Gözenek Gradiyentler Polielektrolitler ve Bunların Dolaylı İzleme ile Metalik İmplant Çok Ölçekli Modifikasyon<em&gt; In vivo</em

Özet

Bu videoda, onların işlevselliğini artırmak ve hücre göçü kontrol etmek için gözenekli metalik implantlar için modifikasyon tekniklerini gösterecektir. Teknikleri 3D ve bazal membran üretimi 2-B hücre hareketini kontrol etmek için taklit hücre hareketini kontrol etmek için gözenek geçişlerini geliştirilmesi yer alıyor. Ayrıca, kan proteinlerinin analizi ile in-vivo olarak izlenmesi implant entegrasyonu için bir HPLC-tabanlı bir yöntem tarif edilmektedir.

Özet

Özellikle metalik implantlar, titanyum implantları, yaygın klinik uygulamalarda kullanılır. Dokularda bu implantlara ve entegrasyon-büyüme Doku başarılı klinik sonuçlar için önemli parametrelerdir. Doku entegrasyonu geliştirmek için, gözenekli metalik implantlar geliştirilmektedir var. Gözenek alanları, bütün yapının mekanik özellikleri tehlikeye atmadan fonksiyonalize edilebilir çünkü metal köpükler açık gözeneklilik çok avantajlıdır. Burada titan, mikro-gözenekli göre titanyum protezler kullanarak bu tür değişiklikleri açıklar. Bu tür titanyum hidrofobik olarak doğal fiziksel özelliklerini kullanarak, bir bazal membran hidrofilik, doğal polimerler esas taklit olması mikroboncuk esaslı metalik implantlar içinde ve aynı zamanda hidrofobik gözenek gradyanları elde etmek mümkündür. 3D gözenek gradyanları gibi dondurarak ekstraksiyon yöntemiyle poli-L-laktik asit (PLLA) gibi sentetik polimerler ile oluşturulmaktadır. 2D nanofibrillar suryüzleri doğal bir çapraz bağlayıcı (genipin) ile bir çapraz bağlama adımı takip kollajen / aljinat kullanılarak oluşturulmaktadır. Bu nanofibrillar film tabakası (LBL) iki zıt yüklü moleküller, kollajen ve aljinat birikimi yöntemi ile tabaka ile inşa edildi. Son olarak, bu pek çok hücreli dokular için gerekli olduğu kadar farklı alanlarda farklı hücre tipleri kalabileceği bir implant, elde edilebilir. Tarafından, farklı hücre tipleri, farklı yönlerde bu şekilde hücresel hareket kontrol edilebilir. Böyle bir sistem, trakea rejenerasyon belirli bir durum için ayrı tarif edilmektedir, fakat diğer hedef organlar için modifiye edilebilir. Hücre göçü ve farklı gözenek gradyanları oluşturmak için olası yöntemleri analizi detaylandırılmıştır. Bu tür implantlar analizinde bir sonraki adım implantasyondan sonra karakterizasyonudur. Ancak metalik implantlar histolojik analiz, in vivo, bir bir metalik implantlar izleme host reaksiyonu için bu nedenle, uzun ve hantal bir süreçtirCGA, farklı kan proteinleri izleme esas lternative yöntem de tarif edilmektedir. Bu yöntemler arasında in vitro ısmarlama göç ve kolonizasyonu testlerinde geliştirmek için kullanılabilir ve aynı zamanda histolojik olmadan, in vivo olarak işlevselleştirilmiş metalik implantlar analizi için kullanılabilir.

