Многомасштабных Модификация металлических имплантатов с поры градиенты, полиэлектролитов и их косвенного мониторинга<em&gt; В естественных условиях</em

Резюме

В этом видео мы покажем, модификации техники для пористых металлических имплантатов для улучшения их функциональности и контролировать миграцию клеток. Методы включают развитие пор градиенты контролировать движение клетки в 3D и производство базальной мембраны имитирует контролировать движение клетки в 2-D. Кроме того, ВЭЖХ, метод на основе мониторинга интеграции имплантата в естественных условиях с помощью анализа крови белков описано.

Аннотация

Металлические имплантаты, особенно титановые имплантаты, которые широко используются в клинической практике. Ткань в-рост и интеграцию этих имплантатов в тканях являются важными параметрами для успешных клинических исходов. Для того чтобы улучшить ткани интеграции, пористые металлические имплантаты в стадии разработки. Открытая пористость пены металлического очень выгодно, поскольку площадей пор может быть функционализированные без ухудшения механических свойств всей конструкции. Здесь мы опишем такие модификации использованием пористых имплантатов на основе титана на микрошариках титана. При использовании присущие физические свойства, такие как гидрофобность титана, можно получать гидрофобный пор градиенты внутри микрошариков на основе металлических имплантатов и в то же время иметь базальной мембраны имитируют основе гидрофильных, природных полимеров. 3D пор градиенты образуются синтетические полимеры, такие как поли-L-молочной кислоты (PLLA) сублимационной экстракции. 2D nanofibrillar SurЛица сформирован с использованием коллаген / альгинат последующей стадии сшивания с естественным сшивающего агента (генипин). Этот фильм nanofibrillar была застроена слой за слоем (LbL) метод осаждения из двух противоположно заряженных молекул, коллаген и альгинат. Наконец, где имплантат различных областях можно разместить различные типы клеток, так как это необходимо для многих многоклеточных тканей, могут быть получены. По, таким образом клеточный движение в различных направлениях на различные типы клеток можно контролировать. Такая система описана для конкретного случая трахеи регенерации, но она может быть изменена для других органов-мишеней. Анализ миграции клеток и возможные методы для создания различных градиентов пор разрабатываются. Следующим шагом в анализе таких имплантатов является их характеристика после имплантации. Тем не менее, гистологический анализ металлических имплантатов является длительный и трудоемкий процесс, таким образом, для мониторинга хостов реакцией на металлические имплантаты в естественных условияхlternative метод, основанный на мониторинге CGA и различных белков крови также описано. Эти методы могут быть использованы для разработки в пробирке заказ миграции и колонизации тесты, а также быть использованы для анализа функционализированной металлические имплантаты в естественных условиях без гистологии.

Введение

В настоящее время доступны металлических имплантатов являются подходящими для несущих приложений, но их не-разложению требует конструкции, которые обеспечивают сильное взаимодействие с тканью, окружающей их ^1. Предоставляя структур, которые способствуют сотовой в росте и колонизации в живом организме, срок службы металлических имплантатов может быть продлен ^2. Открыто пористых металлических имплантатов являются перспективными материалами для тканевой инженерии интерфейс, а также для обеспечения хорошей колонизации имплантатов. Они активно используются в качестве ортопедических имплантатов, а также как трахеи имплантаты ^3-5. Тем не менее, все еще существуют проблемы, которые необходимо решить такие как точный контроль клеточного движения в порах областях. Неспособность контролировать этот процесс может привести к неполному колонизации на одном конце и рестеноза в другом. Кроме того, дальнейшее функционализации этих имплантатов необходимо для достижения более высоких функций, таких как, доставка факторы ростанаправленный васкуляризации и одновременное перемещение различных типов клеток ^6-8. Для трахеи имплантатов, это очень важно, поскольку колонизация имплантат тканях васкуляризированной желательно. Тем не менее, неконтролируемый ткани роста в просвете трахеи является нежелательным, поскольку оно уменьшает имплантат проходимости.

