Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor em Drosophila Durante a infecção bacteriana, bem como a capacidade das moscas de montar uma resposta imune pela sobrevivência de monitorização, a carga bacteriana e, em tempo real, a actividade de um regulador chave da imunidade inata, NFkB.

Resumo

A interacção complexa entre a resposta imune e comportamento hospedeiro tem sido descrito em uma grande variedade de espécies. Excesso de sono, em particular, é conhecida a ocorrência de uma resposta à infecção em mamíferos ¹ e recentemente também tem sido descrita em Drosophila melanogaster ^2. É geralmente aceite que o sono é benéfico para o hospedeiro durante a infecção, e que é importante para a manutenção de um sistema imunológico robusto ^3,4. No entanto, a evidência experimental que suporta esta hipótese é limitada ^4, e a função do sono em excesso durante uma resposta imune permanece obscura. Nós usamos uma abordagem multidisciplinar para resolver este problema complexo, e realizaram estudos no sistema modelo simples genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Usamos um ensaio padrão para medir o comportamento locomotor e do sono em moscas, e demonstrar como este ensaio é utilizado para medir o comportamento de moscas infected com uma estirpe patogénica de bactérias. Este teste é também útil para monitorizar a duração de sobrevivência em moscas individuais durante uma infecção. Medidas adicionais de função imunitária incluem a capacidade de moscas para limpar uma infecção e à activação de NFkB, um factor de transcrição essencial, que é essencial para a resposta imune inata em Drosophila. Tanto resultado da sobrevivência e depuração bacteriana durante a infecção em conjunto são indicadores de resistência e de tolerância à infecção. Resistência se refere à capacidade de moscas para limpar uma infecção, enquanto que a tolerância é definida como a capacidade do hospedeiro para limitar os danos de uma infecção e, assim, sobrevivem apesar dos níveis elevados de agentes patogénicos no interior do sistema ^5. Monitoramento em tempo real da atividade NFkB durante a infecção fornece insights sobre um mecanismo molecular de sobrevivência durante a infecção. O uso de Drosophila nestes ensaios simples facilita as análises genéticas e moleculares do sonoe a resposta imune e como estes dois sistemas complexos são reciprocamente influenciadas.

Protocolo

Este protocolo utiliza duas configurações (Figura 1) para adquirir quatro leituras diferentes recolhidos de moscas submetidos a uma infecção bacteriana. Estas saídas incluem 1) sono / vigília comportamento, 2) O resultado da sobrevivência, 3) a carga bacteriana em tempo real, e 4) em tempo real a medição de actividade de NFkB repórter in vivo. Em combinação com as ferramentas genéticas que estão disponíveis em Drosophila, estas medições fornecem uma visão mecanicista para a ligação molecular entre a função imunológica e no comportamento.

1. Atividade medida Locomotor e do sono nas moscas

1. A configuração utilizada para medir a atividade locomotora e dormir em moscas, que inclui o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila (DAM2, Trikinetics), incubadoras, quarto escuro, ea preparação de animais experimentais e tubos de atividade, tem sido descrito anteriormente ^6. A mesma abordagem é usada aqui, com algumas pequenas modificações.
   1. A iluminação da incubadora é controlada pela incubadora si. Portanto, é importante para sincronizar o ajuste de tempo entre computador e incubadoras.
   2. Tubos de actividade são limpos para reutilização por ebulição numa placa quente, em água desionizada. Uma pequena quantidade de detergente é adicionado para a primeira fervura, os tubos são bem enxaguados e fervido duas vezes mais. Se fio é utilizado para ligar o tubo, os tubos da actividade utilizados (contendo comida, cera de mosca, e os fios) pode ser limpo sem remoção prévia dos fios.
2. Antes de se iniciar um ensaio, as culturas contendo lugar de pupa tardia encenado moscas em incubadoras de três a quatro dias para se adaptar a iluminação experimental e outras condições ambientais. Light: condições escuras ou constante têm sido comumente usado para medir o comportamento do sono. Neste exemplo, as moscas são aclimatadas à luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano sobre a resposta imune e comportamento ^2,7,8. Tal como descrito na Figura 1A , a carga moscas 1-4 dias de idade para a actividade DAM2 Trikinetics monitores como descrito ^6, e registo durante um mínimo de três dias antes da infecção.

