毛穴グラデーション、高分子電解質とその間接的モニタリングの金属インプラントのマルチスケール変更<em生体内で&gt;</em

要約

このビデオでは、それらの機能を改善し、細胞移動を制御するために多孔性金属インプラントのための改質技術を実証する。技術は、3Dおよび基底膜の製造は2-Dにおける細胞移動を制御する模倣における細胞移動を制御するための細孔勾配の発達が挙げられる。また、血液タンパク質の分析を介して生体内インプラント統合を監視するためのHPLCベースの方法が記載されている。

要約

特に、金属インプラント、チタンインプラントは、広く臨床応用に使用されている。組織におけるこれらのインプラントへと統合·成長の組織が成功した臨床転帰のための重要なパラメータである。組織の統合を改善するために、多孔性金属インプラントが開発されてきた。細孔領域は全体構造の機械的特性を損なわずに官能化することができるので、金属発泡体の開気孔率は、非常に有利である。ここでは、チタンのマイクロビーズに基づく多孔質チタンのインプラントを使用して、このような変更を説明します。チタンなどの疎水として固有の物理的性質を用いることにより、基底膜を有するようにマイクロビーズ系金属インプラント内であると同時に疎水性の細孔勾配を得ることができる親水性、天然ポリマーに基づく模倣。 3次元細孔勾配は、例えば、凍結抽出法によるポリ-L-乳酸（PLLA）などの合成ポリマーによって形成されている。 2Dナノファイバーシュール面は天然架橋剤（ゲニピン）との架橋工程に続いて、コラーゲン/アルギン酸塩を用いて形成されている。このナノファイバー膜は2つの反対荷電分子の層（のLbL）蒸着法、コラーゲンとアルギン酸塩によって層によって建てられました。最後に、これは多くの多細胞組織のために必要であるように異なる領域が、異なる細胞型を収容することができるインプラントを得ることができる。により、異なる細胞型によって異なる方向にこのようセルラー移動を制御することができる。このようなシステムは、気管再生の特定の場合について説明するが、他の標的器官のために変更することができる。細胞遊走と異なる孔勾配を作成するための可能な方法の分析が精緻化される。そのようなインプラントの分析における次のステップは、移植後のそれらの特徴付けである。しかし、金属製のインプラントの組織学的分析は、生体内で金属製のインプラントに監視ホスト反応のためにこのように長くて面倒なプロセスですCGAと異なる血液タンパク質監視に基づいてlternative方法も記載されている。これらの方法は、インビトロ 、カスタムメイドの移行およびコロニー形成試験に現像に使用することができ、また、組織学せずインビボで官能化された金属インプラントの分析のために使用される。

概要

現在利用可能な金属製のインプラントは、荷重支持用途に適しているが、それらの非分解性はそれらに^1を囲む組織との強力な界面を確保するための設計を必要とする。 インビボでのコロニー形成および成長中の細胞促進する構造を設けることにより、金属インプラントの寿命が²延ばすことができる。公然と多孔性金属インプラントは、また、インプラントの良い植民地を確保するための組織界面工学のための材料を約束している。それらが積極的に整形外科用インプラントとして、また、気管^3-5インプラントとして使用されている。しかしながら、このような細孔分野における細胞運動を正確に制御するように解決すべき問題が残っています。このプロセスを制御するために、障害が発生しても、他の一端および再狭窄に不完全な植民地化につながる可能性があります。また、これらのインプラントの更なる官能化は、例えば成長因子の送達等の高機能を実現するために必要である、異なる細胞タイプ^6-8の指示血管新生と同時移動。血管組織によるインプラントのコロニー形成が望まれるように気管インプラントのために、これは重要である。それはインプラントの開存性を低下させるので、気管内腔への成長の制御不能な組織は望ましくない。

細胞運動を制御するための一つの可能​​性は、サイズ排除である。標的細胞と指定された合成ポリマーと相互作用する能力の大きさを知ることにより、効果的に細胞運動の深さを決定することができる細孔の勾配を開発することが可能である。例えばこのような外性線維芽細胞などの結合組織細胞の侵入のために十分な大きさですが、管腔内管状インプラントの植民実効支配を彼らの動きを防ぐために（10μm未満）十分に小さい細孔アーキテクチャを作成することによって達成することができる。

このような凍結dryiとして利用ポア作成方法からngの、粒子浸出^、9,10発泡ガス、必要な機器の最小限の細孔勾配の迅速形成するための方法を適応するのが最も簡単で凍結抽出¹¹である。この方法では、ポリマー溶液は、有機溶媒と水との二元混合物中で凍結される。その後、溶媒をエタノールなどの混和予め冷却液によって抽出を介して交換される。凍結および抽出条件は、細孔の形状及び大きさを決定し、抽出、抽出液の移動を制御することができる方法で行われている場合、孔サイズおよび形状は一方向に変調することができる。