Giriş

Şu anda mevcut metalik implantlar yük taşıyan uygulamalar için uygundur, ancak olmayan nitelik kaybı onları ¹ çevreleyen doku ile güçlü bir arayüz sağlamak tasarımları gerektirir. In vivo ve kolonizasyon büyüme hücresel kolaylaştırmak yapılar sağlayarak, metal implantların ömrü ² uzatılabilir. Açıkça gözenekli metalik implantlar ve aynı zamanda implantların iyi kolonizasyonu sağlamak için doku arayüzü mühendislik malzemeleri umut vericidir. Bunlar aktif ortopedik implantlar gibi ve aynı zamanda trakeal implantlar ^3-5 olarak kullanılmıştır. Ancak, gözenek alanlarda hücre hareketi üzerinde kesin kontrol olarak çözülmesi gereken sorunlar hala var. Bu süreci kontrol etmek için başarısızlık bir ucunu ve diğer restenoz içinde eksik kolonizasyon yol açabilir. Ayrıca bu implantlar başka bir işlevselleştirilmesini Bu büyüme faktörlerinin teslim gibi yüksek fonksiyonları gerçekleştirmek için gerekli olan,yönettiği vaskülarizasyon ve farklı hücre tipleri ^6-8 aynı anda hareket. Bir damarlı dokusu ile implantın kolonizasyonu arzu edilir olarak trakeal implantlar için, bu çok önemlidir. Bu implant açıklığı azalır Ancak, trakea lümenine-büyüme kontrolsüz doku istenmeyen bir durumdur.

Hücre hareketi kontrol etmek için bir olasılık boyutu dışlanmasıdır. Hedef hücreler ve belirli bir sentetik polimer ile etkileşim yeteneğini büyüklüğü bilerek etkili bir hücre hareketi derinliğini belirlemek gözenek gradyanları geliştirmek mümkündür. Bağ dokusu extraluminally gibi fibroblast gibi hücreler, ancak lümen bir boru implantın kolonizasyonu üzerinde etkili bir kontrol onların hareket etmesini önlemek için (az 10 mikron) kadar küçük girişi için elde edilebilir yeterince büyük bir gözenek mimari oluşturarak örneğin.

Bu donma-dryi olarak mevcuttur gözenek oluşturma yöntemlering, partikül liç, ^9,10 köpük gaz, gerekli ekipmanların az miktarda gözenek geçişlerini hızlı oluşumu için yöntem uyum için en kolay dondurma-çıkarma ^11'dir. Bu yöntemde, bir polimer çözeltisi bir organik çözücü ve su karışımı içinde bir ikili dondurulur. Daha sonra, çözücü, etanol gibi bir karışabilir önceden soğutulmuş bir sıvı ile ekstraksiyon yoluyla değiştirilir. Dondurma ve ekstraksiyon koşulları gözeneklerin şekil ve boyutunu belirlemek ve ekstraksiyon ekstraksiyon çözeltisi hareketini kontrol edilebilir bir şekilde yapılır, gözenek boyutu ve şekli yönlü olarak modüle edilebilir.

Çok hücreli dokular için ikinci adım, etkileşimi kontrol etmek için farklı hücre tipleri arasında gözenekli engellerin oluşumudur. Bu aynı zamanda onların ihtiyaçlarını ^12,13 bağlı olarak farklı hücre tipleri için farklı mikroçevrelerde durumu için gereklidir. Trakea bronş ile gırtlak bağlayan bir boru şeklinde bir organdıri. Bu mukus üretmesine interdispersed goblet hücreleri ile bir iç yalancı siliyer epitel hayır vardır. Trakea 3D yapısı ve istikrar C-halkalar şeklinde kıkırdak tarafından yapılmaktadır. Böylece, bir yapay trakea bağ dokusu ve siliyer epitel tabakası arasında tanımlanan bir birleşme olmalıdır. Bir 3D yapı bağ dokusu parçası için gerekli olsa da, epitel hücrelerin göç bir bazal membran benzeri gerektiren yüzeye, yaranın yönlü hareketi ve kapatma elde etmek. Polielektrolit çok katmanlı filmler (PEMS) bazal membran taklit elde etmek için olası bir seçenek. Katman-by-katman yöntemi (LBL) ince ve işlevsel yüzey kaplamaları elde etmek için çok yönlü bir süreçtir. Bu, özelliklerini bu polielektrolit türü, pH olarak sadece değişen değişkenler tarafından değiştirilebilir nano yüzey kaplama elde etmek için sıralı bir şekilde iki zıt yüklü polielektrolitler ve inşa-up elektrostatik etkileşimleri dayanmaktadırkatman sayısı, bir kapatma tabakasının yanı sıra, LBL yöntemin en önemli avantajlarından çapraz vb Bir temel yüzey topografya uyması için yeteneğidir. Böylece, kontrollü şartlar altında bu yöntem aynı zamanda gözenekli yapıların yüzey kaplaması elde etmek için de kullanılabilir. Kollajen polielektrolitlerin olarak kullanılırsa, bazal membran yüzeyinde taklit edebilir nanofibrillar yapılar elde etmek mümkündür. Titanyum hidrofobik tür yapıların gelişimi sağlar ve fibrillarity kalın kaplama ¹⁴ muhafaza edilebilir. Bu şekilde yüzey üzerinde hücre bağlanma hareketi ve aynı zamanda kontrol edilebilir. Ardışık dondurularak ekstraksiyon ve Lbl film kaplama kullanılarak, hücre hareketi ve uzunlamasına çevresel olarak, yanal olarak kontrol edilebilir bir yapı ¹⁵ elde edilebilir.

