면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

요약

면역 반응과 행동 사이의 링크를 이해하기 위해, 우리는에서 전위의 행동을 측정하는 방법을 설명 Drosophila 세균 감염뿐만 아니라 모니터링 생존, 박테리아 부하, 그리고 타고난 면역, NFκB의 핵심 레귤레이터의 실시간 활동에 의해 면역 반응을 마운트하는 파리의 능력 중.

초록

면역 반응 및 호스트의 행동 사이의 복잡한 상호 작용이 종의 다양한에서 설명되었습니다. 초과 수면은 특히 포유류 ¹ 감염에 대한 응답으로 발생하는 것으로 알려져 있으며, 최근 Drosophila melanogaster ^2에 설명되어 있습니다. 그것은 일반적으로 수면 감염 동안 호스트에 유용합니다하고 강력한 면역 체계 ^3,4의 유지를위한 중요하다는 것을 것을 가능합니다. 그러나,이 가설을 지원하는 실험적 증거는 ⁴ 한정되어 있으며, 면역 반응시 초과 수면의 기능은 불분명 남아 있습니다. 우리는이 복잡한 문제를 해결하기 위해 종합 접근 방식을 사용했으며, 간단한 유전자 모델 시스템 fruitfly Drosophila melanogaster에서 연구를 실시하고 있습니다. 우리는 파리에서 전위의 행동과 수면을 측정하기위한 표준 분석을 사용하여,이 분석은 파리 infecte의 행동을 측정하기 위해 사용되는 방법을 보여줍니다박테리아의 병원성 변형과 D. 이 분석은 또한 감염 기간 동안 개인 파리의 생존 기간을 모니터링하는 데 유용합니다. 면역 기능의 추가 조치는 감염과 NFκB, Drosophila의 본래 면역 반응의 중심 핵심 전사 인자의 활성화를 삭제하는 파리의 능력이 포함되어 있습니다. 감염 동안 생존 결과 및 세균 통관 모두가 함께 저항 및 감염에 대한 내성의 지표입니다. 관용이 시스템 ⁵ 내 병원균 높은 수준의에도 불구하고 감염 피해를 제한함으로써 생존 할 수있는 호스트의 능력으로 정의되는 동안 저항은 감염을 취소 할 수 파리의 능력을 말합니다. 감염시 NFκB 활동의 실시간 모니터링은 감염 동안 생존의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 간단 assays에 Drosophila의 사용은 수면의 유전 및 분자 분석을 용이하게및 면역 반응과 두 복잡한 시스템은 서로 영향을받습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 세균 감염의 대상이 파리에서 수집 한 네 가지 판독을 취득하는 두 설정 (그림 1)를 사용합니다. 2) 생존 결과; 3) 플라이에 세균로드, 그리고 4) 생체 내 NFκB의 기자 활동의 실시간 측정이 출력) 슬립 / 웨이크 동작을 하나 포함되어 있습니다. Drosophila에서 사용할 수있는 유전 도구와 함께, 이러한 측정은 면역 기능과 행동 사이의 분자 링크로 기계론의 통찰력을 제공합니다.

1. 파리의 측정 전위의 활동과 수면

1. 전위의 활동을 측정하고 Drosophila 활동 모니터링 시스템 (DAM2, Trikinetics), 인큐베이터, 어두운 방, 그리고 실험 동물과 활동 튜브의 준비를 포함, 파리에서 잘하는 데 사용되는 설정은 이전에 ⁶ 설명되어 있습니다. 동일한 접근 방식은 약간의 수정, 여기에 사용됩니다.
   1. 보육의 조명은 보육 자체에 의해 제어됩니다. 따라서 컴퓨터와 인큐베이터 사이의 시간 설정을 동기화하는 것이 중요합니다.
   2. 활동 튜브는 드 - 이온화 물에 뜨거운 접시에 끓고에 의해 다시 사용하기 위해 청소됩니다. 세제의 작은 금액은 최초의 종기에 추가되어 튜브는 잘 헹구어 그리고 두 번 더 끓여 있습니다. 실이 튜브를 연결하는 데 사용하는 경우, 사용 활동 튜브는 (음식, 왁스, 비행과 실을 포함) 원사의 사전 제거하지 않고 청소 할 수 있습니다.
2. 전에 실험을 시작하기 늦은 pupal를 포함하는 장소 문화는 실험 조명 및 기타 환경 조건에 적응 3-4일을위한 인큐베이터에 파리가 무대. 라이트 : 어둡거나 일정한 조건이 일반적으로 수면 행동을 측정하기 위해 사용되었습니다. 이 예에서는 파리는 면역 반응과 행동 ^2,7,8에 circadian 시계의 영향을 제거하기 위해 일정한 빛에 적응하고 있습니다. 그림 1A에 설명 된 바와 같이 , Trikinetics DAM2 활동에 부하 1~4일 오래된 파리는 감염 이전에 3 일 최소 ^6, 기록을 설명 모니터링합니다.

