Modificação Multi-Escala de implantes metálicos com gradientes de poros, polieletrólitos e sua monitorização indirecta<em&gt; In vivo</em

Resumo

Neste vídeo, vamos demonstrar técnicas de modificação de implantes metálicos porosos para melhorar a sua funcionalidade e para controlar a migração celular. As técnicas incluem o desenvolvimento de gradientes de poros para controlar o movimento de células em 3D e a produção da membrana basal imita para controlar o movimento de células em 2-D. Além disso, um método baseado em HPLC para o acompanhamento da integração do implante in vivo através de análise de proteínas do sangue é descrito.

Resumo

Os implantes metálicos, especialmente os implantes de titânio, são amplamente utilizados em aplicações clínicas. Tecido em crescimento e integração para estes implantes nos tecidos são parâmetros importantes para os resultados clínicos de sucesso. A fim de melhorar a integração do tecido, implantes metálicos porosos têm sido desenvolvidos. A porosidade aberta de espumas metálicas é muito vantajoso, uma vez que as áreas dos poros pode ser funcionalizado, sem comprometer as propriedades mecânicas de toda a estrutura. Aqui descrevemos tais modificações usando implantes de titânio poroso baseado em microesferas de titânio. Usando propriedades físicas inerentes, tais como a hidrofobicidade de titânio, é possível obter gradientes de poros hidrofóbicos dentro microbead implantes metálicos baseados e, ao mesmo tempo que têm uma membrana basal mímico à base de polímeros hidrofílicos, naturais. Gradientes de poro 3D são formadas por polímeros sintéticos tais como o ácido poli-L-láctico (PLLA) pelo método de congelação-extracção. 2D nanofibrillar suras faces são formadas usando colagénio / alginato seguido por um passo de reticulação com um agente de reticulação natural (genipin). Este filme nanofibrillar foi construído por camada pelo método de deposição das duas moléculas de carga oposta, o colagénio e alginato camada (LBL). Finalmente, um implante onde diferentes áreas pode acomodar diferentes tipos de células, como isto é necessário para muitos tecidos multicelulares, podem ser obtidos. Por, esta forma movimento celular em diferentes direcções de diferentes tipos de células pode ser controlada. Tal sistema é descrito para o caso específico de traqueia de regeneração, mas pode ser modificado para outros órgãos alvo. Análise da migração celular e os métodos possíveis para a criação de diferentes gradientes de poros são elaborados. O passo seguinte na análise de tais implantes é a sua caracterização após a implantação. No entanto, a análise histológica de implantes metálicos é um processo longo e complicado, portanto, para monitoramento de reação host para implantes metálicos in vivo a umaMétodo lternative baseada no controlo de proteínas do sangue e CGA diferente é também descrito. Estes métodos podem ser utilizados para o desenvolvimento in vitro de migração e feitos por testes de colonização e também ser usado para a análise dos implantes metálicos funcionalizados in vivo sem histologia.

Introdução

Actualmente os implantes metálicos disponíveis são adequados para aplicações de suporte de carga, mas a sua degradabilidade não necessita de modelos que garantam uma interface forte com o tecido em torno deles ^1. Ao proporcionar estruturas que facilitam o crescimento celular em colonização e in vivo, o tempo de vida dos implantes metálicos podem ser prolongadas ^2. Os implantes metálicos abertamente porosa são materiais promissores para a engenharia de tecidos da interface e também para assegurar uma boa colonização dos implantes. Eles têm sido utilizados como implantes ortopédicos activamente e também como implantes traqueais ^3-5. No entanto, ainda há problemas que precisam de ser resolvidos, tais como o controlo preciso sobre o movimento celular nas áreas dos poros. A falha para controlar este processo pode conduzir à colonização incompleto em uma extremidade e restenose na outra. Também ainda a funcionalização destes implantes é necessária para a obtenção de elevados funções tais como, entrega de factores de crescimento,vascularização dirigido e movimento simultâneo de diferentes tipos de células ^{de 6-8.} Para implantes traqueais, isto é crucial que a colonização do implante por um tecido vascularizado é desejável. No entanto, o tecido em crescimento descontrolado para o lúmen de traqueia é indesejável porque ele diminui a permeabilidade do implante.

