筋衛星細胞の単離、培養、および移植

要約

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。

要約

筋衛星細胞は、筋線維におけるsublaminal核の2〜5％を占め、出生後の骨格筋の発達と再生に必要な幹細胞集団である。大人の筋肉では、衛星細胞は通常、有糸分裂的に静止状態にある。損傷後、しかしながら、衛星細胞、筋肉の再生を媒介する筋芽細胞、それらの子孫を生成するために細胞増殖を開始する。衛星細胞由来の筋芽細胞の移植が広く筋ジストロフィー、心不全、および泌尿器機能障害を含むいくつかの疾患のための再生可能な治療法として研究されてきた。ジストロフィー骨格筋、梗塞、心臓、および機能不全、尿管への筋芽細胞移植は、移植された筋芽細胞は、宿主組織内の筋線維に分化し、これらの疾患における部分的な機能改善を表示することができますことを示している。したがって、骨格musclから静止衛星細胞の効率的な精製方法の開発Eだけでなく、衛星細胞由来の筋芽細胞培養および筋芽細胞のための移植法の確立など、衛星細胞の自己再生、活性化、及び分化の背後にある分子メカニズムを理解するために不可欠です。また、筋ジストロフィー、その他の再生の病気のための細胞ベースの治療法の開発は、これらの要因に依存している。

しかし、静止衛星細胞の現在の将来の精製方法は、高価な蛍光活性化細胞選別（FACS）装置の使用を必要とする。ここでは、ソーティング（MACS）、磁気活性化細胞が続く酵素的解離による成体マウスの骨格筋からの静止衛星細胞の、急速な経済的、かつ信頼性の高い精製のための新しい手法を提案する。純粋な静止衛星細胞の単離後、これらの細胞は、何代かの継代後の筋芽細胞を大量に得るために培養することができる。これらの新たに単離した静止衛星細胞またはex vivoで増殖させた筋芽細胞は、心臓毒に移植することができる（CTX）筋線維の再生にドナー由来細胞の寄与を調べるために、マウスの骨格筋の再生に誘導されるだけでなく、自己複製の検査のための衛星細胞区画へ活動。

概要

筋衛星細胞は、骨格筋線維の基底膜の下に位置する筋原幹細胞の小集団である。それらはのPax7、のPax3、c-Metの、M-カドヘリン、CD34、シンデカン3の発現を特徴とし、カルシトニン^{、1 - 3。}衛星細胞、筋肉幹細胞などの筋再生に関与することが証明されている。大人の筋肉では、衛星細胞は^4-8通常、有糸分裂的に静止状態にある。損傷後、衛星細胞は活性化され、MyoDの発現を開始し、そしてその子孫を展開し、細胞周期を入力して、筋原性前駆細胞又は筋芽^3と呼ばれる。細胞分裂のいくつかのラウンド後、筋芽細胞は、成熟筋繊維に続いて多核筋管へと分化するために、相互に細胞周期およびヒューズを終了する。大人の筋肉から分離された筋芽細胞は、容易にex vivoで拡張することができます。筋肉を再生させるにしてに筋線維になる筋芽細胞の能力非筋組織における異所性フォーム筋線維は、筋芽細胞移植、デュシェンヌ型筋ジストロフィー^（DMD）4のための潜在的な治療アプローチ、泌尿器機能障害^9、および心不全¹⁰によって利用される。確かに、筋芽細胞は正常にMDX（DMDモデル）マウスおよびDMD患者^11から14の両方の筋肉に移植されてきた。注入された筋芽細胞は、正常な、罹患筋の組織学および機能を改善するために、宿主筋線維と融合する。以前の研究は、筋芽細胞の亜集団は、より細胞様幹と筋再生⁵中に筋肉になった未分化状態のままにしていることを明らかにした。最近の研究は、成体筋から新たに単離されたサテライト細胞、筋肉^5-8の再生に、より効率的な生着及び自己再生活性を示す幹細胞様集団を含有することが示されている。従って、成体骨格MUから静止衛星細胞の純粋な集団の精製SCLEは、衛星細胞、筋芽細胞と筋再生の生物学を理解するため、および細胞ベースの治療法の開発のために不可欠である。

しかし、静止衛星細胞の現在の将来の精製方法は、高価な蛍光活性化細胞選別^{（FACS）1,2,6-8}機械の使用を必要とする。また、FACSレーザ露光は、静止衛星細胞¹⁵の下部収率を引き起こす分離時に細胞死を誘導する傾向がある。ここでは、成体マウスの骨格筋からの静止衛星細胞の、急速な経済的、かつ信頼性の高い精製のための新しい手法を提案する。この方法では、ソーティング（MACS）、磁気活性化細胞が続く酵素的解離を利用しています。純粋な静止衛星細胞の単離後、これらの細胞は、何代かの継代後の筋芽細胞を大量に得るために培養することができる。我々はまた示すことが、これらの新たに単離された静止衛星細胞またはex VIの筋肉内注射VO展開さ筋芽細胞が心臓毒に移植することができる（CTX）筋線維だけでなく、自己再生活動の検査のための衛星細胞区画への再生へのドナー由来細胞の寄与を調べるために、マウスの骨格筋の再生に誘導される。