多細胞組織のための第二のステップは、それらの相互作用を制御するために、異なる細胞タイプ間の多孔障壁の形成である。これはまた、それらの要件^12,13に応じて、異なる種類の細胞ごとに異なる微小環境の可用性のために必要である。気管はbronchと喉頭をつなぐ管状の器官である私。それは粘液を作り出す相互分散杯細胞とインナーpseudostratified繊毛上皮の裏地を持っています。気管の3次元構造および安定性がCリング状の軟骨によって維持される。このように、人工的な気管内結合組織と毛様体上皮層の間に定義されて接合があるはずです。 3D構造は結合組織の部分のために必要であるが、上皮細胞の遊走は、創傷の方向の動きとクロージャを達成するために、基底膜のような表面を必要とします。高分子電解質多層膜（PEMは）基底膜の模倣を取得するための一つの可能​​なオプションです。層毎法（のLbL）は薄く、機能表面コーティングを得るための多用途のプロセスである。それは、その特性がそのような高分子電解質種、pHを単に変える変数によって変化させることができるナノスケールの表面コーティングを得るために順次に2つの反対に荷電した高分子電解質とそのビルドアップ、静電的相互作用に基づいているレイヤ番号、キャッピング層の添加、架橋等のLbL方法の主な利点の1つは、下地基板のトポグラフィに準拠する能力である。このように、制御された条件下でこの方法はまた、多孔質構造の表面被覆率を得るために使用することができる。コラーゲンは、高分子電解質の1つとして使用されている場合には、基底膜の表面を模倣することができるナノファイバーの構造を得ることができる。チタンの疎水性は^、14このような構造の開発を可能とfibrillarityは厚いコーティングで保存することができます。この方法は、表面上の細胞の接着と移動も制御することができる。順次抽出し、凍結のLbLフィルムコーティングを用いることにより、細胞運動を長手方向と円周方向に、横方向に制御することができる構造が^15を得ることができる。

ここでは、することができ、それらの疎水性の動作を使用することにより、チタンインプラントのための2つの新たな修正方法を説明します疎水性合成ポリマーii）の細胞増殖および高分子電解質多層によるライニングの形成をサポートするインプラント表面上に厚さのポリマーフィルム層の形成とマクロポーラス酸化チタンインプラント内のマイクロポアの勾配のi）の形成：種々の多孔質インプラントの変形例に延長した。これらの方法は、連続的に又は別々に使用することができる。彼らは管理された移行と多細胞組織^16,17で異なる種類の細胞の空間的な組織化を確保する構造を提供します。気管の具体的なケースでは、インプラントのための望ましい結果は、再狭窄および高分子電解質多層膜上の繊毛上皮細胞の内側のライニングを形成することなく細孔勾配内線維血管組織による植民地化されるだろう。

インプラントの統合を制御する一つの方法は、in situで 、ホストとの集積化の期間中に小さな外科的介入を行うことである。できるTようにするために介入のタイミングを決定し、O、それはインプラントの全身作用に関する情報を有することが重要である。 C反応性蛋白（CRP）は、感染および臨床の場における炎症反応のモニタリングに使用されている。クロモグラニンAは（CGA）も同様に使用することができ、炎症¹⁸のレベルを観察するために、より正確な結果を提供するかもしれない。 インビボでの金属インプラント統合を観察可能な方法として、我々は高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）およびその後のタンパク質配列決定による動物の血液試料の特性によってインプラント全身作用を連続的に監視手順を示す。この方法の精緻化は、通常、エンドポイント組織学的分析を回避するために使用することができる。金属インプラントの組織切断が長く、面倒で高価なプロセスであり、特定の時点で行うことができる。この理由から、インプラント健康について堅牢な情報を提供する血液検査でしょううまく設計された動物実験に関する最近のEU規則で義務付けられて動物実験を減らすために可能なルートである。