Uma possibilidade para controlar o movimento da pilha é de exclusão de tamanho. Conhecendo o tamanho das células alvo e da sua capacidade para interagir com um dado polímero sintético é possível desenvolver gradientes de poros que pode eficazmente determinam a profundidade de célula de circulação. Por exemplo através da criação de uma arquitectura de poro que seja suficientemente grande para a entrada das células do tecido conjuntivo tais como os fibroblastos extraluminally, mas suficientemente pequenos (menos de 10 mm) para impedir o seu movimento intraluminarmente um controlo efectivo sobre a colonização de um implante tubular pode ser alcançado.

De métodos de criação de poros disponíveis, tais como congelamento drying, a lixiviação das partículas, gás de formação de espuma ^9,10; mais fácil de adaptar o método para a rápida formação de gradientes de poro com uma quantidade mínima de equipamentos necessários por congelação é de extracção ^11. Neste método, uma solução de polímero é congelado numa mistura binária de um solvente orgânico e água. Em seguida, o solvente é trocado por meio de extracção por um líquido, pré-refrigerada miscível tal como etanol. Congelamento e condições de extracção determinar a forma e tamanho dos poros e, se a extracção é realizada de uma maneira em que o movimento da solução de extracção, pode ser controlada, a forma e tamanho de poro pode ser modulada direcionalmente.

Segundo passo para tecidos multicelulares é a formação de barreiras porosas entre diferentes tipos de células para controlar a sua interacção. Isto também é necessário para a disponibilidade de diferentes microambientes para diferentes tipos de células em função das suas exigências de ^12,13. Traquéia é um órgão tubular que liga laringe com brônquiosi. Tem um revestimento interior do epitélio ciliar pseudo com células caliciformes produtoras de muco que interdispersas. A estrutura 3D e estabilidade da traqueia é mantida por cartilagem em forma de C-rings. Assim, numa traqueia artificial deveria haver uma junção definida entre o tecido conectivo e a camada epitelial ciliar. Embora uma estrutura em 3D é necessário que a parte do tecido conjuntivo, a migração de células epiteliais requer uma membrana basal, como de superfície para obter o movimento direccional e fechamento da ferida. Polieletrólito filmes multicamadas (PEM) são uma opção possível obter imita membrana basal. Método camada por camada (LBL) é um processo versátil de obter revestimentos de superfície fina e funcional. É baseado em interações eletrostáticas de dois polieletrólitos de cargas opostas e seu acúmulo de forma seqüencial para obter revestimentos de superfície em nanoescala cujas propriedades podem ser alteradas simplesmente mudando variáveis ​​como espécie de polieletrólito, pH,Número camada, a adição de uma camada de nivelamento, a reticulação, etc Uma das principais vantagens do método de automontagem é a sua capacidade para conformar à topografia do substrato subjacente. Assim, sob condições controladas, este método pode também ser utilizado para a obtenção de uma cobertura de superfície de estruturas porosas. Se colagénio é utilizado como um dos polielectrólitos é possível obter estruturas nanofibrillar que podem mimetizar a superfície da membrana basal. A hidrofobicidade do titânio permite o desenvolvimento de tais estruturas e fibrillarity pode ser preservada em revestimentos grossos ^14. Esta forma de fixação e movimento de células na superfície também pode ser controlado. Usando extracção por congelação e revestimento de filme LbL sequencialmente, uma estrutura em que o movimento da pilha pode ser controlada lateralmente, longitudinalmente e pode ser obtida perifericamente ^15.

Aqui nós descrevemos dois métodos de modificação novas para implantes de titânio usando seu comportamento hidrofóbico que pode seralargado a alteração de vários implantes porosos: i) a formação de gradientes de microporos dentro dos implantes de titânio macroporosos com hidrófobos, polímeros sintéticos ii) a formação de uma camada de espessura de película de polímero sobre a superfície do implante que suporta o crescimento de células e formação de revestimento de multicamadas de polielectrólitos. Estes métodos podem ser usados ​​sequencialmente ou separadamente. Eles proporcionam estruturas que garantem a migração controlada e organização espacial dos diferentes tipos de células em tecidos multicelulares ^16,17. Para o caso específico de traqueia, o resultado pretendido para o implante seria a colonização por tecido fibrovascular dentro dos gradientes micropore sem reestenose e da formação do revestimento interior de células epiteliais ciliadas sobre as multicamadas polielectrólitos.