Burada olabilir onların hidrofobik davranış kullanarak titanyum implantlar için iki yeni modifikasyon yöntemleri tarifhidrofobik, sentetik polimerler ii) hücre büyümesi ve polielektrolit çok katmanlı tarafından astar oluşumunu destekler implant yüzeyinde kalın bir polimerik film tabakası oluşumu ile gözenekli titanyum implantlar içinde micropores geçişlerini i) oluşumu: Çeşitli gözenekli implantlar değişiklik uzatıldı. Bu yöntemler, sırayla veya ayrı ayrı kullanılabilir. Bunlar kontrollü göç ve çok hücreli doku ^16,17 farklı hücre tiplerinin mekansal organizasyon sağlamak yapıları sağlamak. Trakea özel durum için, implant için istenen sonucu restenoz ve polielektrolit çok katmanlı üzerinde siliyalı epitel hücrelerinin iç astar oluşumu olmadan mikrogözenek geçişlerini içinde fibrovasküler doku ile kolonizasyon olacaktır.

Implantların entegrasyonu kontrol bir yolu yerinde ev sahibi ile entegrasyon döneminde küçük cerrahi müdahaleler yapmaktır. Güçlü t olmak içinmüdahalelerin zamanlaması karar o, bu implant sistemik etkileri hakkında bilgi sahibi olmak önemlidir. C-reaktif protein (CRP) enfeksiyonun izlenmesi ve klinik ortamlarda inflamatuar yanıt için kullanılmıştır. Kromogranin A (CGA) de benzer bir şekilde kullanılabilir ve inflamasyon ¹⁸ seviyesini gözlemek için daha kesin sonuçlar sağlayabilir. In vivo metalik implant entegrasyon gözlemleyerek bir şekilde olarak, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC) ve sonraki protein sıralama ile hayvan kan örneklerinin karakterizasyonu ile implant sistemik etkileri sürekli bir izleme prosedürü mevcut. Bu yöntemin hazırlanması normal son nokta histolojik analiz kaçınmak için kullanılabilir. Metalik implantlar histolojik kesme uzun, hantal ve pahalı bir süreçtir ve sadece belirli zaman noktalarında yapılabilir. Bu nedenle, implant sağlığı hakkında sağlam bilgi veren kan testi olacaktır iyi tasarlanmışhayvan deneyleri ile ilgili son AB kuralları tarafından zorunlu olarak hayvan deneyleri azaltmak için olası yolları olabilir.

Burada yer alan yöntem ile fonksiyonlandırma metalik implantlar performansını artırmak için ya da var olan implantlar izlenmesi için alternatif bir yol için kullanılabilir.

