Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Pour comprendre le lien entre la réponse immunitaire et le comportement, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement locomoteur dans Drosophila Lors d'une infection bactérienne ainsi que la capacité des mouches à monter une réponse immunitaire par la survie de surveillance, la charge bactérienne, et en temps réel l'activité d'un régulateur clé de l'immunité innée, NFkB.

Résumé

Une interaction complexe entre la réponse immunitaire et comportement de l'hôte a été décrit dans un large éventail d'espèces. L'excès de sommeil, en particulier, est connu pour se produire en réponse à l'infection chez les mammifères ¹ et a récemment été décrit chez Drosophila melanogaster ^2. Il est généralement admis que le sommeil est bénéfique à l'hôte lors d'une infection et qu'il est important pour le maintien d'un système immunitaire robuste ^3,4. Cependant, les preuves expérimentales qui soutient cette hypothèse est limité ^4, et la fonction du sommeil en excès au cours d'une réponse immunitaire reste incertaine. Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire pour s'attaquer à ce problème complexe, et ont mené des études dans le système modèle génétique simple, la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. Nous utilisons un test standard pour mesurer le comportement locomoteur et de sommeil chez les mouches, et de montrer comment ce test est utilisé pour mesurer le comportement des mouches infected avec une souche pathogène de bactéries. Ce test est également utile pour contrôler la durée de survie chez les mouches individuels au cours d'une infection. D'autres mesures de la fonction immunitaire incluent la capacité de mouches pour effacer une infection et l'activation de NFkB, un facteur de transcription clé qui est au cœur de la réponse immunitaire innée chez la drosophile. Résultats à la fois la survie et la clairance bactérienne au cours de l'infection ainsi que des indicateurs de résistance et de tolérance à l'infection. Résistance réfère à la capacité des mouches pour effacer une infection, tandis que la tolérance est définie comme la capacité de l'hôte à limiter les dommages causés par une infection et ainsi survivre en dépit des niveaux élevés d'agents pathogènes au sein du système ^5. Surveillance en temps réel de l'activité de NFkB cours de l'infection permet de mieux comprendre un mécanisme moléculaire de survie lors de l'infection. L'utilisation de la drosophile dans ces essais simples facilite les analyses génétiques et moléculaires de sommeilet la réponse immunitaire et la manière dont ces deux systèmes complexes sont mutuellement influencés.

Protocole

Ce protocole utilise deux configurations (Figure 1) pour l'acquisition de quatre affichages différents recueillies des mouches soumises à une infection bactérienne. Ces sorties comprennent: 1) le sommeil / sillage comportement; résultats de survie 2), 3) la charge bactérienne chez la mouche, et 4) la mesure en temps réel de l'activité du rapporteur NFkB in vivo. En combinaison avec les outils génétiques qui sont disponibles chez la drosophile, ces mesures donnent un aperçu mécanistique sur le lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement.

1. Activité locomotrice mesure et hôtels de mouches

1. Le montage utilisé pour mesurer l'activité locomotrice et hôtels de mouches, qui comprend le système de surveillance de l'activité chez la drosophile (DAM2, Trikinetics), incubateurs, chambre noire, et la préparation des animaux de laboratoire et les tubes d'activité, a été décrit précédemment ^6. La même approche est utilisée ici, avec quelques modifications mineures.
   1. L'éclairage de l'incubateur est commandé par le même incubateur. Par conséquent, il est important de synchroniser le réglage de l'heure entre l'ordinateur et incubateurs.
   2. Activité tubes sont nettoyés pour une réutilisation en faisant bouillir sur une plaque chauffante dans de l'eau déminéralisée. Une petite quantité de détergent est ajouté pour la première ébullition, les tubes sont bien rincées et cuites deux fois plus. Si le fil est utilisé pour boucher le tube, les tubes d'activité utilisées (contenant de la nourriture, de la cire, des mouches et fils) peuvent être nettoyés sans démontage préalable du fil.
2. Avant de lancer une expérience, cultures lieu contenant fin nymphe mise en scène des mouches dans des incubateurs pendant trois à quatre jours pour s'adapter à l'éclairage expérimental et d'autres conditions environnementales. Lumière: des conditions sombres ou constante ont été couramment utilisés pour mesurer le comportement du sommeil. Dans cet exemple, les mouches sont acclimatés à lumière constante pour éliminer l'influence de l'horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement ^2,7,8. Comme il est décrit à la figure 1A , charge 1-4 jours d'âge mouches dans l'activité Trikinetics DAM2 moniteurs comme décrit ^6, et record pour un minimum de trois jours avant l'infection.