2. 박테리아의 병원성 변형으로 파리를 감염

1. 여기에 설명 된 프로토콜은 S.에 대한 특정이 성장 및 유지 관리가 용이 marcescens. 다른 박테리아 종 장기 저장 및 문화 조건 프로토콜. S.를 달라집니다 marcescens는 -80 ° C.에 15~50%의 글리세롤에 저장됩니다 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 autoclaved 50 % 글리세롤 1 볼륨에 - 장기 저장을 위해 준비하려면 하루 아침에 박테리아 문화 2 권 (1.0 OD ₆₀₀ = 0.5)을 섞는다. 이 17 %의 최종 글리세롤 농도가 높아집니다. -80에서 튜브를 저장 ° C. 박테리아의 소스 사용에 단기을 준비하려면, 멸균 200 μl 피펫 팁과 냉동 주식을 긁어 LB 한천 플레이트에 세 방향 행진을 수행합니다. 37 & D에서 하룻밤 판을 품다예를 들어, C 절연 식민지를 할 수 있습니다. 4 ° C.에서 판을 저장
   예약 감염 하루 전날, 5 ML의 LB 매체를 포함하는 문화 관에 멸균 200 μl 피펫 팁과 잠수함 팁과 LB 한천 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하십시오. 박테리아가 밤새 성장, 또는 최대 37 번 보육 흔드는 내부의 16 시간에 ° C 및 250 RPM이 기하 급수적으로 성장 단계에 도달 할 때까지. OD _600에서 분광 광도계로 농도를 측정합니다. 이 단계의 농도는 0.5에서 1 범위. 농도가 너무 높은 경우 박테리아를 하위 문화와 최적의 농도를 다른 몇 시간 동안 성장합니다. 화염 소스 근처에있는 절차를 수행합니다. 일부 박테리아 균이 항생제 내성에 대한 설계하고 성장하고 적절한 항생제를 위해 선택하는 중간에 추가됩니다. S.은 marcescens (ATCC # 8100)는 항생제 내성을하지 않으며 따라서 항생제없이 멸균 매체에서 재배되어 있습니다. 무균 기술을 확인하려면 모의 cultu을컨트롤로 세균없이 재.
   파리를 감염시킬 솔루션은 박테리아 (= 0.1 OD ₆₀₀ 희석)과 PBS에 1 %의 식용 색소 (브릴리언트 블루 FCF)가 포함되어 있습니다. PBS에 감염 솔루션과 1% 파란 식용 색소에 사용되는 LB 매체의 상응하는 금액을 추가하여 주입 제어를위한 솔루션을 준비합니다. 얼음에 솔루션을 저장합니다.
2. 파리를 주입하기 위해 유리 바늘을 준비합니다. micropipette 풀러 (Narishige)를 사용하여 고급 팁에 유리 모세관 (OD = 1mm, ID = 0.58 mm, WPI) 당겨. 해부 현미경 아래에서 개방은 주사기로 흡입을 적용하여 분사 액체로 채울만큼 크고하지만 주입 과정 중에 손상을 최소화 할 수있을만큼 작은 수 있도록 바늘의 끝을 깨고 고급 집게를 사용합니다. 팁을 깨는 후, 팁 크기는 40-50 μm 주변에 있어야합니다. 유리 바늘은 튜브의 길이와 3 참조 플라스틱 주사기에 부착되어 있습니다. 주입 매체의 흐름을 수동으로 긍정적 인 압력 또는 S를 적용 제어됩니다주사기로 uction. 주사기 장치가 감염 및 제어 주사 모두에 사용됩니다으로 주입 유체와 함께 고무 튜브를 오염하지 마십시오.
3. CO ₂ 패드에 올려 퍼팅으로 파리를 마취. CO _2는 패드를 ...을 축이다하고 패드에 파리의 조작을 복잡하게 할 수 있습니다 정전기를 줄이기 위해 물을 밀봉 된 용기를 통해 전달됩니다. 등쪽 가슴의 scutellum 위의 지역에 유리 바늘을 농담으로 파리를 삽입. 파리에 주입 매체의 전달은 식용 색소에 의해 확인된다 - 파리 시스템을 통해 식용 색소 확산 등 푸른십시오. 제 3 절에 설명 된대로 파리에 발생 박테리아의 복용은 아래, 정량화 할 수 있습니다. 일부 실험 디자인은 PBS와 음식 색으로하지만, 세균이없는 파리를 주입하여 무균 부상을 수신하는 제어 그룹을 포함합니다.