2. Moscas infectar com uma cepa patogênica de bactérias

1. O protocolo aqui descrito é específico para o S. marcescens, que são fáceis de cultivar e manter. Protocolos para a armazenagem a longo prazo e as condições de cultura para outras espécies de bactérias podem variar. S. marcescens são armazenados em glicerol a 15-50% à temperatura de -80 ° C. Para preparar para a armazenagem a longo prazo, misturar 2 volumes de cultura bacteriana durante a noite _(DO600 = 0,5 - 1,0) para 1 volume de glicerol a 50% autoclavada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Isto irá resultar numa concentração final de glicerol de 17%. Armazenar os tubos a -80 ° C. Para preparar um curto prazo na utilização de fonte de bactérias, raspar o material congelado com uma ponta de pipeta estéril de 200 ul e realizar uma sequência de três vias numa placa de agar LB. Incubar a placa durante a noite a 37 & dpor exemplo, C para obter colónias isoladas. Armazenar a placa a 4 ° C.
   Um dia antes da infecção programada, escolher uma única colónia da placa de agar LB com um ponta de pipeta estéril de 200 uL e submergir a ponta para um tubo de cultura que contém 5 ml de meio LB. Bactérias crescem durante a noite, ou até 16 horas dentro de um agitador de incubador a 37 ° C e 250 rpm até que ele atinja a fase de crescimento exponencial. Medir a concentração com um espectrofotômetro a OD _600. A concentração desta fase varia de 0,5 a 1. Se a concentração for demasiado elevada, a subcultura das bactérias e crescem durante mais várias horas, para obter uma concentração óptima. Execute o procedimento perto de uma fonte de chama. Algumas estirpes bacterianas foram concebidas para a resistência aos antibióticos e são cultivadas e seleccionadas para antibiótico apropriado adicionado ao meio. S. marcescens (ATCC # 8100) não são resistentes a antibióticos e por isso são cultivadas em meio estéril, sem antibiótico. Para verificar técnica estéril, fazer um simulado culture sem bactérias, como controlo.
   A solução para infectar moscas contém bactérias (diluído para 0,1 OD = ₆₀₀₎ e coloração de alimentos a 1% (Brilliant Blue FCF) em PBS. Prepara-se uma solução de controlo de injecção por adição de quantidade equivalente de meio LB utilizado em solução infecção e corante alimentar azul a 1% em PBS. Armazenar as soluções em gelo.
2. Prepare agulhas de vidro para injetar as moscas. Puxe capilares de vidro (od = 1 mm, id = milímetros 0,58, WPI) para uma ponta fina usando um extrator micropipeta (Narishige). Sob um microscópio de dissecação, utilizar uma pinça fina para quebrar a ponta da agulha de modo que a abertura é grande o suficiente para encher com o líquido de injecção através da aplicação de sucção com uma seringa, mas suficientemente pequena para minimizar os danos para a mosca durante o processo de injecção. Depois de romper a ponta, o tamanho da ponta deve ser cerca de 40-50 ^ m. A agulha de vidro é ligada a uma seringa de plástico de 3 cc, com uma extensão de tubagem. O fluxo de meio de injecção é controlado manualmente a aplicação de pressão positiva ou sução com a seringa. Evitar a contaminação do tubo de borracha com o fluido de injecção, como o aparelho de seringa é utilizado tanto para a infecção e as injecções de controlo.
3. Anestesiar moscas, colocando-os em um bloco de CO _2. CO ₂ é passado através de um recipiente selado de água para humedecer a almofada e para reduzir a electricidade estática, o que pode complicar a manipulação de moscas sobre a almofada. Injectar moscas picando a agulha de vidro na região acima do escutelo do tórax dorsal. A passagem do meio de injeção na mosca é verificada pela coloração de alimento - as moscas ficam azuis como os spreads corante alimentar através do sistema. A dose de bactérias que as moscas recebem podem ser quantificados como descrito na Seção 3, abaixo. Alguns projetos experimentais incluir um grupo controle que recebe lesão asséptica injetando moscas com coloração PBS e comida, mas sem bactérias.

3. Determinar a carga bacteriana

Uma abordagem para evaluating a resposta imune contra a infecção bacteriana é determinar a infecção bacteriana pós carga. D. melanogaster é um excelente modelo para determinar este parâmetro, porque a mosca inteira pode ser homogeneizado para estimar o número total de bactérias dentro de um indivíduo. A lógica por trás deste protocolo é de que, quando cultivadas em meio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar em placas de Petri (placa LB), uma única bactéria forma uma colónia visível distinguíveis. Portanto, por homogeneização moscas infectadas em meio líquido LB, gerando uma série de diluições do homogeneizado, e espalhando o homogeneizado diluído em placas de LB, o número de células bacterianas que infectam uma mosca pode ser determinada. Um grupo de controlo de moscas injectadas com PBS e corante alimentar, mas sem bactérias deve ser usada para verificar se a infecção não foi contaminada com outras espécies bacterianas. Não deve haver colónias na placa de agar LB nesta condição.

