチメートル滅菌シャーレにオートクレーブしたLB /寒天培地を注ぐことによってプレートを準備します。
2. 麻酔して、氷上に1.5 mlのマイクロチューブや店舗チューブにハエを集める。
3. 汚染を防ぐために、火気の近くで均質化を行う。例えばS.として菌株を使用する場合は特に感染せずにハエを含む制御均質化することをお勧めします抗生物質耐性はありませんマルセッセンス 、。 10ハエ当たり各実験条件の2つのグループの最小値をホモジナイズする。ホモジネートごとに使用されるハエの数は実験によって決定されます。他はホモジネート当たり3月10日ハエから使用している間、いくつかのグループは、個々のハエ⁸の間の細菌負荷の変動を評価するために有用である、ホモジネートごとに1つのフライを使用していた^9月12日遺伝子型又は実験条件間で比較します。
   1. ハエを含む各マイクロチューブに400μlのLB培地を追加し、小型モーターおよび乳棒（Kontes）を使用して均一化する。
   2. 滅菌カットピペットチップを使用して、シリアルは180μlのLB培地を含む1.5μlの微量遠心チューブに20μlの均質化されたLB /細菌の培地を加えてホモジネート1:10に希釈します。カッティングピペットチップは、フライ破片から閉塞を防止し、適切なボリュームが転送されていることを保証します。
   3. 希釈倍率は、経験的に決定し、ハエの遺伝子型は、使用した細菌株、実験条件に依存しています。 Sで感染した野生型ハエ用マルセッセンスは 、感染後直ちにホモジナイズハエのために1時10分²または1:10 ³の希釈液を使用し、ハエのために1時10分⁴または1:10 ⁵の希釈は、24時間後の感染を均質化した。
   4. マイクからの100μlのLB /細菌の培地を追加最終希釈を含むチューブをrocentrifugeと均等な分配を確保するためのガラス玉（VWR）を使用してLBプレートに培地を広げた。
   5. 100％EtOHを溶液中にガラス球を捨ててください。一晩37℃のインキュベーター中でLBプレートを置きます。
   6. オプションの手順として、LBプレート（;アルファイノテックFluorChem 8900）の画像を得るために可視光での撮像システムを使用しています。プレート自体に、またはPhotoshopソフトウェア（Adobe PhotoshopのCS3）でカウントツールを使用してプレートの画像のいずれかからのコロニー数をカウントします。
   7. 式を使ってフライあたりのコロニー形成単位数を計算します[N /（N * D * V）] * V、どこLBプレート上に生育したコロニーの数N = N = 1にプールハエの数微量遠心チューブ、D =希釈係数であり、v各プレート上に広げソリューションの=体積、Vホモジネート=初期体積。

4。感染後スリープと生存期間を評価

1. のために細菌負荷を測定するために収穫されていないハエは、別の7から10日間の行動を監視し続ける。生存期間は、ハエの遺伝子型は、環境条件、および感染に使用細菌種によって影響される。
2. 〜10日後に、実験を終了し、以前にダウンロードし^6に記載され^ているよう^に行動データを処理します。 Matlabで基づいているInsomniac2カスタムソフトウェアは、睡眠パラメータを分析するために使用されています。行動分析から死んだハエを排除することが重要です。通常、これは感染症やハエ遺伝子型の種類に応じて、感染後最初の日内に分析を制限します。アッセイにおける死はすべての活動カウントがゼロに達した時点で示されます。生存率の分析を容易にするために、Drosonexは、Microsoft Visual Basicで記述されたカスタムソフトウェアはC + + 6.0、TrikineticsのDAMシステムからの生データファイルを処理するために使用されます。 Excelファイル、各ハエの生存期間（時間単位）などのソフトウェアレポートは、アクティビティのdatをコンパイルすべてのモニタから単一のスプレッドシートに変換し、％はユーザによって設定され、時間の経過存続飛んで報告します。 Excelファイルは、さらなる分析のために他の統計ソフトウェアパッケージに統合できるように設計されています。