2. Infect mouches avec une souche pathogène de bactéries

1. Le protocole décrit ici est spécifique à S. marcescens, qui sont faciles à cultiver et à entretenir. Les protocoles de stockage à long terme et les conditions de culture pour d'autres espèces bactériennes peuvent varier. S. marcescens sont stockés dans le glycérol 15-50% à -80 ° C. Pour préparer stockage à long terme, mélangez 2 volumes de culture bactérienne pendant la nuit (DO ₆₀₀ = 0,5 - 1,0) à 1 volume de glycérol à 50% autoclave en 1,5 ml microtubes. Cela se traduira par une concentration de glycérol final de 17%. Conserver les tubes à -80 ° C. Pour préparer une courte durée d'utilisation de source de bactéries, gratter le stock congelé avec une pointe de pipette stérile 200 ul et d'effectuer une série de trois cours sur une plaque de gélose LB. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 & dpar exemple, C pour obtenir des colonies isolées. Conservez la plaque à 4 ° C.
   Un jour avant l'infection prévue, choisissez une seule colonie de la plaque de gélose LB avec une pointe de pipette stérile 200 pi et plonger la pointe dans un tube de culture contenant 5 ml de milieu LB. Cultiver des bactéries pendant la nuit, ou jusqu'à 16 heures à l'intérieur d'un agitateur incubateur à 37 ° C et 250 rpm jusqu'à ce qu'il atteigne la phase de croissance exponentielle. Mesurer la concentration d'un spectrophotomètre à une DO _600. La concentration dans cette phase varie de 0,5 à 1. Si la concentration est trop élevée, repiquer les bactéries et croître pendant encore plusieurs heures pour obtenir une concentration optimale. Effectuez la procédure à proximité d'une source de flamme. Certaines souches bactériennes sont conçus pour la résistance aux antibiotiques et sont cultivées et sélectionnées pour antibiotique approprié ajouté au milieu. S. marcescens (ATCC # 8100) ne sont pas résistants aux antibiotiques et sont donc cultivées dans un milieu stérile sans antibiotique. Pour vérifier une technique stérile, faire une maquette culture sans bactéries en tant que témoin.
   La solution pour infecter les mouches contient des bactéries (diluée à _DO600 = 0,1) et de colorant alimentaire 1% (bleu brillant FCF) dans du PBS. Préparer une solution de contrôle d'injection en ajoutant une quantité équivalente de milieu LB utilisé en solution infection et 1% de colorant alimentaire bleu dans du PBS. Conserver les solutions sur la glace.
2. Préparer aiguilles de verre pour injecter les mouches. Tirez capillaires en verre (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) pour une pointe fine à l'aide d'un extracteur micropipette (Narishige). Sous une loupe binoculaire, utilisez une pince fine à rompre la pointe de l'aiguille de sorte que l'ouverture est assez grande pour remplir de fluide d'injection en appliquant une aspiration avec une seringue, mais assez petit pour minimiser les dommages à la volée pendant le processus d'injection. Après avoir brisé la pointe, la taille de la pointe devrait être autour de 40-50 um. L'aiguille de verre est fixée à une seringue en plastique 3 cc avec une longueur de tube. L'écoulement du fluide d'injection est commandée manuellement en appliquant une pression positive ou suction avec la seringue. Éviter de contaminer le tube en caoutchouc avec un fluide d'injection, comme le dispositif de seringue est utilisée pour le contrôle de l'infection et les injections.
3. Anesthésier les mouches en les plaçant sur ​​un tapis de CO _2. CO ₂ est passé à travers un récipient fermé d'eau pour humidifier le tampon et pour réduire l'électricité statique, ce qui peut compliquer la manipulation de vol sur la plaquette. Injecter mouches par piquer l'aiguille de verre dans la région au-dessus du scutellum du thorax dorsal. Le passage du milieu d'injection dans la mouche est vérifiée par le colorant alimentaire - mouches deviennent bleus comme les spreads de colorants alimentaires à travers le système. La dose de bactéries qui reçoivent les mouches peut être quantifiée comme décrit dans la section 3 ci-dessous. Certains modèles expérimentaux comprennent un groupe témoin qui reçoit une blessure par injection aseptique mouches avec du colorant alimentaire PBS et sans bactéries.