1. Autoclavar todos os materiais que irão ser utilizados para estaprocedimento antes de realizar o passo de homogeneização real. Isso inclui 200 dicas Pipetar cortadas com tesoura, mídia LB, e pilões utilizados para a homogeneização. Preparar as placas vertendo meio LB / agar autoclavada em 10 centímetros placas de Petri estéreis, pelo menos, 1 dia antes da homogeneização moscas.
2. Anestesiar moscas e recolher em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e tubos armazenar em gelo.
3. Realizar a homogeneização perto de uma chama para evitar a contaminação. A homogeneização de controlo contendo moscas sem infecção é recomendada em especial quando se utiliza uma estirpe bacteriana tal como S. marcescens, que não são resistentes a antibióticos. Homogeneizar um mínimo de 2 grupos de 10 moscas cada condição experimental por. O número de moscas utilizadas por homogenato é determinado pelo experimentador. Alguns grupos utilizaram uma mosca por homogenato, o qual é útil para avaliar a variação na carga bacteriana entre moscas individuais ^8, ao passo que outros autores utilizaram 3-10 moscas por homogenatoa comparação entre o genótipo ou condição experimental ^9-12.
   1. Adicionar 400 ul de meio LB a cada tubo de microcentrífuga contendo moscas e homogeneizar utilizando um pequeno motor e um pilão (Kontes).
   2. Usando pontas de pipetas estéreis cortadas, serial diluir a 1:10 homogenado por adição de 20 ul de homogeneizado meio LB / bacteriano a 1,5 ul de tubo de microcentrifugadora contendo 180 ul de meio LB. Cortar as pontas da pipeta impede o bloqueio de detritos mosca e assegura que um volume adequado está a ser transferido.
   3. Factor de diluição é determinado empiricamente e dependerá do genótipo da mosca, a estirpe bacteriana utilizada, e da condição experimental. Para o tipo selvagem moscas infectadas com S. marcescens, utilizar as diluições de 1:10 ou 1:10 ^{2 3} para moscas homogeneizadas imediatamente após a infecção e, em diluições de 1:10 ou 1:10 ^{4 5} para moscas homogeneizado 24 horas pós-infecção.
   4. Adicionar 100 ul de LB / média bacteriana a partir do microfonetubos contendo rocentrifuge diluição final e espalhar o meio sobre uma placa de LB usando esferas de vidro (VWR) para assegurar uma distribuição uniforme.
   5. Descartar as bolas de vidro em 100% de solução de EtOH. Colocar as placas de LB numa incubadora a 37 ° C durante a noite.
   6. Como etapa opcional, utilizar um sistema de imagem de luz visual para obter uma imagem das placas de LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar o número de colónias ou no prato em si ou a partir da imagem da chapa usando a ferramenta de contar com o software Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
   7. Calcula-se o número de unidades formadoras de colónias por mosca utilizando a fórmula: [n / (N * D * v)] * V, onde n = número de colónias que cresceram na placa de LB, N = o número de moscas agrupados num tubo de microcentrífuga, D = factor de diluição, e v = volume da solução espalhada sobre cada placa; V = volume inicial do homogeneizado.

4. Avaliar sono e Duração sobrevivência após infecção

1. Paramoscas que não são colhidas para medir a carga bacteriana, continue monitorando o comportamento por mais 7-10 dias. Duração sobrevivência é influenciada pelo genótipo da mosca, condições ambientais e espécies de bactérias utilizadas para a infecção.
2. Depois de ~ 10 dias, terminar o experimento, baixar e processar dados comportamentais como descrito anteriormente ^6. Insomniac2 software personalizado, que é baseado em Matlab, é usado para analisar parâmetros do sono. É importante eliminar moscas mortas da análise comportamental. Normalmente, isto restringe a análises para dentro do primeiro dia após a infecção, dependendo do tipo de infecção e do genótipo da mosca. Morte no ensaio é indicado pelo tempo de todas as contagens de actividade atingiu zero. Para facilitar a análise de sobrevivência, Drosonex, software personalizado escrito em Microsoft Visual C + + 6.0, é usada para processar arquivos de dados brutos do sistema DAM Trikinetics. Os relatórios do software como arquivos de Excel, duração sobrevivência de cada mosca (em horas), compila atividade data partir de todos os monitores em uma única planilha, e relata a sobrevivente voa por cento ao longo do tempo, conforme definido pelo usuário. Os arquivos do Excel são projetados para integrar em outros pacotes de software estatísticos para análise posterior.

