Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Resumo

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Resumo

Células satélites musculares são uma população de células-tronco necessárias para o desenvolvimento muscular esquelética pós-natal e da regeneração, sendo responsável por 2-5% dos núcleos sublaminal nas fibras musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso. Após lesão, no entanto, as células satélites iniciar a proliferação celular para produzir os mioblastos, as suas progênies, para mediar a regeneração dos músculos. O transplante de mioblastos derivados de células-satélite tem sido amplamente estudada como uma possível terapia para várias doenças regenerativas incluindo distrofia muscular, insuficiência cardíaca e disfunção urológica. O transplante de mioblastos em Latossolo músculo esquelético, coração infartado, e disfuncionamento ductos urinários mostrou que mioblastos enxertados podem se diferenciar em fibras musculares nos tecidos do hospedeiro e apresentar melhora funcional parcial nestas doenças. Portanto, o desenvolvimento de métodos de purificação eficiente de células satélites quiescentes de muscl esqueléticoe, assim como o estabelecimento de culturas de células derivadas de mioblastos de satélite e métodos de transplante de mioblastos, são essenciais para a compreensão dos mecanismos moleculares por trás de células auto-renovação satélite, ativação e diferenciação. Além disso, o desenvolvimento de terapias à base de células para a distrofia muscular e outras doenças regenerativos são também dependentes desses factores.

No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem o uso de caras activada por fluorescência (FACS) de células máquinas. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético por dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Estes recém-isoladascélulas satélites quiescentes ou ex vivo mioblastos expandidas podem ser transplantadas em cardiotoxina (CTX) induzida por rato em regeneração do músculo esquelético para examinar a contribuição de células derivadas do dador para a regeneração das fibras musculares, bem como para compartimentos celulares por satélite para o exame da auto-renovação actividades.

Introdução

Células satélites musculares são uma pequena população de células-tronco miogênicas localizadas abaixo da lâmina basal das fibras musculares esqueléticas. Eles são caracterizados pela expressão de Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina de ^1-3. Células satélites têm provado ser responsável para a regeneração muscular, as células-tronco musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso ^4-8. Após lesão, as células satélites são ativadas, iniciar expressão de MyoD e entrar no ciclo celular para expandir a sua descendência, chamadas de células precursoras miogênicas ou mioblastos ^3. Depois de vários ciclos de divisão celular, mioblastos sair do ciclo celular e fusível para o outro, a fim de sofrerem diferenciação em miotubos multi-nucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Mioblastos isolados de músculo adulto pode facilmente ser expandidas ex vivo. A capacidade para mioblastos para tornar as fibras musculares na regeneração muscular eformar fibras musculares ectópica em tecidos nonmuscle é explorada por transplante de mioblastos, uma aproximação terapêutica potencial para a distrofia muscular de Duchenne (DMD), ^4, disfunção urológica ^9, e a insuficiência cardíaca ^10. Com efeito, os mioblastos foram transplantadas com sucesso no músculo de ambos mdx (modelo DMD) e ratos doentes DMD ^11-14. Os mioblastos normais injectados fundir com as fibras musculares de acolhimento para melhorar a histologia e função do músculo doente. Trabalhos anteriores demonstraram que subpopulações de mioblastos são mais células-tronco semelhantes e permanecem em um estado indiferenciado mais no músculo durante a regeneração muscular ^5. Trabalhos recentes mostraram que as células satélites recém-isoladas de músculo adulto conter uma população de células-tronco como que exibe o enxerto mais eficiente e atividade auto-renovação na regeneração muscular ^5-8. Portanto, a purificação de uma população pura de células satélites quiescentes de mu esquelético adultoesclerose é essencial para compreender a biologia de células satélites, mioblastos e regeneração muscular, e para o desenvolvimento de terapias baseadas em células.

No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem a utilização de um activado por fluorescência celular separação caro (FACS) da máquina ^1,2,6-8. Além disso, a exposição ao laser FACS tende a induzir a morte celular durante a separação, o que faz com que o rendimento mais baixo de células quiescentes de satélite ^15. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético. Este método utiliza dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Mostramos também que a injeção intramuscular dessas células satélites quiescentes recém-isoladas ou ex vimioblastos vo expandidos podem ser transplantadas para cardiotoxina (CTX) induzida regeneração do músculo esquelético do rato para examinar a contribuição de células derivadas de doadores para regenerar as fibras musculares, bem como para os compartimentos de células satélites para o exame de atividades de auto-renovação.