Uma maneira de controlar a integração dos implantes é fazer pequenas intervenções cirúrgicas durante o período de sua integração com o hospedeiro in situ. A fim de ser capaz tó decidir sobre o momento das intervenções, é importante ter informações sobre os efeitos sistêmicos do implante. Proteína C-reativa (PCR) tem sido utilizada para o monitoramento da infecção e resposta inflamatória em ambientes clínicos. Cromogranina A (CGA) também pode ser usado de uma maneira semelhante e podem proporcionar resultados mais precisos para observar o nível de inflamação ^18. Como uma forma possível de se observar a integração do implante metálico in vivo, apresentamos um processo de acompanhamento contínuo dos efeitos sistêmicos do implante por caracterização de amostras de sangue de animais com Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) e posterior sequenciamento de proteínas. Elaboração do presente método pode ser usado para evitar a análise histológica de ponto final regular. Corte histológico de implantes metálicos é um processo demorado, caro e complicado e só pode ser realizado em pontos de tempo específicos. Por essa razão, bem concebido testes sanguíneos que fornecem informações robustas sobre a saúde implante seriaser possíveis rotas para diminuir experiências com animais, como manda as regras da UE recentes sobre experimentos com animais.

Os métodos aqui apresentados podem ser utilizados para melhorar o desempenho de implantes metálicos por meio de funcionalização ou ter uma forma alternativa de controlo dos implantes existentes.

Protocolo

1. Preparação de gradientes de microporos em implantes metálicos macroporosas

1. Limpar os implantes (por exemplo, implantes feitos de esferas de titânio de grau médico, com uma gama de tamanhos de 400-500 mM, Neyco SAS, França) com etanol e acetona, em seguida, sonicar durante 15 min.
2. Concepção e fabrico de moldes de Teflon de acordo com o tamanho e forma do implante (Para as experiências de padrão, são usados ​​moldes cilíndricos de 1,5 cm de diâmetro, com uma altura de 2 cm). Os moldes devem ser modular, de modo que as determinadas partes podem ser removidos durante a extracção. Um tal desenho de molde assegura que o controlo sobre o processo de extracção, forçando o movimento do fluido de extracção de uma maneira dirigida.
3. Para implantes tubulares destinados a substituir a traqueia, a estrutura deve ser composto de três partes: i) uma parte do fundo para determinar o tamanho do implante, ii) um mandril e iii) um núcleo exterior que é removível. Desta forma, o gradiente de tamanho de poro pode ser formado a partir do exterior para dentro.
4. Preparar a solução de polímero sintético (PLLA): Para a solução de PLLA congelamento / extracção deve ser preparado de uma mistura binária de dioxano e água (87:13%, v: v).
5. Aquecer a mistura a 60 ° C, a fim de se obter uma solução homogénea. 60 ° C, que é escolhido como o limite superior da resistência à temperatura para as seringas de vidro de precisão que tem de ser utilizado para a introdução da solução para os implantes.
6. Se forem utilizados alta concentração (≥ 6%), soluções de PLLA de elevado peso molecular, introduzir a solução no implante imediatamente após o aquecimento. Caso contrário, a gelificação da solução ocorre sem imersão completa.
7. Calcular o volume da solução de polímero necessária no que diz respeito à porosidade do implante, para alterar a precisão do volume da solução congelada pode ser levado em conta.
8. Introduzir a solução para os implantes com seringas de vidro de precisão com precisão de 0,1 ul. O limite inferior para a concentração de polímero é3% para a formação de poros gradiente reprodutível enquanto se torna difícil obter uma distribuição homogénea das amostras de espessura acima de 6%. No entanto, para aplicações específicas, podem ser usadas outras concentrações.
9. Congele as amostras directamente a -80 ° C ou com um período de incubação prévia de 30 min à temperatura ambiente. Condições de congelação parcialmente determinar a formação de poros, pelo que as condições de congelamento pode ser ajustada de acordo com a porosidade destinada. Manter as amostras durante a noite a -80 ° C.
10. Extração: Mergulhe os implantes em 80% EtOH pré-refrigerados. Efectua-se a extracção à temperatura de -20 ° C durante a noite. Para se obter gradientes porosidade, remover todas as partes do molde excepto o mandril para os implantes tubulares e todas as partes, com excepção da parte do fundo para implantes em forma de disco. É um bisturi pré-refrigerada para facilitar a separação do molde.
11. Após extracção, a -20 ° C durante a noite ^19, remover as restantes partes do molde e ar seco dos implantes. Para a caracterização dea porosidade geral da análise da estrutura de porosímetro de mercúrio é necessário. Mercury medições porosímetro mostrou picos distintos que correspondem aos poros em ambos os lados do implante e os poros mais pequenos interdispersas. Contudo, os dados mais importantes é a diferença entre as porosidades das superfícies intraluminais e extraluminal, que podem ser analisadas por Image J para a distribuição de tamanho de poro com um microscópio electrónico de varredura (SEM) ^20. Para a verificação do gradiente de poros, congelar-fraturar as amostras e observar a seção transversal com SEM.
12. Devido à natureza porosa aberta dos implantes utilizados, e a capacidade de reflectir a luz de titânio, é possível fazê-z-as pilhas de células marcadas dentro de implantes porosos. Rotular as células com PKH26 ou Calcein-AM e visualizar os implantes com a microscopia confocal a laser.