5. Medir actividade de NFkB durante a infecção usando um ensaio de repórter de luciferase

Transgenic kB-luc moscas utilizadas neste ensaio foram gerados como descrito anteriormente em Kuo et al., 2010 ^2. Resumidamente, o repórter kB-luc contém oito repetições de uma sequência de ligação de NFkB, que foram inseridos em um promotor a montante de um quadro de leitura aberta de luciferase.

1. Ajuste moscas às condições de iluminação experimentais, como descrito na seção 1.2. Neste exemplo, 1-4 dias de idade kB-luc moscas são alojados em frascos contendo 5% de sacarose, 2% de meio de alimento agar e colocadas em luz constante (LL), durante 2 dias, para atingir a mesma idade de outras moscas durante a infecção.
2. Prepara-se uma microplaca de 96 poços para as moscas. Cada poço contém 2 camadas de meio de alimento (Figura 2), a camada de topo contém a luciferina, o substrato da luciferase. Adicionar 300 ul de sacarose a 5%, solução de agar a 2% a cada poço e deixa-se solidificar. Em seguida, adicionar uma camada de 50 ul de topo de cada uma das cavidades contendo sacarose a 5%, ágar a 1%, e 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentrações de luciferina utilizadas para a actividade repórter de medição em Drosophila têm variado na literatura, e têm sido tão baixas quanto 100 uM ^13. A concentração necessária pode ser determinada empiricamente. Entre as camadas de distribuição de alimentos, cobrir a placa com um tecido de malha fina para facilitar a secagem, mantendo a esterilidade. A placa deve ser deixado secar completamente, até uma hora, a fim de evitar que as moscas de ficar presa em forma de gotas de condensação. Porque luciferina é sensível à luz, evite expor as placas à luz mais do que o necessário.
3. Aplique uma película adesiva (Superior-Seal-A; Perkin Elmer) a uma placa de micropoços de 96 poços e perfurada com uma agulha fina com uma quantidade de 2 orifícios por poço. Estes buracos não só permitir a troca de ar a cada poço, mas também irá fornecer uma forma de anestesiar moscas em uma base individual. Usando uma lâmina afiada e borda em linha reta, introduzir um corte entre cada coluna. Isto irá proporcionar uma forma fácil de carregar / descarregar as moscas em grupos de 8 de cada vez.
   Para carregar as moscas para a microplaca, retire os frascos da incubadora e moscas anestesiar sobre uma almofada _de CO _2. Carga voa um por um para cada poço, coluna por coluna. Se um voar inadvertidamente ficar preso ao selo adesivo, deixar a voar sozinho como eles são capazes de libertar-se sem intervenção. Voltar a microplaca para a incubadora no LL de 8-24 horas para se ajustar ao novo ambiente e para consumir o substrato luciferina.
4. Cultura de bactérias, S. marcescens, e preparar uma solução para a infecção, tal como descrito acima.
5. Anestesiar tvoa usando uma ponta de micropipeta ligada a uma baixa pressão de linha de CO _2. Colocar a ponta da micropipeta directamente por cima dos orifícios de ventilação feitas para cada poço. Tomar cuidado para assegurar que a pressão _de CO ₂ é suficientemente elevada para anestesiar a mosca, mas baixa o suficiente para evitar danos à mosca. Em grupos de oito, cada mosca transferir individualmente para uma almofada de CO _2, e infectar como descrito acima. Após a infecção, o retorno de cada mosca ao seu original e feche bem a microplaca.
6. Luminescência medida (TopCount NXT-luminescência e Contador de Cintilação; Perkin-Elmer). O contador de luminescência TopCount contém uma cassete de empilhamento de chapas, o que permite leituras programadas e automatizadas continuamente em incrementos desejadas para qualquer período de tempo (geralmente superior a cinco dias). Este recurso não está disponível em todos os instrumentos, e coleta de dados para experimentos realizados com outros instrumentos podem, portanto, ser menos frequentes. O contador de luminescência é abrigado em um room com uma temperatura controlada e horário de iluminação. Ao carregar as placas para a cassete de empilhamento, empilhar as placas contendo as moscas claras entre placas em branco para garantir que as moscas recebem luz. Luminómetro programa de acordo com as especificações do fabricante para recolher as leituras de hora em hora durante um mínimo de 24 hr. Neste exemplo, os detectores são programados para ler cada poço por 10 seg e expressar o resultado como contagens (em unidades arbitrárias) por segundo. Este valor é a média entre 3 leituras por poço. Exportar os arquivos de dados para uma planilha e realizar uma análise padrão, gráficos os resultados de luminescência.

