Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Riepilogo

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

Abstract

Cellule satelliti del muscolo sono una popolazione di cellule staminali necessarie per lo sviluppo post-natale del muscolo scheletrico e la rigenerazione, pari al 2-5% dei nuclei sublaminal nelle fibre muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo. Dopo la lesione, tuttavia, le cellule satelliti iniziano proliferazione cellulare per produrre mioblasti, loro progenie, per mediare la rigenerazione del muscolo. Il trapianto di mioblasti derivati ​​dalle cellule satellite è stato ampiamente studiato come una possibile terapia per varie malattie, tra cui rigenerativi distrofia muscolare, insufficienza cardiaca e disfunzione urologica. Trapianto di mioblasti in distrofico muscoli scheletrici, cuore infartuato, e le disfunzioni vie urinarie ha dimostrato che i mioblasti engrafted possono differenziarsi in fibre muscolari nei tessuti dell'ospite e visualizzare miglioramento funzionale parziale in queste malattie. Pertanto, lo sviluppo di metodi di purificazione efficiente di cellule satelliti quiescenti da muscl scheletricoe, così come la creazione di cellule derivate da colture di mioblasti satellitari e metodi di trapianto di mioblasti, sono essenziali per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di cellule auto-rinnovamento satellitare, attivazione e differenziazione. Inoltre, lo sviluppo di terapie cellulari per la distrofia muscolare e altre malattie rigenerative dipendono anche da questi fattori.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di costosi fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) macchine. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico per dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Questi appena isolatocellule satelliti quiescenti o ex vivo mioblasti espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerante topo muscoli scheletrici per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché compartimenti cellulari satellite per l'esame di auto-rinnovamento attività.

Introduzione

Cellule satelliti muscolari sono una piccola frazione di cellule staminali miogeniche situati sotto la lamina basale delle fibre muscolari scheletriche. Essi sono caratterizzati dall'espressione di Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina ^{1 - 3.} Le cellule satelliti hanno dimostrato di essere responsabile della rigenerazione muscolare come cellule staminali muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo ^4-8. A seguito di infortunio, le cellule satellite sono attivati, avviare espressione di MyoD, e entrare nel ciclo cellulare per espandere la loro progenie, chiamato cellule precursori miogeniche o mioblasti ^3. Dopo diversi cicli di divisione cellulare, mioblasti escono dal ciclo cellulare e fusibile tra loro al fine di differenziamento in miotubi multi-nucleate, seguite da fibre muscolari mature. Mioblasti isolati dal muscolo adulto possono essere facilmente espanse ex vivo. La capacità di mioblasti per diventare fibre muscolari in rigenerazione muscolare e perfibre muscolari ectopiche forma nei tessuti non muscolari è utilizzata da trapianto dei mioblasti, un potenziale approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) ^4, disfunzioni urologiche ^9, e insufficienza cardiaca ^10. Infatti, mioblasti sono stati trapiantati con successo nel muscolo di entrambe mdx (modello DMD), topi e pazienti DMD ^11-14. I mioblasti normali iniettati fondono con le fibre muscolari ospitante per migliorare l'istologia e la funzione del muscolo malato. Il lavoro precedente ha dimostrato che sottopopolazioni di mioblasti sono più Stem Cell-like e rimangono in uno stato indifferenziato più a lungo nel muscolo durante la rigenerazione muscolare ^5. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule appena isolate satellitari di muscolo adulto contengono una popolazione di cellule simil-staminali che presenta attecchimento più efficiente e attività di auto-rinnovamento nella rigenerazione del muscolo ^5-8. Pertanto, la purificazione di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti da adulto mu scheletricosclerosi è essenziale per la comprensione della biologia delle cellule satelliti, mioblasti e rigenerazione muscolare, e per lo sviluppo di terapie cellulari.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di un costoso fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) ^1,2,6-8 macchina. Inoltre, l'esposizione laser FACS tende ad indurre la morte cellulare durante la separazione, che causa bassa resa di cellule satelliti quiescenti ^15. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico. Questo metodo utilizza dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Mostriamo anche che l'iniezione intramuscolare di questi appena isolate cellule satellite quiescenti o ex vimioblasti vo espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerazione del mouse muscolo scheletrico per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché ai compartimenti cellulari satellitari per l'esame delle attività di auto-rinnovamento.

Protocollo

Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente SPF e sono stati monitorati dalla Direzione Risorse ricerca su animali (RAR) dell'Università del Minnesota. . Gli animali sono stati sacrificati con mezzi adeguati (CO ₂ inalazione o iniezione KCl dopo essere stati anestetizzati con iniezione IP di Avertin (250 mg / kg) Tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC, numero di codice: 1304-30.492 ) dell'Università del Minnesota.