3. 박테리아로드를 결정

evaluatin 한 가지 방법g 세균 감염에 대한 면역 반응은 세균로드 후 감염을 결정하는 것입니다. D. melanogaster는 전체 플라이는 개인에서 총 세균 수를 추정하기 위해 균질 할 수 있기 때문에이 매개 변수를 결정 할 수있는 좋은 모델입니다. 이 프로토콜 뒤에 근거는 Luria 국물 (LB) 페트리 접시에 한천 (LB 플레이트)와 같은 고체 매체에 성장하면, 하나의 세균이 보이는 구별 식민지를 형성 해당합니다. 따라서, homogenate의 일련 dilutions을 생성하고, LB 플레이트에 희석 homogenate를 확산, LB 액체 매체에 감염된 파리가 homogenizing하여 파리 감염 세균 세포의 수를 결정 할 수 있습니다. PBS와 음식 색으로하지만, 세균없이 주입 파리의 제어 그룹은 감염이 다른 세균 종으로 오염되지 않았 음을 확인하는 데 사용됩니다. 이 조건에 LB 한천 플레이트에 아무런 식민지이 없어야합니다.

1. 이 사용됩니다 모든 자료를 압력솥실제 균질화 단계를 수행하기 전에 절차. 이 균질화에 사용되는 가위, LB 미디어 및 pestles로 잘라 200 μl 피펫 팁이 포함되어 있습니다. 파리 homogenizing하기 전에 최소 1 일 10cm 무균 배양 접시에 autoclaved LB / 한천 매체를 주입하여 접시를 준비합니다.
2. 마취과 얼음에 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 매장 튜브에 파리를 수집합니다.
3. 오염을 방지하기 위해 불 근처의 균질화를 수행합니다. 이러한 S. 같은 박테리아 변종을 사용하여 특히 감염없이 파리를 포함하는 제어 균질화하는 것이 좋습니다 항생제 저항하지 marcescens. 10 파리 각 당 실험 조건 2 그룹의 최소 균질화. homogenate 당 사용되는 파리의 수는 실험에 의해 결정됩니다. 다른 사람들이 homogenate 당 3-10 파리에서 사용했던 일부 그룹은 개별 파리 ⁸ 사이의 세균로드에 변화를 평가하는 데 유용합니다있는 homogenate에 하나씩 파리를 사용한^9-12 유전자형이나 실험 조건에서 비교할 수 있습니다.
   1. 파리를 포함하는 각 microcentrifuge 관에 400 μl LB 매체를 추가하고 작은 모터와 유봉 (Kontes)를 사용하여 균질화.
   2. 소독 컷 피펫 팁을 사용하여 시리얼은 180 μl LB 매체를 포함하는 1.5 μl microcentrifuge 관 20 μl 균질 LB / 박테리아 매체를 추가하여 homogenate 1시 10분을 희석. 피펫 팁을 절단하는 것은 플라이의 잔해로부터 막힘을 방지하고 적절한 볼륨이 전송되는 것을 보장합니다.
   3. 희석 계수는 경험적으로 결정하고 즉시의 유전자형, 사용 된 박테리아 변종, 그리고 실험 조건에 따라 달라집니다 있습니다. 야생의 유형은 S.에 감염 파리에 대한 marcescens은 이후 감염 즉시 무균 파리에 1시 10분 ² 1시 10분 ³ dilutions을 사용하고, 파리에 대한 1시 10분 ⁴ 1시 10분 ⁵ dilutions은 24 시간 후 감염을 균질.
   4. 마이크에서 100 μl LB / 박테리아 매체를 추가하십시오및 최종 희석을 포함 rocentrifuge 관은 더 유통을 보장하기 위해 유리 공 (VWR)를 사용하여 LB 플레이트에 매체를 확산.
   5. 백퍼센트 EtOH 솔루션에 유리 공을 폐기하십시오. 밤에는 37 ° C 배양기에서 LB 플레이트를 배치합니다.
   6. 선택 단계로 LB 플레이트 (; 알파 Innotech FluorChem 8900)의 이미지를 얻기 위해 시각적 인 빛으로 이미징 시스템을 사용합니다. 판 자체에 또는 포토샵 소프트웨어 (어도비 포토샵 CS3)에서 계산 도구를 사용하여 판의 이미지에서 어느 식민지의 숫자를 계산합니다.
   7. 수 집락 형성 수식을 사용하여 플라이 당 단위를 계산 : [N / (N * D * V)] * V, n은 LB 플레이트에 성장 식민지의 = 수, N은 = 파리의 수는 하나의 풀링 microcentrifuge 관, D = 희석 요인, 그리고 V 각 플레이트에 확산 솔루션의 = 볼륨, V homogenate의 = 초기 볼륨입니다.