3. Déterminer la charge bactérienne

Une approche pour evaluating la réponse immunitaire contre l'infection bactérienne est une infection à déterminer la charge bactérienne après. D. melanogaster est un excellent modèle pour déterminer ce paramètre, car la volée entière peut être homogénéisé afin d'estimer le nombre total de bactéries à l'intérieur d'un individu. La raison d'être de ce protocole est que lorsqu'elle est cultivée sur un milieu solide tel que du bouillon de Luria (LB) agar sur une boîte de Pétri (plaque LB), une seule bactérie forme une colonie visible à distinguer. Par conséquent, en homogénéisant les mouches infectées en milieu liquide LB, générer des dilutions en série de l'homogénat, et d'étalement de l'homogénat dilué sur des plaques LB, le nombre de cellules bactériennes qui infectent une volée peut être déterminée. Un groupe de contrôle de vol d'une injection de PBS et de coloration des aliments sans pour autant les bactéries doivent être utilisées pour vérifier que l'infection n'a pas été contaminé par d'autres espèces bactériennes. Il devrait y avoir aucune colonie sur la gélose LB dans cet état.

1. Autoclaver tous les matériaux qui seront utilisés pour cetteprocédure avant d'effectuer l'étape d'homogénéisation réelle. Cette regroupe plus de 200 embouts de pipette ul coupés avec des ciseaux, des médias, LB et pilons utilisés pour l'homogénéisation. Préparer les plaques en versant autoclavé milieu LB / agar dans des boîtes de 10 cm de Petri stériles au moins 1 jour avant l'homogénéisation des mouches.
2. Anesthésier et de recueillir les mouches dans 1,5 ml microtubes et tubes de magasins sur la glace.
3. Effectuez l'homogénéisation près d'une flamme pour éviter la contamination. Une homogénéisation de contrôle contenant les mouches sans infection est particulièrement recommandé lors de l'utilisation d'une souche bactérienne telles que S. marcescens, qui ne sont pas résistantes aux antibiotiques. Homogénéiser un minimum de 2 groupes de 10 mouches par chaque état expérimental. Le nombre de mouches utilisés par homogénat est déterminée par l'expérimentateur. Certains groupes ont utilisé une mouche par homogénat, ce qui est utile pour évaluer la variation de la charge bactérienne entre les mouches individuelles ^8, tandis que d'autres ont utilisé de 3 à 10 mouches par homogénatà comparer entre génotype ou de la condition expérimentale ^9-12.
   1. Ajouter 400 ul de milieu LB à chaque microtube contenant les mouches et homogénéiser à l'aide d'un petit moteur et un pilon (Kontes).
   2. Utiliser des embouts de pipette stériles coupées, serial dilution de 1:10 homogénat en ajoutant 20 ul LB homogénéisé / milieu bactérien à tube de 1,5 ul contenant 180 ul de milieu LB. Couper des pointes de pipette empêche le blocage des débris voler et veille à ce que le volume approprié est en cours de transfert.
   3. Facteur de dilution est déterminé de manière empirique et dépend du génotype de la mouche, la souche bactérienne utilisée, et les conditions expérimentales. Pour les mouches de type sauvage infectées par S. marcescens, utiliser des dilutions de 1:10 ² 1:10 ³ ou pour les mouches homogénéisés immédiatement après l'infection, et des dilutions de 1:10 ou 1:10 ^{4 5} pour les mouches homogénéisé 24 h après l'infection.
   4. Ajouter 100 ul LB / milieu bactérien du microtubes rocentrifuge contenant la dilution finale et la propagation de la moyenne sur une plaque LB utilisant des billes de verre (VWR) pour assurer une distribution uniforme.
   5. Jeter des boules de verre dans une solution EtOH à 100%. Placez les plaques de LB dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
   6. En option, utilisez un système d'imagerie à la lumière visible pour obtenir une image des plaques LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Compter le nombre de colonies soit sur la plaque elle-même ou de l'image de la plaque en utilisant l'outil de comptage sur logiciel Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
   7. Calculer le nombre d'unités formant colonie par la mouche selon la formule suivante: [n / (N * D * v)] * V, où n = nombre de colonies cultivées sur la plaque LB, N = le nombre de vol mis en commun dans une microtube, D = facteur de dilution et v = volume de solution étalée sur chaque plaque; V = volume initial de l'homogénat.