5。ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて感染中NFκBの活性を測定する

クオらで説明したように、このアッセイで用いられるトランスジェニックκB-Lucのハエは、以前に生成されていました。、2010 ^2。簡単に言えば、κB-LUCレポーターは、ルシフェラーゼオープンリーディングフレームの上流プロモーターを挿入したNFκB結合配列の8反復を含む。

1. セクション1.2に記載されている実験の照明条件にハエを調整します。この例では、1から4日齢κB-lucのハエは感染時に他のハエと同じ年齢に到達するために2日間、5％スクロースを含むバイアル内に収容された2％寒天食品媒体と定常光（LL）に配置されます。
2. ハエ用の96ウェルマイクロプレートを準備します。各ウェルは、食品中の2つの層（ 図2）が含まれている 、トップ層は、ルシフェリン、ルシフェラーゼの基質を含んでいます。 5％スクロース、各ウェルに2％寒天溶液300μlを加え、凝固させる。次に、各ウェルを含む5％スクロース、1％寒天、および2 mMルシフェリン（ゴールドバイオテクノロジー、株式会社）に50μlのトップ層を追加します。 ショウジョウバエにおけるレポーター活性を測定するために使用されるルシフェリン濃度は文献に変化している、及び^100μM13限り低くなっている。必要な濃度は、経験的に決定することができます。食品層を分配する間、無菌性を維持しながら、乾燥を促進するために細かいメッシュの布でカバープレート。プレートは凝縮液滴中に立ち往生からハエを防ぐために、最長1時間、徹底的に乾燥させなければならない。ルシフェリンは、光に敏感であるため、必要以上に光にプレートをさらすことは避けてください。
3. 明確な接着フィルム（トップを適用96ウェルマイクロプレートにパーキンエルマー）とウェルあたり2つの穴の量で細い針を使用して穿孔し、シール - 。これらの穴は、各ウェルに空気の交換を許可していませんが、また個別にハエを麻酔する方法を提供します。鋭い刃とストレートエッジを使用して、各列の間のカットを紹介します。これは、一度に8つのグループでハエをロード/アンロードするための簡単​​な方法を提供します。
   マイクロウェルプレートにハエをロードするには、CO _2のパッドの上にインキュベーターと麻酔ハエからバイアルを取り外します。負荷が列ごとに各ウェルに一つずつ飛ぶ。彼らは頻繁に介入することなく、自分自身を解放することができるように接着シールにはまりうっかり飛ぶべきで、単独でフライにしておきます。 8から24時間、新しい環境に適応するとルシフェリン基質を消費するためにLLのインキュベーターにマイクロウェルプレートを返します。
4. 培養菌、S.マルセッセンス 、前述のように感染の溶液を調製します。
5. Anaesthetizeトン彼は低気圧のCO ₂回線に接続されているマイクロピペットチップを使用することによって飛ぶ。直接各ウェルのために作られた通気孔の上にマイクロピペットチップを置きます。 CO _2の圧力がフライをanaesthetizeに十分高いが、フライへの損傷を防ぐのに十分な低さであることを保証するために十分に注意ください。 8つのグループで、個別にCO _2のパッドにそれぞれのフライを転送し、上記のように感染します。感染後、その元々のウェルに各フライ返し、マイクロプレートを封印してください。
6. メジャー発光（トップカウント-NXTの発光とシンチレーションカウンター、パーキンエルマー社）。トップカウントルミネッセンスカウンターは時間の任意の長さ（通常は最大5日間）のための所望の刻みで連続してプログラムされ、自動化された測定値を可能にするプレートの積み重ねカセットを含む。この機能は、すべての楽器に使用できず、他の楽器を用いて行った実験のデータ収集は、したがって、それほど頻繁かもしれません。ルミネッセンスカウンターがRO内に収容されている制御された温度と照明のスケジュールとオム。スタッキングカセットにプレートをロードするときに、ハエが光を受けることを確保するための明確なブランクプレート間のハエを含むプレートを積み重ねる。測定値を24 hrの最小毎時間を収集するために、製造業者の仕様に従ってプログラムルミノ。この例では、検出器が10秒間、各ウェルを読み取り、秒当たりのカウント数（任意の単位）として結果を表現するためにプログラムされています。この値は、ウェル当たり3の測定値を平均しています。スプレッドシートへのデータファイルをエクスポートし、標準的な分析を行い、発光の結果をグラフ化する。