Protocolo

Os animais foram alojados em um ambiente SPF e foram monitorados pela pesquisa Recursos Animais (RAR), da Universidade de Minnesota. . Os animais foram sacrificados através de meios adequados (CO ₂ inalação ou injecção de KCl, após ter sido anestesiados com injecção IP de Avertin (250 mg / kg) Todos os protocolos foram aprovados pelo Animal Care and Use Committee 'da Institucional (IACUC, Número Código: 1304-30.492 ) da Universidade de Minnesota.

1. Isolamento de células mononucleares de Rato Músculo Esquelético

1. Devidamente sacrificar um ou dois ratos adultos jovens (3-8 semanas).
   1. Aperte e cortou a pele do abdômen com uma tesoura afiada. Retire a pele para mostrar completamente tríceps e musculatura dos membros posteriores (puxar a pele em direções opostas).
   2. Remova todos os músculos das pernas esqueléticas (tibial anterior, gastrocnêmio e quadríceps) e tríceps ao longo dos ossos com uma tesoura. Em seguida, transferir os músculos para gelado, PBS estéril numa placa de 10 centímetros.
2. Lave sangue de músculos em PBS e músculos de transferência para um novo 6 centímetros estéril placa: 1 placa de 1-2 ratos.
3. Remover o tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, feixes nervosos e tecido adipogênica sob um microscópio de dissecação.
4. Com uma tesoura para oftalmologia, cortar e picar o tecido em uma pasta lisa (Figuras 1A e 1B). Tente não deixar pedaços grandes, já que não será dividida prontamente pela solução enzimática.
5. Transferir músculos picados para um tubo Falcon de 50 mL, e adicionam-se 5 ml de solução de colagenase (0,2% de colagenase do Tipo 2 em 10% de FBS em DMEM). Incubar a 37 ° C durante 60 min.
6. Triturar (para cima e para baixo com uma agulha 18 G) para homogeneizar a mistura (Figura 1C). Em seguida incubar ainda mais a mistura a 37 ° C durante 15 min.
7. Triturar novamente para homogeneizar mistura para dissociar-se em suspensão única célula. Adicionar 2% de FBS em DMEM até 50 ml para a suspensão de células individuais e misturábem.
8. Coloque um filtro celular (70 mM) em um tubo Falcon de 50 ml (Figura 1D). Transferir o sobrenadante contendo as células dissociadas em um coador de células, e a suspensão celular pipetar para cima e para baixo no filtro até que ela passe através.
9. Contar o número de células em hemocitômetro. Centrifugar os tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; aspirado e descartar o sobrenadante.
10. Ressuspender com 10 ml de 2% de FBS em DMEM. Centrifugar os tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; aspirado e descartar o sobrenadante.
11. Ressuspender com 200 mL de 2% FBS em DMEM e suspensão de células transferência para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Normalmente, cerca de 2 x 10 ⁶ células devem ser colhidas a partir de músculos de um rato. As células vão ser diluídas para uma concentração de 1 x 10 ⁶ células em 100 ul de 2% de FBS em meio DMEM.

2. Anticorpo Coloração e separação com MACS

Durante o seguinte procedures, manter condições estéreis utilizando tampões estéreis. Cada volume de anticorpos adicionados e meio de suspensão de célula é calculada para as células dos músculos inteiros de um rato. Se as células são colhidas a partir de duas ou mais ratos, a quantidade de reagentes deve ser optimizado.

1. Adicionar 1 ml de cada um CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e Integrina anticorpo α7 em 200 ul de suspensão de células. Incubar em gelo durante 30 min.
2. Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de 2% de FBS em DMEM na suspensão de células no tubo de 1,5 ml e centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita esta etapa duas vezes.
3. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células com 200 mL de 2% FBS em DMEM, e adicionar 10 ml de Anti-PE esferas magnéticas. Incubar em gelo durante 30 min.
5. Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão de MACS para a suspensão de células no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e, em seguida, centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este passo twgelo. Note-se que as células deverão ser lavadas pelo tampão MACS antes de ser separada por coluna magnética.
6. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células com 1,0 ml de tampão de MACS.
7. Configure coluna LD em uma placa magnética, e lavar a coluna com 2,0 ml de tampão MACS (Figura 1E).
8. Transferência da suspensão de células para dentro da coluna de LD, e recolher a fracção de escoamento num tubo de 1,5 ml. Esta fracção contém células PE-negativo.
9. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos, aspirado e desprezar o sobrenadante.
10. Suspenda as células com 200 ul de 2% de FBS em DMEM, e adicionar 10 ul de IgG anti-ratinho esferas magnéticas. Incubar em gelo durante 30 min.
11. Lavar as células: Após a incubação, adicionar 1 ml de tampão de MACS para a suspensão de células em 1,5 ml de tubo e, em seguida, centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as células com 500 ul de tampão de MACS.
12. Configure coluna MS em uma placa magnética, e lavar a coluna com 500 mL de tampão MACS (Figura 1F).
13. Transferência suspensa solução de células na coluna MS, e descartar a fração de fluxo (células α7 negativo integrinas).
14. Enxágüe com 1 ml de tampão MACS, e repita esta etapa duas vezes.
15. Depois de enxaguar, remover a coluna a partir do campo magnético do separador. Aplicar 1,0 ml de tampão de MACS para a coluna, e eluir as células magneticamente marcadas (células α7-positivo Integrina) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, empurrando o êmbolo da seringa a partir do topo da coluna. Recolhe-se o fluxo de passagem para um tubo de 1,5 ml. Repete-se a eluição com 1,5 ml de tampão de MACS e recolher o fluxo de passagem.
16. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos, aspirado e desprezar o sobrenadante.
17. Ressuspender as células purificadas com 1 ml de meio de mioblasto (FBS a 20% continha Hams F-10 com bFGF), e células da placa em Matrigel-revestidas 10 centímetrosplaca com 8 ml de mioblasto Médio (5 ml em seis centímetros placa) (Figura 1G). Note-se que de 1-2 x 10 ⁵ células pode, potencialmente, ser isolado a partir de um músculo intacto do rato.