Resultados

1. Infecção promove o sono. Neste exemplo, Canton-S (CS) moscas do tipo selvagem e moscas mutantes desprovidos de um gene NFkB, Relish (Rel ^{E20) 14,} foram carregados em dois DAM2 monitores de actividade (n = 32 para cada genótipo) e infectadas, como descrito acima. As moscas foram mantidas em luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano no comportamento e infecção ^2,7,8. Os mutantes foram isogenized ^E20 Rel de CS, tal como descrito previamente ^11.

Discussão

Este protocolo descreve uma abordagem para investigar como o comportamento, particularmente dormir, está ligada a parâmetros de resposta do sistema imunológico. Estes parâmetros incluem a carga bacteriana, resultado da sobrevivência e actividade de NFkB, como medido por um repórter de luciferase in vivo. Juntos, esses parâmetros fornecem informações sobre o quão bem uma mosca pode lutar contra uma infecção. A carga bacteriana e os resultados de sobrevivência são parâmetros da resposta imune que e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome de material	Companhia	Número de catálogo	Comentários
			Equipamento
Incubadoras	Percival Scientific, Inc.	I30BLLC8 I36VLC8	Qualquer incubadora capaz de executar luz programada / horários de temperatura é adequada.
Drosophila ATIVIDADE Monitores	Trikinetics Inc., Waltham, MA	DAM2	Conforme já descrito 6, este sistema requer uma interface de computador, software e outros acessórios.
Pirex de vidro Tubos	Trikinetics Inc., Waltham, MA	PGT-5x65
De cintilação de microplacas e contador de luminescência	Perkin Elmer	TopCount NXT 12 detector	Qualquer leitor de microplacas capaz de detecção de luminescência pode ser utilizado para este tipo de ensaio de repórter. TopCount contém múltiplos detectores e um empilhador automático, que é capaz de ser programado para ler continuamente a partir de múltiplas placas.
FluorChem 8900	Alpha Innotech		Imagem de culturas bacterianas é opcional; qualquer sistema de imagem digital com capacidade de luz visual é suficiente.
Micropipeta Puller	Tritech Research, Inc.	Narishige PC-10
			Abastecimento
Borosilicato capilares de vidro	Precision Instrument Inc. mundo	1B100F-4
Seringa 3 ml	Fisher Scientific	BD 305482
Agulhas de seringa	Fisher Scientific	BD 305196	18 G - corte da ponta da agulha, para evitar danos na tubagem.
Tubulação do silicone, id (0,030 ") od (0,065") Espessura da parede (0,018 ")	VWR	60985-706	Utilizado para a fixação de agulhas capilares de vidro para uma seringa
Torneira de 3 vias	Empresa americana Pharmaseal	K75
Kontes Pellet Pilão Motor Cordless	Fisher Scientific	K749540-0000
Kontes Pellet Pilão	Fisher Scientific	K749521-1590
Bolas de vidro 3 milímetros	VWR	26396-630
Microplate Microlite 1 +	Thermo Scientific	7571	Select placas de 96 poços que são apropriados para luminescência - devem ser opacas.
Topseal-A Microplacas :96-bem	PerkinElmer	6005185	Microplaca Press-On Film vedação adesiva
D-luciferina, sal de potássio	BioTechnology Gold, Inc.	LUCNA
			Software
Insomniac2	Disponíveis mediante solicitação aos autores	personalizado, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College)	Matlab baseado em software que tem sido utilizada rotineiramente para a análise de sono 2,6,11
Drosonex	Disponíveis mediante solicitação aos autores	personalizado, escrito por Thomas Coradetti (Software Calçada)	Um PC MSVC6 programa utilizado para a análise de sobrevivência a partir de arquivos de dados brutos coletados com oTrikinetics sistema
Photoshop CS3	Adobe		Útil para a obtenção do número de ufc / placa a partir de imagens digitais (opcional)