ここに提示方法は官能化を介して、金属インプラントの性能を向上させる、または既存のインプラントを監視する別の方法を有するように使用することができる。

プロトコル

1。マクロポーラス金属インプラントにおける微小孔グラデーションの調製

1. エタノールでインプラント（例えば400-500ミクロンのサイズ範囲、Neyco SAS、フランスで医療グレードチタンビーズで作られたインプラントなど）をきれいにした後、15分間アセトン中で超音波処理。
2. インプラントのサイズや形状に合わせて設計·製造​​テフロン型（標準実験のために、2cmの高さと直径1.5cmの円筒状金型が使用されている）。金型は、特定の部分が抽出時に除去することができるように、モジュラーなければならない。このような金型の設計が導かようにして抽出液の移動を強制することによって、抽出プロセスの制御を確実にする。
3. i）は、インプラントのサイズ、IIを決定するため底部）マンドレルと取り外し可能ですⅲ）アウターコア：気管を置き換えるために設計された筒状のインプラントの場合は、構造は3つの部分から構成されるべきである。このように、孔径勾配が内側に向かって外側から形成することができる。
<李は>合成高分子（PLLA）溶液を調製：凍結/抽出のためPLLAソリューションは、ジオキサンおよび水（：V 87:13％、v）との二元混合で準備する必要があります。
4. 均一な溶液を得るために60℃に混合物を加熱する。 60°Cは、インプラントへの溶液の導入のために使用される精密したガラスシリンジ用温度抵抗の上限であるとして選択。
5. 高濃度（≥6％）、高分子量PLLA溶液が使用される場合、即座に加熱した後、インプラントに溶液を導入する。そうでなければ、溶液のゲル化は、フルイマージョンずに発生します。
6. インプラントの気孔率に対する必要性高分子溶液の体積を計算し、凍結溶液の体積の精度変化を考慮に入れることができる。
7. 0.1μlの精度で精密ガラス注射器とインプラントへのソリューションをご紹介します。ポリマー濃度の下限である再現可能な細孔勾配形成のための3％それが6％上記の厚い試料で均一な分布を得ることが困難になる一方。しかし、特定の用途のために他の濃度を使用することができる。
8. サンプルを直接-80℃で、または室温で30分の前に潜伏期間のいずれかを凍結。凍結条件は、部分的に孔形成を決定し、このようにして凍結条件を目的とする気孔率に応じて調整することができる。 -80℃でサンプルを一晩続ける℃の
9. 抽出：80％プリチルドEtOHにインプラントを浸します。一晩-20℃で抽出を行う。気孔率勾配を得るためには、管状のインプラントと円盤状のインプラントのための底部分を除くすべての部分のための心棒を除くすべての金型部品を取り外します。金型を簡単に分離するためにあらかじめ冷却メスを使用してください。
10. -20℃で一晩¹⁹で抽出した後、残りの金型部品を取り外し、空気がインプラントを乾燥させます。特性評価のための構造体の水銀ポロシメーター分析の全体的な気孔率が必要である。水銀ポロシメータ測定は、インプラントと相互分散より小さい孔の両側の孔に対応する明確なピークを示した。しかしながら、より重要なデータは、走査型電子顕微鏡^（SEM）20と孔サイズ分布のための画像Jによって分析することができる管腔内と管腔外表面の気孔率の差である。毛穴勾配の検証のために、サンプルを凍結破砕とSEMで断面を観察します。
11. 使用されるインプラント、及びチタンの容量を反射光の開放多孔性の性質のため、多孔質インプラント内に標識された細胞のzスタックを行うことが可能である。 PKH26またはカルセイン-AMで細胞を標識し、共焦点レーザー顕微鏡でインプラントを可視化する。

2。コラーゲン/アルギン酸多層膜と多孔性金属インプラントの表面コーティング

1. ビルドアップのために多層のうち、最も高い再現性を浸漬ロボットが得られる。ディッピングロボットが利用できない場合は、これらの手順を手動で行うことができます。
2. 医療グレードI型コラーゲンとアルギン酸ナトリウムを使用してください。最適化された濃度は、pHが3.8にクエン酸緩衝液中のNaCl 150mMの中でそれぞれに0.5グラム/ Lである。
3. 溶液の均質性を確実にするために一晩コラーゲン溶液に溶解する。 3.8の酸性pHが必要である構造が中性pHにおける架橋前の不安定なような層の安定したビルドアップのために。
4. 代替的に、コラーゲンおよびアルギン酸塩の溶液に浸漬することにより、インプラントを浸漬するロボットシステムにより層を堆積させる。堆積時間は、各後続層15分である。 5分間のpH 3.8で150mMのNaClで堆積ステップ間に構造をすすぐ。
5. 高分子電解質多層生産に使用される浸漬ロボットとインプラントの利用のためのデザイン固有のホルダー。どちらチタンの表面のみimplaに層を堆積NTSまたはインプラントは第1節で説明したように修正された。
6. 基底膜の安定化ゲニピンと模倣：V比：1：04 Vでのジメチルスルホキシド（DMSO）/クエン酸緩衝液（150mMのNaCl、pHは3.8）で架橋溶液を準備します。広範囲の濃度が使用され、100mMのは、架橋のために十分であることができる。 DMSOコンポーネントに最初ゲニピン及び凝集を回避するために、後で水成分を加え溶かす。
7. 12〜24時間の間に架橋溶液中に浸漬することによって試料を架橋する。その後クエン酸緩衝液のおびただしい量（pH値3.8）で洗い流してください。
8. 洗浄工程の後、UV処理（30分）または抗生物質/抗真菌薬浴（ペニシリン/ストレプトマイシン、ファンギゾン）のいずれかのサンプルを滅菌する。
9. 模倣基底膜の品質を決定する主なパラメータは、その厚さ及び繊維の直径である。接触モードで得られた原子間力顕微鏡（AFM）画像を用いて繊維直径を算出する。のサンプルを乾燥させ撮像前の窒素フロー。画像Jソフトウェアとフィブリルの平均厚さを決定するには画像あたり少なくとも10の繊維の太さを定量化する。
10. フィルムの厚さは、AFMを用いてスクラッチ試験によって決定することができる。ドライ（COL / _ALG）24 / COL多層フィルム。フィルムに傷を注射針を使用してください。光顕微鏡でスクラッチの局在した後、スクラッチの境界にある10×10μmの²面にAFMで画像を得る。フィルム層の厚さを提供するAFMソフトウェアを用いて得られたプロフィールから高さを計算する。