4. 감염 후 수면과 생존 기간을 평가

1. 에세균 하중을 측정하기위한 수확하지 않는 파리, 다른 7-10일에 대한 동작을 모니터링 계속합니다. 생존 기간은 즉시, 환경 조건의 유전자형의 영향을, 그리고 박테리아 종은 감염에 사용됩니다.
2. ~ 10 일 후, 실험을 종료 다운로드 이전에 ^6에 설명 된대로 행동 데이터를 처리합니다. MATLAB에 기반을두고 있습니다 Insomniac2 사용자 정의 소프트웨어는, 잠 매개 변수를 분석하는 데 사용됩니다. 그것은 행동 분석에서 죽은 파리를 제거하는 것이 중요합니다. 일반적으로,이 감염과 플라이 유전자형의 종류에 따라 감염 후 첫 일 이내에으로 분석을 제한합니다. 분석의 죽음은 모든 활동 카운트가 0에 도달 할 때까지 표시됩니다. 생존 분석을 용이하게하기 위해, Drosonex, 마이크로 소프트 비주얼로 작성된 맞춤 소프트웨어 C + + 6.0, Trikinetics 댐 시스템에서 원시 데이터 파일을 처리하는 데 사용됩니다. Excel 파일은 각 비행의 생존 기간 (시간)과 같은 소프트웨어 보고서는 활동 DAT을 컴파일하나의 스프레드 시트로 모든 모니터에서, 그리고 %가 날아보고는 사용자에 의해 설정된 시간이 지남에 살아. 엑셀 파일은 추가적인 분석을 위해 다른 통계 소프트웨어 패키지에 통합하도록 설계되어 있습니다.

5. 루시 페라 제 리포터 분석을 사용하여 감염 동안 NFκB 활동을 측정

유전자 변형 κB 룩이 분석에 사용되는 파리는 이전에 다음과 같은 쿠오 외에 설명되어 생성되었다., 2010 ^2. 간단히, κB 룩의 기자는 루시 페라 열린 독서 프레임의 상류 발기인에 삽입 된 NFκB 바인딩 순서의 8 반복이 포함되어 있습니다.