2. Revestimento de superfície de implantes metálicos porosos com Colágeno / alginato Multilayers

1. Para construir-upde multicamadas, a mais alta reprodutibilidade é obtido com robôs de mergulho. No entanto, se um robô de imersão não está disponível estas etapas podem ser feitas manualmente.
2. Use um grau de colágeno tipo I médica e alginato de sódio. As concentrações são optimizados de 0,5 g / L para cada em 150 mM de NaCl em tampão de citrato a pH 3,8.
3. Dissolve-se a solução de colagénio durante a noite para assegurar a homogeneidade da solução. PH ácido de 3,8 é necessária para a acumulação estável das camadas que a estrutura é instável antes da reticulação, em pH neutro.
4. Depositar as camadas por um sistema de robô mergulhando por imersão dos implantes em soluções de colágeno e alginato como alternativa. Deposição de tempo é de 15 minutos para cada camada subsequente. Lavar a estrutura entre os passos de deposição com NaCl 150 mM a pH 3,8, durante 5 minutos.
5. Projeto titular específico para a utilização de implantes com robôs de imersão usados ​​na produção de camadas múltiplas polielectrólito. Depositar as camadas da superfície de titânio ou apenas implants ou implantes modificados, conforme descrito na seção 1.
6. A estabilização da membrana basal mimetizar com genipin: Preparar a solução de reticulação numa dimetilsulfóxido (DMSO) / tampão de citrato (150 mM de NaCl, pH 3,8) a 01:04 v: v proporção. Uma ampla gama de concentrações e pode ser usada a 100 mM é adequado para a reticulação. Dissolver genipin primeiro no componente de DMSO e adiciona o componente de água mais tarde para evitar a aglomeração.
7. CROSSLINK as amostras pela imersão na solução de reticulação entre 12-24 horas. Depois enxágüe com copiosa quantidade de tampão citrato (pH 3,8).
8. Após as etapas de lavagem, esterilizar as amostras, quer com tratamento UV (30 min) ou num banho de antibiótico / antifúngico (Penicilina / Estreptomicina, Fungizone).
9. Os parâmetros principais que determinam a qualidade da membrana basal são imitar a sua espessura e o diâmetro das fibras. Calcule o diâmetro da fibra, utilizando imagens de microscopia de força atômica (AFM) obtidas no modo de contato. Secam-se as amostras com umfluxo de nitrogênio antes da imagem. Quantificar a espessura de pelo menos 10 fibras por imagem para determinar a espessura média de fibrilas com software Image J.
10. A espessura dos filmes pode ser determinada por testes de arranhão utilizando AFM. Dry (COL / ALG) ₂₄ filmes multicamadas / Col. Use uma agulha de seringa para arranhar o filme. Depois da localização da raiz com um microscópio de luz, com a obtenção de imagens AFM em 10 x 10 um ² superfícies no limite do zero. Calcular as alturas a partir dos perfis obtidos com o software de AFM, que fornece a espessura da camada de película.