結果

1. 感染症は、睡眠を促進する。前述したように、この例では、NFκBの遺伝子、 レリッシュ（REL ^E20）14を欠くカントン-S（CS）は、野生型ハエや変異ハエは2 DAM2アクティビティモニター（各遺伝子型についてn = 32）にロードされ、感染していた。ハエが動作し、感染^2,7,8で概日時計の影響を排除するために一定の光の中で維持した。 DDBJリリース^E20の変異体は、以前...

ディスカッション

このプロトコルは、どのような動作を調査するためのアプローチを概説し、特に睡眠、免疫応答パラメータにリンクされています。これらのパラメータは、in vivoでのルシフェラーゼレポーターによって測定された細菌負荷、生存転帰、およびNFκB活性が挙げられる。一緒に、これらのパラメータは、ハエは感染と闘うことができるどれだけの情報を提供します。細菌負荷と生存転帰は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料名	会社	カタログ番号	注釈
			機器
インキュベーター	パーシバルサイエンティフィック株式会社	I30BLLC8 I36VLC8	プログラムされた光/温度スケジュールを実行することが可能な任意のインキュベーターが適切である。
ショウジョウバエ Activitiyモニター	Trikinetics社、マサチューセッツ州ウォルサム	DAM2	他の場所で6説明したように、このシステムは、コンピュータインターフェース、ソフトウェア、および他の付属品を必要とします。
パイレックスガラス管	Trikinetics社、マサチューセッツ州ウォルサム	PGT-5x65
マイクロプレートシンチレーションおよび発光カウンター	パーキンエルマー	トップカウントNXT 12検出器	発光を検出することが可能な任意のマイクロプレートリーダーは、レポーターアッセイのこのタイプのために使用することができます。トップカウントは、複数の検出器と自動スタッカーが入っていますが、複数のプレートから連続的に読み取るようにプログラムされることが可能である。
FluorChem 8900	アルファイノテック		細菌培養のイメージングは​​オプションです。可視光機能を備えた任意のデジタルイメージングシステムで十分です。
マイクロピペットプラー	Tritechリサーチ社	ナリシゲPC-10
			用品
ホウケイ酸塩のガラス管	世界の精密計測器株式会社	1B100F-4
3 mlのシリンジ	フィッシャー·サイエンティフィック	BD 305482
注射針	フィッシャー·サイエンティフィック	BD 305196	18 G - 配管の損傷を防ぐために、針の先端を切り落とした。
シリコーンチューブは、id（0.030 "）外径（0.065"）の壁厚さ（0.018 "）	VWR	60985-706	シリンジにガラスキャピラリー針を取り付けるために使用される
3方活栓	アメリカンPharmaseal会社	K75
Kontesペレット杵コードレスモーター	フィッシャー·サイエンティフィック	K749540-0000
Kontesペレット杵	フィッシャー·サイエンティフィック	K749521-1590
3ミリメートルガラス球	VWR	26396-630
マイクロマイクロライト1 +	サーモサイエンティフィック	7571	セレクトン発光に適した96ウェルプレートには、 - 彼らは不透明でなければなりません。
TopSeal-:96ウェルマイクロプレート	パーキンエルマー	6005185	マイクロプレス上の接着封止膜
D-ルシフェリン、カリウム塩	ゴールドバイオテクノロジー、（株）	LUCNA
			ソフトウェア
Insomniac2	作者に要望に応じて利用できる	カスタム;レスリーアッシュモア博士によって書かれた（ウェストミンスター大学）	睡眠2,6,11の分析のために日常的に使用されているMATLABベースのソフトウェア
Drosonex	作者に要望に応じて利用できる	カスタム;トーマスCoradetti（歩道ソフトウェア）によって書かれた	で収集された生データファイルから生存分析に使用するPC MSVC6プログラムTrikineticsシステム
Photoshop CS3の	アドベ		デジタル画像（オプション）からのcfu /プレートの番号を得るために有用