3. Manutenção

1. Alimentar as células a cada dois dias com meio mioblasto. O aparecimento de mioblastos em crescimento é de uma pequena e rodada expressando MyoD (Figura 2) e Pax7 (dados não mostrados) no seu núcleo.
2. Mioblastos devem ser passadas antes dos 50% de confluência ou quando iniciar a fusão celular. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células com uma solução de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 3 minutos em uma incubadora de CO ₂ e recolher células dissociadas com meio mioblasto. Após centrifugar células (1.000 rpm por 5 min), suspender com meio mioblasto e replate células em novas placas Matrigel-revestidos. Placas revestidas com colagénio pode ser usado após a passagem 3. Uma placa pode ser geralmente dividida em 3-5 placas.

4. Diferentiation

1. Alimente novamente com Diferenciação Médio em dias alternados.
2. Por volta do dia 1 de Diferenciação Médio, mioblastos sair do ciclo celular e sofrem diferenciação em cadeia pesada da miosina (MHC) positivo miócitos. Estes myoctyes começar a fusão das células com o outro para gerar miotubos multinucleados. Tipicamente, a maioria dos mioblastos tornar miócitos MHC-positivos mononucleares de diferenciação ou miotubos (Figura 2) por dia 3-5 na Diferenciação Médio.

5. Mioblasto Transplante em mouse para Skeletal regeneração muscular

1. Anestesiar o rato com Avertin (250 mg / kg) por via intraperitoneal (IP) de injecção.
2. Raspar o cabelo da pele em torno do músculo tibial anterior (TA). Vinte e quatro horas antes do transplante de mioblastos, 10 uM CTX (50 ul) é injectada por via intramuscular para o Node / músculo de ratinho SCID TA para induzir a regeneração do músculo através de uma seringa de 31 L de insulina através da pele raspada (Figura60, 3).
3. Mioblastos em proliferação são dissociados com uma solução de tripsina a 0,25% e centrifugadas a 1.000 rpm durante 5 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Ressuspender 1 x 10 ⁶ células, com 50 ul de 2% de FBS em DMEM. Transferir as células em suspensão com uma seringa de insulina de 31 L.
4. Os ratinhos receptores serão anestesiados com Avertin (250 mg / kg) por injecção IP, e os 1 x 10 ⁶ mioblastos (Figura 2) são injectadas por via intramuscular em regeneração muscular TA.
5. Colheita TA muscular por 1-4 semanas após a injecção das células para análise histológica (Figura 3).

Resultados

Células satélites quiescentes recentemente isoladas exibir uma forma pequena e redonda (Figura 1G) e Pax7 expressa como um marcador definitivo para as células satélites quiescentes. Mais de 90% das células recentemente isoladas expressam Pax7 (Figura 1H e 1I). A maioria das células contaminadas são a partir de células de sangue que não crescem de forma eficiente in vitro seguintes condições de cultura de mioblastos. Assim, mioblastos derivados de cé...

Discussão

Neste protocolo, as células satélites quiescentes podem ser facilmente purificadas a partir de músculo esquelético de ratinhos adultos por digestão com colagenase e de separação MACS mediada por anticorpos da superfície. Este método leva cerca de 6 horas e não precisa de nenhum equipamento caro, como uma máquina de FACS. Além disso, este método é relativamente barato em comparação com a superfície mediada por anticorpo de separação FACS. Uma maior produção de células quiescentes de satélite també...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.