Одна из возможностей для контроля клеточного движения является гель. Зная размер клеток-мишеней и их способности взаимодействовать с данным синтетического полимера можно разработать градиенты поры, которые могут эффективно определять глубину клеточного движения. Например, создав пор архитектуру, которая является достаточно большим для ввода клетки соединительной ткани, таких как фибробласты extraluminally, но достаточно малым (менее 10 мкм), чтобы предотвратить их перемещение intraluminally эффективный контроль за колонизацию трубчатого имплантата может быть достигнута.

Из доступных пор методы создания такого как замораживание-dryiнг, частицы выщелачивание, газ вспенивание ^9,10; простой адаптировать метод быстрого формирования пор градиенты с минимальным количеством необходимого оборудования вымораживанием экстракции ^11. В этом методе полимерный раствор замораживают в бинарной смеси органического растворителя и воды. После этого растворитель, обмен через экстракции смешивается предварительно охлажденной жидкости, такой как этанол. Замораживание и условий экстракции определения формы и размера пор и, если экстракцию проводят таким образом, где движение экстракционного раствора можно контролировать, размера и формы пор может быть направленно модулированный.

Второй шаг за многоклеточных тканей является формирование пористых барьеров между разными типами клеток контролировать их взаимодействии. Это также необходимо для наличия различных микросреды для различных типов клеток в зависимости от их требований ^12,13. Трахеи трубчатый орган, соединяющий гортань с bronchя. Он имеет внутреннюю подкладку псевдомногослойного цилиарного эпителия с interdispersed кубок клетки, которые продуцируют слизь. 3D структуры и стабильности трахеи поддерживается хрящ в форме С-кольца. Таким образом, в искусственной трахеи должна быть определена соединения между соединительной ткани и цилиарного эпителиальный слой. В то время как 3D структура является необходимым для соединительной частью ткани, миграцию эпителиальных клеток требует базальной мембраны, как поверхность для достижения направленного движения и закрытия раны. Полиэлектролитные многослойных пленок (ФЭУ) являются одним из возможных вариантов для получения мимика базальной мембраны. Слой за слоем методом (LbL) представляет собой универсальный процесс получения тонких и функциональных покрытий поверхности. Он основан на электростатические взаимодействия двух противоположно заряженных полиэлектролитов и их наращивание в последовательном порядке для получения наноразмерных покрытий поверхности, свойства которого можно изменять путем простого изменения переменных, таких как виды полиэлектролитов, рН,номер слоя, добавление укупорки слой, сшивающие и т.д. Одним из основных преимуществ LbL способа является его способность соответствовать топографии нижележащей подложки. Таким образом, при контролируемых условиях этот способ также можно использовать для получения покрытия поверхности пористых структур. Если коллаген используется в качестве одного из полиэлектролиты можно получить nanofibrillar структур, которые могут имитировать поверхности базальной мембраны. Гидрофобность титана позволяет развитие таких структур и fibrillarity может быть сохранена в толстых покрытий ^14. Таким образом, крепление и движение клетки на поверхности может также управляться. С помощью сублимационной добычи и LbL пленочное покрытие последовательно структуру, в которой движение клетки можно управлять сбоку в продольном и окружном может быть получена ^15.

Здесь мы рассмотрим два новых методов модификации для титановых имплантатов, используя свои гидрофобные поведение, которое может бытьраспространяется на модификации различных пористых имплантатов: а) формирование градиентов микропор в макропористой титановых имплантатов с гидрофобными, синтетические полимеры II) формирование толстого полимерный слой пленки на поверхности имплантата, который поддерживает рост клеток и формирование подкладка по полиэлектролитных слоев. Эти методы могут быть использованы последовательно или раздельно. Они обеспечивают структур, которые обеспечивают контролируемое миграции и пространственной организации различных типов клеток в многоклеточных тканей ^16,17. В конкретном случае трахеи, желаемый результат для имплантата будет колонизации сосудисто-волокнистых тканей внутри микропор градиенты без рестеноза и формирования внутренней оболочки ресничных эпителиальных клеток на полиэлектролитных слоев.