4. Évaluer sommeil et la durée de survie après l'infection

1. Pourmouches qui ne sont pas exploitées pour mesurer la charge bactérienne, continuer à surveiller le comportement pendant 7-10 jours. Durée de survie est influencée par le génotype des mouches, les conditions environnementales et les espèces bactériennes utilisées pour l'infection.
2. Après environ 10 jours, résilier l'expérience, télécharger et traiter les données comportementales telles que décrites précédemment ^6. Insomniac2 logiciels sur mesure, qui est basé à Matlab, est utilisé pour analyser les paramètres du sommeil. Il est important d'éliminer les mouches mortes de l'analyse comportementale. Normalement, ce qui limite les analyses à l'intérieur du premier jour après l'infection, selon le type d'infection et le génotype mouche. La mort dans l'essai est indiqué par le temps tous les chefs d'activité ont atteint zéro. Pour faciliter l'analyse de la survie, Drosonex, un logiciel personnalisé écrit en Microsoft Visual C + + 6.0, est utilisé pour traiter les fichiers de données brutes du système de DAM Trikinetics. Les rapports de logiciels sous forme de fichiers Excel, la durée de survie de chaque volée (en heures), compile activité datun ensemble de moniteurs dans une feuille de calcul, et signale l'oiseau survivant pour cent dans le temps fixé par l'utilisateur. Les fichiers Excel sont conçus pour s'intégrer dans d'autres logiciels de statistiques pour une analyse ultérieure.

5. Mesure de l'activité NFKB cours de l'infection en utilisant un dosage rapporteur de la luciférase

Transgénique KB-luc les mouches utilisées dans ce test ont été générés précédemment comme décrit dans Kuo et al., 2010 ^2. En bref, le journaliste KB-luc contient 8 répétitions d'une séquence NFkB contraignant qui ont été insérés dans un promoteur en amont d'un cadre de lecture ouvert luciférase.