1. 로 1.2 항에 설명 된 실험 조명 조건에 파리를 조정합니다. 이 예에서는 1~4일 이전 κB 룩의 파리는 5 %의 자당, 2 % 한천 식품 매체와 감염 동안 다른 파리와 같은 연령에 도달하기 2 일 일정 빛 (LL)에 배치를 포함하는 병에 자리 잡고 있습니다.
2. 파리에 96 잘 microplate를 준비합니다. 각각의 잘 음식 매체 2 층 (그림 2)를 포함하고, 상위 계층은 luciferin, 루시 페라 제의 기판이 포함되어 있습니다. 5 %의 자당, 각도에 2 % 한천 솔루션 300 μl를 추가하고 더욱 강화 할 수 있습니다. 다음으로, 각도 포함 5 %의 자당, 1 %의 한천, 2 MM luciferin (골드 바이오 주식회사)에 50 μl 상단 레이어를 추가합니다. Drosophila의 측정 기자 활동에 사용 Luciferin 농도는 문헌에서 다양 한 100 μM ^13과 같은 낮은되었습니다. 필요한 농도는 경험적으로 결정될 수있다. 식품 레이어를 분배 사이에 불임을 유지하면서 건조 촉진하는 좋은 메쉬 천으로 커버 플레이트. 플레이트는 응축 방울 속에 갇히지에서 파리를 방지하기 위해 최대 1 시간까지, 철저하게 건조 할 수 있어야합니다. luciferin는 빛에 민감한이기 때문에, 필요 이상의 불을 접시를 노출하지 마십시오.
3. 명확한 접착제 필름을 (톱 적용- 인감-A, Perkin 엘머)도 당 2 구멍의 수량에 좋은 바늘을 사용하여 96 - 웰 microwell 판과 구멍이 있습니다. 이 구멍은 각 잘에 공기 교환을 허용하지 않습니다뿐만 아니라, 개별적으로 파리를 마취하는 방법을 제공합니다. 날카로운 칼날과 직선 가장자리를 사용하여, 각 열 사이에 컷을 소개합니다. 이 한 번에로드 / 8의 그룹으로 파리를 언로드 할 수있는 쉬운 방법을 제공합니다.
   microwell 판에 파리를로드하려면, CO ₂ 패드에 보육과 마취의 파리에서 튜브를 제거합니다. 로드는 열 별 열 각 잘에 하나씩 이동합니다. 그들은 종종 개입없이 스스로를 해방 할 수 있습니다으로는 접착제 씰에 불편한 점이 실수로 날아 경우, 혼자 파리를 출발합니다. 8-24 시간 새로운 환경에 적응하고 luciferin 기판을 섭취하는 LL의 보육에 microwell 판을 반환합니다.
4. 문화 박테리아, S. marcescens, 이상 설명한 바와 같이 감염을위한 솔루션을 준비합니다.
5. 마취시키다 t그는 저압 CO ₂ 라인에 부착 된 micropipette 팁을 사용하여 이동합니다. 직접 각도에 한 환기 구멍 위의 micropipette 팁을 놓으십시오. CO ₂ 압력이 파리를 마취시키다 할 수있을만큼 높지하지만 플라이로 부상을 방지 할 수있을만큼 낮은 수 있도록주의보세요. 여덟 그룹에서 개별적으로 CO ₂ 패드를 각 플라이를 전송하고, 위에서 설명한대로 감염. 감염 후, 잘 원래 각 플라이를 반환하고 microplate를 봉인.
6. 측정 발광 (TopCount-NXT의 발광과 섬광 카운터, Perkin-엘머). TopCount 발광 카운터는 시간의 길이 (보통 최대 5 일)를 원하는 단위에서 지속적으로 프로그래밍 및 자동 판독이 가능 플레이트에 대한 스택 카세트가 포함되어 있습니다. 이 기능은 모든 악기에서 사용할 수 없습니다, 다른 악기와 함께 실험을위한 데이터 수집 따라서 덜 자주있을 수 있습니다. 발광 카운터는 RO에 자리 잡고 있습니다제어 온도 및 조명 일정 톰. 스태킹 카세트에 접시를로드 할 때, 파리 빛받을 수 있도록 명확한 빈 플레이트들 사이의 파리가 들어있는 접시를 쌓아. 판독 24 시간의 최소 시간 간격으로 수집하는 제조업체의 사양에 따라 프로그램을 luminometer. 이 예에서 경보기가 10 초 각 우물을 읽고 초당 카운트 (임의의 단위)로 결과를 표현하는 프로그램입니다. 이 값은 잘 당 3 판독에 걸쳐 평균입니다. 스프레드 시트에 데이터 파일을 내보내 표준 분석을 수행, 발광의 결과를 그래프.