Один из способов управления интеграции имплантатов делать небольшие хирургические вмешательства в период их интеграции с принимающим на месте. Для того, чтобы быть в состоянии тØ решение о сроках проведения мероприятия, важно иметь информацию о системных эффектов имплантата. С-реактивный белок (CRP) был использован для мониторинга инфекции и воспалительные реакции в клинических условиях. Хромогранин (CGA) также может быть использован таким же образом и может обеспечить более точные результаты для наблюдения за уровнем воспаления ^18. В качестве возможного способа наблюдения металлических интеграции имплантата в естественных условиях, мы представляем процедуры непрерывного мониторинга системных эффектов имплантатов по характеристике животного образцов крови с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и последующего секвенирования белка. Разработка этот метод может быть использован, чтобы избежать регулярных конечной точки гистологического анализа. Гистологическое порезки металлических имплантатов является длинным, громоздким и дорогостоящим процессом и могут быть предприняты только в определенные моменты времени. Именно по этой причине, хорошо продуманные крови обеспечения надежной информации о здоровье имплантат будетМожно маршрутов для уменьшения экспериментов на животных в соответствии с мандатом с последними нормативами ЕС относительно экспериментов на животных.

Методы, представленные здесь, могут быть использованы для улучшения производительности металлических имплантатов через функционализации или иметь альтернативный способ мониторинга существующих имплантатов.

протокол

1. Подготовка Micropore градиентов в Макропористые Металлические имплантаты

1. Очистка имплантаты (например, имплантанты из медицинского класса шарики титана с размером 400-500 мкм, Neyco SAS, Франция) с этанолом, а затем обработать ультразвуком в ацетоне в течение 15 мин.
2. Разработка и производство тефлон формы в зависимости от размера и формы имплантата (Стандартные экспериментов цилиндрической формы 1,5 см в диаметре, высотой 2 см используются). Пресс-формы должна быть модульным, так что некоторые части могут быть удалены в процессе экстракции. Такая форма конструкции обеспечивает контроль над процессом экстракции, вызывая движение флюидной экстракции в ориентированном образом.
3. Для трубчатых имплантатов, предназначенный для замены трахеи, структура должна состоять из трех частей: а) нижней части, чтобы определить размер имплантата II) оправки и III), внешнее ядро ​​который является съемным. Таким образом, градиент размера пор может быть сформирован снаружи в направлении внутрь.
4. Подготовьте синтетический полимер (PLLA) Решение: Для замораживания / Добыча PLLA решение должно быть подготовлено в бинарной смеси диоксана и воды (87:13%, по объему).
5. Нагревают смесь до 60 ° С для получения гомогенного раствора. 60 ° С выбранным, как это более высокий предел температуры сопротивления для точного стеклянные шприцы, которые должны быть использованы для введения раствора в имплантаты.
6. При высокой концентрации (≥ 6%), высокомолекулярные решений ПЛМК вес использовании вводят раствор во имплантата после нагрева немедленно. В противном случае гелеобразования раствора происходит без полного погружения.
7. Рассчитать объем необходимой раствора полимера по отношению к пористость имплантата, на точность изменение объема замороженного раствора могут быть приняты во внимание.
8. Вводят раствор во имплантатов с точностью стеклянные шприцы с 0,1 мкл точности. Нижний предел для концентрации полимера3% для воспроизводимых образованию пор в то время как градиент становится трудно получить равномерное распределение в толстых образцах выше 6%. Тем не менее, для конкретных применений другие концентрации могут быть использованы.
9. Замораживание образцов либо непосредственно при -80 ° С или с предыдущего периода инкубации 30 минут при комнатной температуре. Замораживание условия определяют частично образованию пор, таким образом, условия замораживания может быть скорректирована в зависимости от пористости направленные. Храните образцы в течение ночи при температуре -80 ° C.
10. Добыча: Погрузите имплантатов в 80% предварительно охлажденного этанола. Осуществления экстракции при температуре -20 ° С в течение ночи. Для получения градиентов пористости, удалить все части формы кроме оправки для трубчатого имплантатов и все части за исключением нижней части в форме диска для имплантатов. Использование предварительно охлажденный скальпель для легкого отделения пресс-формы.
11. После экстракции при температуре -20 ° С в течение ночи ^19, удалите оставшиеся части формы и просушить на воздухе имплантатов. Для характеристикиобщей пористости Анализ структуры ртутного порозиметра является необходимым. Ртуть Porosimeter измерения показали, отдельные пики, соответствующие поры на обеих сторонах имплантата и меньше interdispersed поры. Однако более важным данные разности между пористостью и внутрипросветного внепросветное поверхности, которые могут быть проанализированы изображения J для распределения пор по размерам с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) ^20. Для проверки пор градиент, скалывания образцов и наблюдать поперечное сечение с помощью СЭМ.
12. Благодаря открытой пористой природы имплантатов используется, и светоотражающих мощностью титана, можно сделать Z-стеки меченых клеток в пористой имплантатов. Этикетка клеток с PKH26 или Кальцеин-AM и визуализации имплантатов с конфокальной лазерной микроскопии.