プロトコル

動物は、SPF環境下で飼育したとミネソタ大学の研究動物資源（RAR）によりモニターした。 1304から30492：動物はすべてのプロトコルは施設内動物管理使用委員会（IACUC、コード番号によって承認されたアベルチン（250 mg / kg）のIP注射で麻酔した後の（CO ₂吸入またはKCl注入適切な手段によって安楽死させた）ミネソタ大学の。

マウス骨格筋から単核細胞の1。分離

1. 適切に1または2の若い成体マウス（3-8週）を生け贄に捧げる。
   1. 鋭いハサミで腹部の皮膚をつまんスリット。完全に（反対方向に皮膚を引っ張って）三頭筋および後肢の筋肉を表示するために皮膚をはがす。
   2. ハサミで骨に沿った全ての脚の骨格筋（前脛骨筋、腓腹筋、および大腿四頭筋）と上腕三頭筋を取り除く。その後、10cmプレートに、氷冷、滅菌PBSに筋肉を転送。
2. 新しい滅菌6cmのプレートにPBS中で筋肉や転送筋肉を血を洗い流します。1プレートを1〜2マウスについて。
3. 解剖顕微鏡下で、結合組織、血管、神経束、および脂質生成組織を除去する。
4. 眼科用のハサミを使用して、滑らかなパルプ（ 図1Aおよび図1B）内に組織を切断し刻む。彼らは酵素溶液により容易に分解されることはありませんように、大規模な作品を残していないしてみてください。
5. （10％DMEM中でFBS中の0.2％コラゲナーゼタイプ2）ファルコン50 mlのチューブにみじん切り筋肉を転送し、コラゲナーゼ溶液5mlを加える。 60分間37℃でインキュベートする。
6. 粉末化し（18 G針で上下）の混合物（ 図1C）を均質化する。次いで、さらに15分間37℃で混合物をインキュベートする。
7. 単一細胞懸濁液中に解離する混合物を均質化するために再度粉砕する。アップ単一細胞懸濁液に50mlまでDMEM中の2％FBSを加え、混合するよく。
8. ファルコン50mlチューブ（ 図1D）上にセルストレーナー（70ミクロン）を配置します。セルストレーナーに解離した細胞を含む上清を移し、それが通過するまで上下にフィルター上の細胞懸濁液をピペットで。
9. 血球計数器で細胞数をカウントします。 5分間4℃で2,000 rpmで遠心分離し、チューブ;吸引し、上清を捨てる。
10. DMEMで10mlの2％のFBSで再懸濁する。 5分間4℃で2,000 rpmで遠心分離し、チューブ;吸引し、上清を捨てる。
11. DMEM中で2％FBS200μlで再懸濁し、1.5 mlのマイクロチューブに細胞懸濁液を転送します。通常、約2×10 ^6個の細胞は、1匹のマウスの筋肉から採取しなければならない。細胞を、DMEM、2％FBS100μl中1×10 ⁶細胞の濃度まで希釈される。

2。抗体染色とMacとの分離

次のPRの間にocedures、無菌バッファを使用して無菌状態を維持している。抗体の各ボリュームを添加し、細胞懸濁媒体は、1匹のマウスの全体の筋肉からの細胞について計算される。細胞を、2又はそれ以上のマウスから採取された場合、試薬の量が最適化されるべきである。