Protokol

1. Makrogözenekli Metalik İmplantlar içinde Micropore Degradeler hazırlanması

1. Etanol ile implantlar (örneğin, 400-500 um, Neyco SAS, Fransa bir boyut aralığı ile tıp titanyum boncuklardan oluşan implantlar gibi), temiz ve daha sonra 15 dakika boyunca aseton içinde sonikasyon.
2. Implant büyüklüğü ve şekli (standart deneyler için, 2 cm'lik bir yüksekliğe sahip 1.5 cm çapında silindirik bir kalıp kullanılır) göre tasarım ve üretim teflon. Kalıplar belirli parçaları çıkarma sırasında kaldırılabilir, böylece modüler olmalıdır. Böyle bir kalıp tasarımı yönlendirilmiş bir şekilde çıkarma sıvının hareketi zorlayarak ekstraksiyon süreci üzerinde kontrol sağlar.
3. I) implantın büyüklüğü, ii belirlemek için bir alt kısmı) bir mandrel ve çıkarılabilir iii) bir dış çekirdek: trakea değiştirmek için tasarlanmış boru implantlar için, yapının üç parçadan oluşmalıdır. Bu şekilde, gözenek boyutu gradyan içine doğru dışarıdan oluşturulabilir.
4. sentetik polimer (PLLA) çözeltisi hazırlayın: donma / çıkarma PLLA çözeltisi dioksan ve su (v% 87:13, v) ikili bir karışımı hazırlanmış alınması gerekmektedir.
5. Homojen bir çözelti elde etmek amacıyla ° C ile 60 karışım ısıtın. 60 ° bu implant içine çözüm getirilmesi için kullanılacak olan hassas cam şırınga için ısı direnci daha yüksek limit C olarak seçilmiştir.
6. Yüksek bir konsantrasyon (≥% 6), yüksek molekül ağırlıklı PLLA çözümler kullanıldığında, derhal ısıtıldıktan sonra, implant içine çözüm getirmektedir. Aksi takdirde, çözelti jelleştirme tam daldırma olmadan meydana gelir.
7. Implant gözenekli ile ilgili olarak gerekli olan polimer çözeltisi hacmi hesaplamak, dondurulmuş çözeltinin hacmi doğruluğu değişim için dikkate alınabilir.
8. 0.1 ul hassasiyetle hassas cam şırınga ile implantların içine çözüm tanıtmak. Polimer konsantrasyonu için alt sınırTekrarlanabilir gözenek degrade oluşumu için% 3 bu% 6 üzerinde kalın örneklerde homojen dağılımı elde etmek zor olur ise. Bununla birlikte, özel uygulamalar için diğer konsantrasyonlarda kullanılabilir.
9. Örnekler doğrudan -80 ° C'de ya da oda sıcaklığında 30 dakika bir ön kuluçka süresi ya da dondurulur. Donma şartlar kısmen gözenek oluşumunu belirlemek için, böylece donma koşulları amaçlanmaktadır gözenekliliğine göre ayarlanabilir. -80 Numuneler gece boyunca tutmak ° C
10. Ekstraksiyon: Önceden soğutulmuş EtOH% 80 implantlar bırakın. Gece -20 ° C'de çıkarma yapın. Gözenek gradyanları elde etmek için, disk şeklinde bir implant için alt kısmı hariç boru şekilli implant ve tüm parçalar için mandrel hariç tüm kalıp parçaları kaldırın. Kalıbın daha kolay ayrılması için önceden soğutulmuş bir neşter kullanarak.
11. Ekstraksiyon sonra, -20 ° C de bir gece ^19, kalan kalıp parçaları kaldırmak ve hava implantlar kurutun. Karakterizasyonu içinyapı cıva gözeneklilik ölçerine göre analizin tüm gözenek gereklidir. Merkür Porozimetre ölçümleri implant ve küçük interdispersed gözeneklerin her iki tarafında gözenekleri karşılık farklı zirveleri gösterdi. Ancak daha önemli veri bir taramalı elektron mikroskobu (SEM) ²⁰ ile gözenek boyutu dağılımı için Resim J ile analiz edilebilir içi ve dışı yüzeyleri, gözenekler arasındaki farktır. Gözenek gradyan doğrulanması için, numuneler, dondurma-kırılma ve SEM ile kesit görüyoruz.
12. Kullanılan implantlar açık gözenekli doğası, ve titanyum ışık yansıtan kapasitesi nedeniyle, bu gözenekli implantlar içinde işaretli hücrelerin z yığınları yapmak mümkündür. PKH26 veya Calcein-AM ile hücreleri Etiket ve konfokal lazer mikroskobu ile implantlar görselleştirmek.