1. Ajustez les mouches des conditions d'éclairage expérimentales telles que décrites à la section 1.2. Dans cet exemple, 1-4 jours d'âge KB-luc les mouches sont logés dans des flacons contenant une solution de saccharose à 5%, 2% agar milieu alimentaire et mis en lumière constante (LL) pendant 2 jours pour atteindre le même âge que d'autres mouches lors de l'infection.
2. Préparer une microplaque de 96 puits pour les mouches. Chaque puits contient 2 couches de milieu alimentaire (Figure 2), la couche supérieure contient luciférine, le substrat de la luciférase. Ajouter 300 ul d'une solution de saccharose à 5%, solution de gélose à 2% dans chaque puits et laisser se solidifier. Ensuite, ajoutez une couche de 50 ul haut à chaque puits contenant du sucrose 5%, 1% de gélose, et 2 mM de luciférine (Gold Biotechnology, Inc). Luciférine concentrations utilisées pour l'activité du rapporteur de mesure chez la drosophile ont varié dans la littérature, et ont été aussi basses que 100 uM ^13. La concentration requise peut être déterminée empiriquement. Entre les couches de distribution des aliments, couvrir la plaque avec un chiffon à maille fine pour faciliter le séchage tout en préservant la stérilité. La plaque devrait être autorisé à sécher, jusqu'à une heure, afin d'empêcher les mouches de se coincer dans les gouttelettes de condensation. Parce que luciférine est sensible à la lumière, éviter d'exposer les plaques à la lumière plus que nécessaire.
3. Appliquer un film adhésif transparent (Top-Seal-A; Perkin Elmer) pour une plaque de 96 puits de microtitration et perforer à l'aide d'une aiguille fine à une quantité de 2 trous par puits. Ces trous permettent non seulement un échange d'air dans chaque puits, mais aussi de fournir un moyen d'anesthésier les mouches sur une base individuelle. Utiliser une lame bien aiguisée et d'une règle, d'introduire une coupure entre chaque colonne. Ce sera un moyen facile de charger / décharger les mouches par groupes de 8 à la fois.
   Pour charger les mouches dans la plaque de microtitration, retirer les flacons de l'incubateur et les mouches anesthésier sur un pad CO _2. Une charge d'oiseau par une à chaque puits colonne par colonne. Si un avion se coincer par inadvertance sur le joint adhésif, laisser la mouche seulement car ils sont souvent en mesure de se libérer sans intervention. Retour à la plaque de microtitration dans l'incubateur pendant 8-24 h LL pour s'adapter à ce nouvel environnement et à consommer le substrat luciférine.
4. Bactéries Culture, S. marcescens, et préparer une solution d'infection tel que décrit ci-dessus.
5. Anaesthetize til vole à l'aide d'une pointe de la micropipette attachée à une faible pression de CO ₂ lignes. Placez la pointe de la micropipette directement au-dessus des trous de ventilation effectués pour chaque puits. Prenez garde à s'assurer que la pression de CO ₂ est suffisamment élevée pour anesthésier la volée, mais suffisamment faible pour éviter les blessures à la mouche. Par groupes de huit, individuellement transférer chaque volée à un pad CO _2, et infecter tel que décrit ci-dessus. Après l'infection, retournez chacune à la mouche à son origine bien refermé et la microplaque.
6. Luminescence mesure (TopCount NXT-luminescence et compteur à scintillation; Perkin-Elmer). Le compteur de luminescence TopCount contient une cassette d'empilement de plaques, ce qui permet des lectures programmées et automatisées en permanence par incréments souhaités pour toute longueur de temps (habituellement jusqu'à cinq jours). Cette fonction n'est pas disponible sur tous les instruments, et la collecte de données pour les expériences réalisées avec d'autres instruments peuvent donc être moins fréquents. Le compteur de luminescence est logé dans un room avec une température contrôlée et horaire d'éclairage. Lors du chargement des plaques dans la cassette d'empilement, empiler les plaques contenant les mouches claires entre les plaques vierges pour veiller à ce que les mouches recevoir la lumière. Programme du luminomètre selon les spécifications du fabricant de recueillir des lectures toutes les heures pendant un minimum de 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 sec et à exprimer le résultat en points (unités arbitraires) par seconde. Cette valeur est une moyenne sur 3 lectures par puits. Exporter les fichiers de données vers un tableur et d'effectuer une analyse standard, la représentation graphique des résultats de luminescence.