3. Monitoramento indireto da Integração Implant In vivo pela análise do plasma sanguíneo

1. Todas as aprovações das comissões necessárias devem ser tomadas para a experimentação animal de acordo com as regras de cada país ^21. No nosso caso, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Research Council, 2010) é seguido e thaprovação e da Universidade de Estrasburgo comitê de ética é obtido.
2. Realizar a implantação no local de destino. O protocolo de monitoramento sangue dado aqui foi usado para substituição traqueal em coelhos Nova Zelândia Branco de uma ressecção traqueal 15 mm.
3. Após a implantação é um acompanhamento diário necessárias, tais como montioring o bem-estar dos animais (cura em torno dos locais cirúrgicos, taxa de respiração) em geral e gravação de seu peso.
4. Para validar o exame de sangue, usar um método bem estabelecido, como testes de ELISA para níveis de PCR no sangue. Testes de PCR para muitos animais estão disponíveis e o ensaio específico utilizado para coelhos está listado na Tabela 1. Da mesma forma, usar western blotting para a determinação dos níveis CGA. Anticorpos anti-CGA monoclonais (anti-CGA _47-68) foram utilizados neste protocolo.
5. Para a caracterização de plasma, a obtenção de amostras de sangue das veias auriculares dos coelhos. Centrifugar a 5000 rpm durante 20 min a 4 °; C. Utilize-se o sobrenadante obtido para análise. Em nosso processo, estes testes são feitos em uma base semanal, mas testes mais freqüentes também são possíveis.
6. HPLC de fase reversa de purificação das proteínas do plasma: Extrai-se a plasma de coelho com 0,1% de ácido trifluoroacético (1:1, v: v). Purifica-se o extracto por meio de um sistema de HPLC Dionex (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA EUA) num nucleosil de fase inversa 300-5C18-coluna (4 x 250 mm, tamanho de partícula 5 fim; porosidade, 300 Â).
7. Ler a absorvância a 214 e 280 nm. O sistema de solvente usado é i) Solvente A: 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água e ii) Solvente B: 0,09% (v / v) de ATF em 70% (v / v) de acetonitrilo-água.
8. É um caudal de 700 ul / min usando gradientes de eluições. Recolha as frações de pico. Concentre-se as fracções por evaporação por aplicação de vácuo de velocidade. É importante para parar o vácuo de velocidade antes secura completa.
9. Correlacionar os picos obtidos em diferentes pontos de tempo ao longo do coURSE do período de implantação. Usar os péptidos purificados que estão mostrando as tendências consistentes durante o curso de implantação para a identificação automática por sequenciação de Edman.
10. Sequenciação automática de Edman dos péptidos: Determinar a sequência N-terminal dos péptidos purificados por degradação automática de Edman usando um microsequencer Procise. Carregar a amostra a filtros de fibra de vidro tratados com polibreno. O passo seguinte é a identificação de ácidos aminados feniltiohidantoína (PTH-Xaa) por cromatografia sobre uma coluna C ₁₈ (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) ^22. Depois de a sequência obtida, ela pode ser identificada pelo software de banco de dados SWISS explosão utilizando-Prot.

Resultados

A formação de gradientes de poro

Ao alterar a concentração da solução de PLLA, é possível controlar o tamanho dos poros no lado extraluminal dos implantes. A forma e tamanho dos poros foi significativamente afectada pela presença de implantes de titânio (Figuras 1a e 1b). Tamanhos de poros variando 40-100 mM e utilização de concentrações mais baixas resultaram em poros mais pequenos. Considerando que, no tamanho de poro do lado intraluminal foi re...

Discussão

Gradientes de poros são ferramentas importantes na engenharia de tecidos de interface e o sistema aqui descrito pode ser utilizado sozinho ou em conjunto com implantes metálicos para formar gradiente de poro para estudar a migração celular. O sistema não necessita de qualquer configuração extra ou equipamento adicional, excepto uma coifa química para lidar com solventes orgânicos, pelo que pode ser aplicada em laboratórios de biologia. Polímeros similares, tais como poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ácid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.