2. Kollajen / Aljinatta çok Katmanlı ile gözenekli Metalik İmplant Yüzey Kaplama

1. Oluşumu içinçok katmanlı bir, yüksek tekrarlanabilirlik daldırma robotlar ile elde edilir. Bir daldırma robot mevcut değilse Ancak, bu adımları elle de yapılabilir.
2. Medikal kollajen tip I ve sodyum aljinat kullanın. Optimize konsantrasyonları pH 3.8 'de sitrat tampon içinde NaCI 150 mM her biri için 0.5 g / L'dir.
3. Çözeltinin homojenliği sağlamak için gece boyunca kolajen çözeltisi içinde çözülür. 3.8 asidik pH gerekli olan yapı nötr pH içinde çapraz bağlanma öncesi kararsız olduğu gibi, tabakaların stabil birikme için.
4. Alternatif kollajen ve aljinat çözümler implantlar daldırarak bir daldırma robot sistemi ile katmanları Depozito. Depozisyon süresi her bir takip eden katman boyunca 15 dk. 5 dakika boyunca pH 3.8 'de 150 mM NaCI ile birikimi adımlar arasında yapısı durulayın.
5. Polielektrolit çok katmanlı üretiminde kullanılan daldırma robotlar ile implantların kullanımı için tasarım özel tutucu. Ya da titanyumun yüzeyi üzerinde sadece impla tabakalarının biriktirilmesimodifiye NTS veya implantlar, bölüm 1'de açıklandığı.
6. Bazal membran stabilizasyon genipin ile taklit: v oranı: 01:04 v de dimetilsülfoksit (DMSO) / sitrat tampon maddesi (150 mM NaCI, pH 3.8) 'de çapraz bağlama çözeltisi hazırlayın. Konsantrasyonları geniş bir yelpazede kullanılan ve 100 mM çapraz bağlanması için yeterli olabilir. DMSO bileşeninde ilk genipin ve topaklanma önlemek için daha sonra su bileşeni ekleyin çözülür.
7. 12-24 saat arasındaki çapraz bağlama çözeltisi içinde daldırma örnekleri çapraz bağ. Daha sonra sitrat tamponu bol miktarda (pH 3.8) ile durulayın.
8. Yıkama adım sonra, UV tedavi (30 dk) veya antibiyotik / antifungal banyo (Penisilin / Streptomisin, Fungizone) ile ya da örnekleri sterilize edin.
9. Taklit bazal membran kalitesini belirleyen en önemli parametre, kalınlığı ve liflerin çapı vardır. Temas modunda elde Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) görüntüleri kullanılarak lif çapları hesaplayın. A ile numuneleri kuruGörüntüleme önce azot akışı. Resim J yazılımı ile ortalama fibril kalınlığı belirlemek için görüntü başına en az 10 tellerinin kalınlığı ölçmek.
10. Film kalınlığı AFM kullanarak sıfırdan testleri ile belirlenebilir. Kuru (COL / ALG) ₂₄ / COL çok katmanlı filmler. Filmin sıfırdan bir şırınga iğne kullanın. Bir ışık mikroskobu ile sıfırdan lokalizasyonu sonra, sıfırdan sınırında 10 x 10 mm ² yüzeylerde AFM ile görüntüler elde. Film tabaka kalınlığını içerir AFM yazılımı ile elde edilen profiller yükseklikleri hesaplayın.