Résultats

1. L'infection favorise le sommeil. Dans cet exemple, Canton-S (CS) des mouches de type sauvage et les mouches mutantes dépourvues d'un gène NFkB, relish (Rel ^{E20) 14,} ont été chargés dans deux DAM2 moniteurs d'activité (n = 32 pour chaque génotype) et infectées comme décrit ci-dessus. Les mouches ont été maintenus dans une lumière constante pour éliminer l'influence de l'horloge circadienne sur le comportement et l'infection ^2,7,8. Les mutants ont été

Discussion

Ce protocole décrit une approche pour étudier la façon dont le comportement, en particulier dormir, est liée à des paramètres de la réponse immunitaire. Ces paramètres comprennent la charge bactérienne, les résultats de survie et l'activité NFKB, mesurée par un rapporteur luciférase in vivo. Ensemble, ces paramètres fournissent des informations sur la façon dont une mouche peut combattre une infection. Charge bactérienne et les résultats de survie sont des paramètres de la réponse immunit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du produit	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			Équipement
Incubateurs	Percival Scientific, Inc	I30BLLC8 I36VLC8	Tout incubateur capable de faire tourner la lumière programmée / horaires de température est appropriée.
Drosophila activitiy Moniteurs	Trikinetics Inc, Waltham, MA	DAM2	Comme il est décrit ailleurs 6, ce système nécessite une interface informatique, des logiciels, et autres accessoires.
Pyrex Tubes	Trikinetics Inc, Waltham, MA	PGT-5x65
Scintillation pour microplaques et compteur de luminescence	Perkin Elmer	TopCount NXT Détecteur 12	Tout lecteur de microplaque capable de détecter la luminescence peut être utilisé pour ce type de dosage journaliste. TopCount contient plusieurs détecteurs et un empileur automatique, elle est capable d'être programmé pour lire en continu à partir de plusieurs plaques.
FluorChem 8900	Alpha Innotech		Imagerie des cultures bactériennes est facultative; n'importe quel système d'imagerie numérique avec une capacité de lumière visible est suffisante.
Micropipette Puller	Tritech Research, Inc	Narishige PC-10
			Provisions
Borosilicate Glass capillaires	Mondiale précision Instrument Inc	1B100F-4
Seringue de 3 ml	Fisher Scientific	BD 305482
Aiguilles pour seringues	Fisher Scientific	BD 305196	18 G - couper la pointe de l'aiguille pour éviter d'endommager la tuyauterie.
Tubulure en silicone, id (0,030 ") od (0,065") Épaisseur du mur (0,018 ")	VWR	60985-706	Utilisé pour fixer les aiguilles capillaires en verre à une seringue
Robinet 3 voies	Société américaine Pharmaseal	K75
Kontes Pellet Pilon Moteur sans fil	Fisher Scientific	K749540-0000
Kontes Pellet Pilon	Fisher Scientific	K749521-1590
Les billes de verre de 3 mm	VWR	26396-630
Microplaques Microlite 1 +	Thermo Scientific	7571	Select plaques de 96 puits qui sont appropriés pour la luminescence - ils doivent être opaques.
TopSeal-A :96-Microplaques ainsi	PerkinElmer	6005185	Microplaques Press-On Film d'étanchéité adhésif
D-luciférine, sel de potassium	Or Biotechnology, Inc	LUCNA
			Logiciel
Insomniac2	Disponible sur demande auprès des auteurs	coutume, écrit par Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College)	Logiciel Matlab base qui a été utilisée en routine pour l'analyse du sommeil 2,6,11
Drosonex	Disponible sur demande auprès des auteurs	coutume, écrit par Thomas Coradetti (Software trottoir)	Un PC MSVC6 programme utilisé pour l'analyse de survie à partir des fichiers de données brutes collectées dans leTrikinetics système
Photoshop CS3	Adobe		Utile pour obtenir des numéros de ufc / plaque à partir d'images numériques (en option)