결과

1. 감염은 수면을 촉진합니다. 이 예에서는 광동-S는 (CS) 야생 타입 파리와 NFκB 유전자 양념 (상대적 ^{E20) 14이} 부족한 돌연변이 파리는 두 DAM2 활동 모니터에로드 된 (N = 각 유전자형 32)와 위에서 설명한대로 감염. 파리는 행동과 감염 ^2,7,8에 circadian 시계의 영향을 제거하기 위해 지속적으로 빛을 유지했다. 로 이전 ¹¹ 설명 상대적 ^E20의 돌연변이는 CS에 isogenized?...

토론

이 프로토콜은 문제는, 특히 잠, 면역 반응 매개 변수에 연결되는 방식을 조사 할 방법을 설명합니다. 이 매개 변수는 생체의 루시 페라 제 리포터에 의해 측정으로 세균로드, 생존 결과 및 NFκB 활동이 포함되어 있습니다. 함께 이러한 매개 변수는 파리가 감염을 싸울 수있는 방법을 잘에 대한 정보를 제공합니다. 박테리아 부하와 생존 결과는 Drosophila의 직접적인 측정을 포함 면역 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
재료 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
			장비
인큐베이터	퍼시벌 과학 주식회사	I30BLLC8 I36VLC8	프로그램 된 조명 / 온도 일정을 실행의 보육 할 수있는이 적합합니다.
Drosophila Activitiy이 모니터	Trikinetics 주식회사, Waltham, MA	DAM2	다른 곳에서 6 설명한 바와 같이,이 시스템은 컴퓨터 인터페이스, 소프트웨어 및 기타 액세서리를 필요로합니다.
Pyrex 유리 튜브	Trikinetics 주식회사, Waltham, MA	PGT-5x65
Microplate의 섬광과 발광 카운터	Perkin 엘머	TopCount NXT 12 탐지기	발광을 검출 할 수있는 모든 microplate 리더는 기자 분석이 유형의에 사용될 수 있습니다. TopCount는 여러 탐지기와 자동 스태커를 포함, 그것은 여러 접시에서 계속 읽을 프로그래밍 될 수있다.
FluorChem 8900	알파 Innotech		박테리아 문화 이미징은 선택 사항이며 시각적 조명 기능이있는 디지털 이미징 시스템은 충분합니다.
Micropipette 풀러	Tritech 연구 주식회사	Narishige PC-10
			용품
붕규산 유리 모세 혈관	세계 정밀 인스트루먼트 주식회사	1B100F-4
3 ML의 주사기	피셔 과학	BD 30548이
주사기 바늘	피셔 과학	BD 305,196	18 G - 튜브의 손상을 방지하기 위해 바늘의 끝을 잘라.
실리콘 배관, ID (0.030 ") OD (0.065") 벽 두께 (0.018 ")	VWR	60985-706	주사기에 유리 모세관 바늘을 부착하는 데 사용
3 웨이 콕	미국 Pharmaseal 회사	K75
Kontes 펠렛 유봉 무선 자동차	피셔 과학	K749540-0000
Kontes 펠릿 유봉	피셔 과학	K749521-1590
유리 공 3mm	VWR	26396-630
Microplate Microlite 1 +	열 과학	7571	Select 발광에 적합한 플레이트 96 - 웰은 - 그들이 불투명해야합니다.
TopSeal-A :96-잘 Microplates	PerkinElmer	6005185	Microplate 보도 -에 접착제 씰링 필름
D-Luciferin, 칼륨 소금	골드 생명 공학 주식회사	LUCNA
			소프트웨어
Insomniac2	작성자 요청시 사용 가능	사용자 정의, 레슬리 에쉬 모어 박사에 의해 작성된 (웨스트 민스터 대학)	수면 2,6,11의 분석을 위해 정기적으로 사용 된 MATLAB 기반 소프트웨어
Drosonex	작성자 요청시 사용 가능	사용자 정의, 토마스 Coradetti (보도 소프트웨어)에 의해 작성된	원시 데이터 파일에서 생존 분석에 사용되는 PC MSVC6 프로그램은 함께 수집Trikinetics 시스템
포토샵 CS3	어도비 벽돌		디지털 이미지 (선택 사항)에서 CFU / 접시의 숫자를위한 유용한