3。血漿の分析によってインビボでインプラントの統合の間接的モニタリング

1. 必要なすべての委員会の承認は各国²¹統治規則に従って動物実験のために取られるべきである。我々のケースで実験動物のケアと利用（国立研究評議会、2010）のためのガイドが続いていると目のストラスブールの倫理委員会の大学の電子承認が得られる。
2. 標的部位に注入を行う。ここで与えられた血液モニタリングプロトコルを15mm気管切除のニュージーランド白ウサギに気管の交換のために使用された。
3. 移植後のフォローアップの毎日は、このようなと自分の体重を記録する一般的な動物のウェルビーイング（手術部位、呼吸の速度周り治癒）montioringとして必要である。
4. 血液検査を検証するには、血中CRP値のためのELISAテストなどの十分に確立されたメソッドを使用します。多くの動物のためのCRP検査が利用可能であり、ウサギのために使用される特定の試験は、 表1に記載されている。同様に、西部はCGAレベルの測定のためにブロッティング使用。モノクローナル抗CGA抗体（抗CGA _47-68）は 、このプロトコルを使用した。
5. プラズマの特性評価のために、ウサギの耳介静脈から血液サンプルを得る。 4℃で20分間5,000 rpmで遠心°; C.分析のために得られた上清を使用してください。我々の手順では、これらの試験は、週ごとに行うが、より頻繁なテストも可能であるている。
6. 血漿タンパク質含量の相HPLC精製を逆：0.1％トリフルオロ酢酸（1:1であり、v：v）でウサギ血漿を抽出する。ダイオネクスHPLCシステム（アルティメット3000、サニーベール、CA USA）を使用してエキスを精製300-5C18-カラム逆相ヌクレオシルに（4×250ミリメートル、粒径が5μm、空隙率、300Å）。
7. 214と280nmの吸光度を記録します。使用される溶媒系は、i）で溶媒：水およびii 0.1％（v / v）のトリフルオロ酢酸（TFA））溶媒B：0.09％（v / v）の70％でTFA（v / v）のアセトニトリル - 水。
8. 溶出のためにグラデーションを使用して700μL/分の流量を使用してください。ピーク分画を収集します。高速真空アプリケーションによって蒸発によって分画を集中。それは完全な乾燥度前にスピード真空を停止することが重要です。
9. 共同以上の異なる時間点で得られたピークを関連付ける移植期間のURSE。自動エドマン配列決定によって同定するための移植の過程で一貫した傾向を見せている精製​​されたペプチドを使用してください。
10. ペプチドの自動エドマンシング：Prociseマイクロシーケンサを使用した自動エドマン分解によって精製されたペプチドのN末端配列を決定します。ポリブレン処理したガラス繊維フィルターにサンプルをロードします。次のステップは、C ₁₈カラム（PTH C-18、2.1×200 mm）の²²上のクロマトグラフィーによるフェニルチオ-アミノ酸（PTH-Xaaは）の同定である。配列が得られた後、それはSWISS-Protのデータベースを使用してブラストソフトウェアによって識別することができる。

結果

毛穴勾配の形成

PLLA溶液の濃度を変えることにより、インプラントの管腔外側の細孔の大きさを制御することが可能である。孔の大きさや形状が著しくチタ ​​ンインプラント（ 図1a及び1b）の存在によって影響を受けた。 40-100程度と低濃度の利用の範囲であった細孔サイズが小さな孔が生じた。腔内側孔径に制限された抽出によって支配と線維?...

ディスカッション

細孔勾配は、インタフェース組織工学における重要なツールであり、ここで説明するシステムは、細胞遊走を研究するために細孔勾配を形成するために、単独で、または金属インプラントと組み合わせて使用​​することができる。システムは、有機溶剤を扱う化学ヒュームフードを除く任意の余分な設定や特別な機器を必要としない、したがって、それは、生物学の研究室に適用すること?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.