3. Kan Plazma analizi ile in vivo İmplant Entegrasyon dolaylı İzleme

1. Gerekli tüm komite onayları her ülkenin ²¹ yönetim kurallarına göre hayvan deneyleri için alınmalıdır. Bizim durumumuzda Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (Ulusal Araştırma Konseyi, 2010) için Kılavuzu takip ve inci edilirStrazburg etik komite Üniversitesi E onayı gerekir.
2. Hedef yerinde implantasyon gerçekleştirin. Burada verilen kan izleme protokolü, 15 mm trakeal rezeksiyon Yeni Zelanda tavşanlarında trakeal değiştirilmesi için kullanılmıştır.
3. Implantasyon ardından takip günlük gibi ve ağırlık kaydı genel hayvanların refahı (cerrahi siteleri, nefes alma oranı yaklaşık iyileşme) izleyerek hangi kampanyaların olarak gereklidir.
4. Kan testi doğrulamak için, kan CRP düzeyleri için ELISA testleri gibi köklü bir yöntemini kullanın. Birçok hayvan için CRP testleri mevcuttur ve tavşan için kullanılan özel test Tablo 1'de listelenmiştir. Benzer şekilde, Batı CGA düzeylerinin belirlenmesi için kurutma kullanın. Monoklonal anti-CGA antikorlarının (anti-CGA _47-68), bu protokolü kullanılmıştır.
5. Plazma karakterizasyonu için, tavşan kulak damarlar kan örnekleri elde. 4 az 20 dakika 5000 rpm'de santrifüj °; C. Analizi için elde edilen üstte kalan kullanın. Bizim prosedürde, bu testler haftalık olarak yapılan, ancak daha sık testleri de mümkündür vardır.
6. Plazma protein içeriğinin faz HPLC ile arıtma Ters: trifloroasetik asit içinde% 0.1 (1:1; v: v) ile tavşan plazma çıkarın. Bir Dionex HPLC sistemi (Ultimate 3000, Sunnyvale, CA USA) kullanarak özü arındırın 300-5C18-sütun ters fazlı bir Nucleosil üzerinde (4 x 250 mm; partikül büyüklüğü 5 mikron, gözenek, 300 Å).
7. 214 ve 280 nm'de absorbans kaydedin. Kullanılan çözücü sistemi) i Çözücü A: su ve II içinde% 0.1 (v / v) trifluoroasetik asit (TFA) ile) Çözücü B:% 0.09 (v / v)% 70 TFA (v / v) asetonitril-su.
8. 700 ul / elutions için gradyanları kullanılarak dk 'lık bir akış hızı kullanın. Tepe kesirleri toplayın. Hızlı vakum uygulaması ile buharlaştırma ile fraksiyonlar konsantre ediniz. Bu tam kuruyana önce hızlı vakum durdurmak için önemlidir.
9. Eş farklı zaman noktalarında elde edilen tepe correlateimplantasyon dönemi Urse. Otomatik Edman dizilemesi ile belirlenmesi için implantasyon sırasında tutarlı eğilimler gösteren, saflaştırılmış peptid kullanın.
10. Peptidlerin otomatik Edman dizilemesi: bir mikro-Procise kullanarak otomatik Edman indirgeyicisiyle ile arıtılmış, peptidlerin N-terminal sekansı belirlenir. Polybrene ile tedavi edilen cam elyaf filtreler için örnek yükleyin. Bir sonraki adım, bir C ₁₈ kolonu (PTH, C-18, 2.1 x 200 mm) üzerinde kromatografi ile ²² Phenylthiohydantoin-amino asitleri (PTH-Xaa) tanımlanmasıdır. Dizisi elde edildikten sonra, bu Prot veritabanı kullanılarak Blast yazılımı tarafından tespit edilebilir.

Sonuçlar

Gözenek geçişlerini oluşumu

PLLA solüsyonun konsantrasyonu değiştirerek, implantların ağızlı bir tarafında gözeneklerin boyutunu kontrol etmek mümkündür. Gözenek boyutu ve şekli önemli ölçüde titanyum implantlar (Şekil 1a ve 1b) varlığı ile etkilenmiştir. 40-100 mikron ve daha düşük konsantrasyonların kullanılması küçük gözeneklere neden gelen gözenek boyutları arasında değişmektedir. Intraluminal yan gözenek boyutu k?...

Tartışmalar

Gözenek gradyanları arayüzü doku mühendisliği önemli bir araç olup, burada tarif edilen sistemin, hücre göçü incelemek için gözenek gradyanını meydana getirmek için tek başına ya da metalik implantlar ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Sistem, organik çözücüler işlemek için kimyasal bir davlumbaz dışında herhangi bir ek ayar veya ilave ekipman gerektirir etmez, bu nedenle biyoloji laboratuvarlarında uygulanabilir. Poli (glikolik asit) (PGA), poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) ve po...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.