2. Покрытие поверхности пористых металлических имплантатов с коллагеном / альгинат Multilayers

1. Для наращиваниямногослойных, высокая воспроизводимость полученных с погружением роботов. Однако, если погружение робот не доступны в эти шаги можно сделать вручную.
2. Использование медицинских классе я типа коллагена и альгинат натрия. Оптимизированные концентрации 0,5 г / л для каждого в 150 мМ NaCl в цитратном буфере при рН 3,8.
3. Растворить раствора коллагена быстро обеспечить гомогенность раствора. Кислотный рН 3,8 необходимо для стабильного наращивание слоя, как структура неустойчива перед сшивкой в ​​нейтральном рН.
4. Депозит слоев погружения робота системы путем погружения в имплантатах коллагена и растворы альгинатов альтернативно. Время осаждения на 15 мин для каждого последующего слоя. Промыть структуры между осаждением шагов с 150 мМ NaCl при рН 3,8 в течение 5 мин.
5. Разрабатывать специальные держатель для использования имплантатов с погружением роботов, используемых в производстве многослойных полиэлектролитных. Депозит слоев на поверхности или титан только IMPLAНТС или имплантаты модифицируют, как описано в разделе 1.
6. Стабилизация базальной мембраны имитировать с генипин: Подготовка сшивающего раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) / цитратный буфер (150 мМ NaCl, рН 3,8) в 1:04 в объемном соотношении. Широком диапазоне концентраций могут быть использованы и 100 мМ является достаточным для сшивания. Растворить Genipin первый компонент в ДМСО и добавляют водный компонент позже, чтобы избежать слипания.
7. Сшивания образцов погружением в раствор сшивающего между 12-24 час. Затем промыть обильным количеством цитрата буфером (рН 3,8).
8. После стадии промывки, стерилизовать образцы либо с УФ обработки (30 минут) или антибиотик / противогрибковым ванна (пенициллин / стрептомицин, фунгизон).
9. Основные параметры, которые определяют качество базальной мембраны имитировать являются его толщины и диаметра волокон. Рассчитать диаметры волокон с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) изображений, полученных в контактном режиме. Сухие образцыПоток азота до съемки. Количественная толщиной не менее 10 волокон на изображения для определения средней толщины фибрилл изображения с программным J.
10. Толщина пленок может быть определена путем нуля испытаний с использованием АСМ. Сухой (КОЛ / ALG) ₂₄ / COL многослойных пленок. Используйте иглу шприца, чтобы не поцарапать пленку. После локализации нуля, с помощью световой микроскопии, получение изображений с AFM 10 х 10 мкм ² поверхности на границе нуля. Вычисление высоты от профилей, полученных с помощью программного обеспечения АСМ, что обеспечивает толщина пленки слоя.