1. 細胞懸濁液200μlに1μL、CD31-PE、CD45-PE、SCA-1-PE、およびα7インテグリン抗体をそれぞれ追加します。氷上で30分間インキュベートする。
2. 細胞を洗浄：インキュベーション後、1.5mlチューブ中の細胞懸濁液中にDMEM 1ml中の2％のFBSを追加し、3分間、4℃、2,000 rpmで遠心分離する。二回、この手順を繰り返します。
3. 吸引し、上清を捨てる。
4. DMEM中で2％FBS200μlで細胞を再懸濁し、そしてアンチPE磁性ビーズ10μlを加える。氷上で30分間インキュベートする。
5. インキュベーション後、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の細胞懸濁液にMACSバッファーの1ミリリットルを追加し、3分間、4℃で2,000 rpmで遠心分離：細胞を洗浄。この手順TWを繰り返し氷。細胞は磁気カラムで分離される前に、MACSバッファーで洗浄する必要があることに注意してください。
6. 吸引し、上清を捨てる。 MACS緩衝液1.0mlで細胞を懸濁します。
7. マグネットボード上のLD列を設定し、MACS緩衝液（ 図1E）の2.0ミリリットルでカラムをすすぐ。
8. LDカラムに細胞懸濁液を移し、1.5mlチューブにフロースルー画分を収集する。この画分は、PE陰性細胞が含まれています。
9. 3分間4℃、2,000 rpmで、吸引で遠心し、上清を捨てる。
10. DMEM中で2％FBS200μlで細胞を再懸濁し、そして抗マウスIgG磁気ビーズの10μlを加える。氷上で30分間インキュベートする。
11. 細胞を洗浄：インキュベーション後、1.5mlチューブ中の細胞懸濁液にMACS緩衝液1mlを追加し、3分間、4℃で2,000 rpmで遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。二回、この手順を繰り返します。 MACS緩衝液500μlで細胞を懸濁します。
12. マグネットボード上のMSカラムを設定し、MACS緩衝液（ 図1F）を500μlでカラムをすすぐ。
13. 転送は、MSカラムに細胞溶液を懸濁し、フロースルー画分（インテグリンα7陰性細胞）を廃棄します。
14. MACSバッファー1mlですすぎ、二回、この手順を繰り返します。
15. すすいだ後、分離器の磁場から列を削除します。カラムをMACS緩衝液1.0mlを適用し、塔頂からシリンジプランジャを押して、1.5mlのマイクロチューブに磁気標識細胞（インテグリンα7陽性細胞）を溶出。 1.5ミリリットルチューブにフロースルーを収集します。 MACSバッファー1.5mlで溶出を繰り返し、フロースルーを収集する。
16. 3分間4℃、2,000 rpmで、吸引で遠心し、上清を捨てる。
17. 筋芽細胞培地1mlで精製された細胞を再懸濁（20％FBSは、bFGFとハムのF-10を含まれている）、およびマトリゲル被覆されたを10cmのプレート細胞筋芽細胞中の8ミリリットル（6cmのプレートの5ミリリットル）（ 図1G）でプレート。 1〜2×10 ^5個の細胞を、潜在的に1無傷マウス筋肉から単離することができることに留意されたい。

3。メンテナンス

1. 筋芽細胞の培地で一日おきに細​​胞を養う。成長筋芽細胞の出現は、それらの核内でのMyoD（ 図2）とのPax7（データは示さず）を発現する小さな丸い形状である。
2. 筋芽細胞は、50％のコンフルエンス時または細胞融合を開始する前に継代されるべきである。 PBSで一回洗浄した後、CO ₂インキュベーター中で3分間37℃で、0.25％トリプシン溶液で細胞をインキュベートし、筋芽細胞培地で解離した細胞を収集する。遠心分離機細胞（5分間1,000 rpmで）した後、筋芽細胞培地で一時停止し、新しいマトリゲル被覆プレート上に細胞をreplate。コラーゲンコートしたプレートは、流路3の後に使用することができる。一方のプレートは、通常、四時五十七プレートに分割することができる。

4。Differentiation

1. 一日おきに分化培地で再給。
2. 分化培地中の1日目では、筋芽細胞は、細胞周期を終了し、ミオシン重鎖（MHC）陽性筋への分化を受ける。これらmyoctyesは多核筋管を生成するために相互に細胞融合を始める。通常、ほとんどの筋芽細胞は、分化培地で一日3〜5により、MHC陽性差別単核筋細胞や筋管（ 図2）になる。

骨格筋再生のためのマウスに5。筋芽細胞移植

1. アベルチン（250 mg / kg）を腹腔内（IP）注射でマウスを麻酔し。
2. 前脛骨筋（TA）は、筋肉の皮膚の毛を剃るの周り。二十四時間筋芽細胞移植の前に、10μMのCTX（50μl）を筋肉内に剃毛した皮膚（ 図 31〜Gのインスリンを注射器で筋肉の再生を誘導するためにNOD / SCIDマウスの脛骨筋に注入される60、3）。
3. 増殖する筋芽細胞を0.25％トリプシン溶液で解離し、5分間1,000 rpmで遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 DMEM中の2％のFBS50μlの再懸濁、1×10 ^6個の細胞。 31 Gのインスリン注射器の中に懸濁した細胞を移す。
4. レシピエントマウスは、IP注射によってアベルチン（250mg/kg /日）で麻酔され、1×10 ⁶筋芽細胞（ 図2）は、TA筋肉の再生筋肉に注入される。
5. 組織学的分析のために細胞注入後1〜4週までに収穫脛骨筋（ 図3）。

結果

新たに単離した静止衛星細胞は小さく、丸みを帯びた形状（ 図1G）を表示し、静止衛星細胞のための決定的なマーカーとしてのPax7を発現する。新たに単離した細胞の90％以上がのPax7（ 図1Hおよび1I）を発現する。最も汚染された細胞は、効率的に筋芽細胞の培養条件に従って、インビトロで増殖しない血液細胞からのものである。このように、衛?...

ディスカッション

このプロトコルでは、静止衛星細胞を容易にコラゲナーゼ消化および表面抗体媒介MACS分離による成体マウスの骨格筋から精製することができる。この方法では、約6時間かかり、このようなFACS装置など高価な設備を必要としません。さらに、この方法は、表面抗体媒介FACS分離に比べて比較的安価である。 FACSレーザ露光分離¹⁵の間に細胞死を誘導する傾向があるため、静止衛星細胞の...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.