3. Косвенный мониторинг приживления имплантатов В естественных условиях на основе анализа плазмы крови

1. Все необходимые согласования комитета должны быть приняты для экспериментов на животных в соответствии с руководящими правила для каждой страны ^21. В нашем случае Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (National Research Council, 2010) была продолжена и гоэлектронной утверждении университета этического комитета Страсбурге получается.
2. Проведение имплантации на целевые места. Протокол крови мониторинга приведенные здесь был использован для замены трахеи в новозеландских белых кроликов от 15 мм резекции трахеи.
3. После имплантации ежедневный контроль за которыми является необходимым, таких как montioring общего благополучия животных (исцеления по всему хирургические участки, частота дыхания) и запись их веса.
4. Для проверки крови, использовать устоявшиеся методы, такие как ИФА крови уровня СРБ. CRP тесты для многих животных имеются и конкретные тест, используемый для кроликов представлены в таблице 1. Аналогичным образом, использование вестерн-блоттинга для определения уровней CGA. Моноклональное анти-CGA антитела (анти-CGA _47-68) были использованы в данном протоколе.
5. Для характеристики плазмы, получение образцов крови из ушной вены кролика. Центрифуга при 5000 оборотов в минуту в течение 20 мин при 4 °; C. Использование надосадочной жидкости, полученной для анализа. В нашей процедуре, эти испытания проводятся на еженедельной основе, но более частые анализы также возможны.
6. ВЭЖХ с обращенной фазой очистки содержание белка Плазменный: извлечение кролика плазмы с 0,1% трифторуксусной кислотой (1:1, по объему). Очищают экстракта с помощью ВЭЖХ Dionex системы (3000 Окончательный; Саннивейл, Калифорния, США) на нуклеосил обращенной фазой 300-5C18-колонки (4 х 250 мм, размер частиц 5 мкм, пористость, 300 А).
7. Измерить абсорбцию при 214 и 280 нм. Система растворителя используется я) Растворитель: 0,1% (объем / объем) трифторуксусной кислотой (ТФК) в воде и б) Растворитель В: 0,09% (объем / объем) трифторуксусной кислоты в 70% (об / об) ацетонитрил-вода.
8. Использование с расходом 700 мкл / мин с использованием градиентов для элюирования. Соберите пиковые фракции. Концентрат фракций путем испарения скорость вакуума приложения. Важно, чтобы остановить скорость вакууме до полной сухости.
9. Корреляция пики, полученные при различных временных точках на совместномUrse из периода имплантации. Использование очищенных пептидов, которые показывают устойчивых тенденций в ходе имплантации для идентификации автоматического секвенирования по Эдману.
10. Автоматическое секвенирование по Эдману пептидов: Определение N-концевой последовательности очищенные пептиды автоматической деградации по Эдману использованием Procise микросеквенаторе. Загрузите образец полибрен обработанного стекловолокна фильтров. Следующим этапом является определение фенилтиогидрантоиновые-аминокислот (PTH-Хаа) с помощью хроматографии на C _{18-колонке} (PTH С-18, 2,1 х 200 мм) ^22. После того, как последовательность получается, он может быть идентифицирован Blast программного обеспечения с использованием Swiss-Prot базы данных.

Результаты

Формирование пор градиенты

Путем изменения концентрации раствора PLLA, можно контролировать размер пор на внепросветное стороне имплантата. Размер пор и форма была значительной степени зависит от наличия титановых имплантатов (фиг. 1a и 1b). Размеры пор ко?...

Обсуждение

Пора градиенты являются важными инструментами в интерфейс тканевой инженерии и системы, описанной здесь, могут быть использованы отдельно или в сочетании с металлическими имплантатами, чтобы сформировать пор градиент для изучения миграции клеток. Система не требует каких-либо допол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.