1. Isolamento di mononucleari cellule dal muscolo scheletrico mouse

1. Correttamente sacrificare 1 o 2 giovani topi adulti (3-8 settimane).
   1. Pizzicare e fessura la pelle dell'addome con forbici affilate. Staccare la pelle per mostrare completamente tricipiti e muscoli degli arti posteriori (tirare la pelle in direzioni opposte).
   2. Rimuovere tutti i muscoli delle gambe scheletriche (tibiale anteriore, gastrocnemio e quadricipite) e tricipiti lungo le ossa con le forbici. Poi il trasferimento muscoli ghiacciata, sterile PBS in un piatto 10 centimetri.
2. Lavare il sangue fuori i muscoli in PBS e muscoli trasferimento ad una nuova piastra sterile 6 centimetri: 1 piastra per 1-2 topi.
3. Rimuovere il tessuto connettivo, vasi sanguigni, fasci nervosi, e tessuto adipogenico sotto un microscopio di dissezione.
4. Utilizzando le forbici per oftalmologia, tagliare e tritare il tessuto in una pasta liscia (Figure 1A e 1B). Cercate di non lasciare pezzi di grandi dimensioni, in quanto non saranno suddivisi facilmente dalla soluzione enzimatica.
5. Trasferire i muscoli tritati in una provetta Falcon da 50 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di collagenasi (0,2% collagenasi di tipo 2 nel 10% FBS in DMEM). Incubare a 37 ° C per 60 min.
6. Triturare (su e giù con un ago 18 G) per omogeneizzare la miscela (Figura 1C). Incubare ulteriormente la miscela a 37 ° C per 15 min.
7. Triturare nuovo per omogeneizzare la miscela a dissociarsi in sospensione singola cella. Aggiungere 2% FBS in DMEM fino a 50 ml nella sospensione di cellule singole e mescolarebene.
8. Mettere un filtro cella (70 micron) su un tubo ml Falcon 50 (Figura 1D). Trasferire il supernatante contenente le cellule dissociate su un filtro cella e pipetta la sospensione cellulare su e giù sul filtro fino ad attraversare.
9. Contare il numero di cellule da emocitometro. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
10. Risospendere con 10 ml di 2% FBS in DMEM. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
11. Risospendere con 200 ml di 2% FBS in DMEM e sospensione cellulare trasferimento in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Solitamente, circa 2 x 10 ⁶ cellule devono essere raccolte da muscoli di 1 mouse. Le cellule saranno diluiti ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule in 100 microlitri di 2% FBS in DMEM.

2. Antibody colorazione e separazione con MACS

Durante il seguente procedures, mantenere condizioni di sterilità utilizzando tamponi sterili. Ogni volume di anticorpi aggiunto e mezzo di sospensione cellulare è calcolato per cellule di muscoli intere di 1 mouse. Se le cellule vengono raccolte da 2 o più topi, la quantità di reagenti dovrebbe essere ottimizzato.

1. Aggiungere 1 ml ciascuna di CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e integrina anticorpo α7 in 200 microlitri della sospensione cellulare. Incubare in ghiaccio per 30 min.
2. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di 2% FBS in DMEM nella sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questa operazione due volte.
3. Aspirare e scartare il surnatante.
4. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di Anti-PE sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
5. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS alla sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml microcentrifuga, e quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questo passaggio twghiaccio. Si noti che le celle devono essere lavati a tampone MACS prima di essere separati da una colonna magnetica.
6. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere le cellule con 1,0 ml di tampone MACS.
7. Impostare colonna LD su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 2.0 ml di tampone MACS (Figura 1E).
8. Trasferire la sospensione cellulare in colonna LD, e raccogliere la frazione di flusso passante in una provetta da 1,5 ml. Questa frazione contiene cellule PE-negativo.
9. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
10. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di IgG anti-topo sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
11. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS in sospensione di cellule in provetta da 1,5 ml, quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere le cellule con 500 microlitri di tampone MACS.
12. Impostare colonna MS su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone MACS (Figura 1F).
13. Trasferimento sospeso soluzione di cellule nella colonna MS, e scartare la frazione flow-through (integrina α7-negativi cellule).
14. Sciacquare con 1 ml di tampone MACS, e ripetere questo passaggio due volte.
15. Dopo il risciacquo, rimuovere colonna dal campo magnetico del separatore. Applicare 1,0 ml di tampone MACS sulla colonna, ed eluire le cellule marcate magneticamente (cellule positive α7-integrina) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga spingendo lo stantuffo della siringa dalla parte superiore della colonna. Raccogliere il flusso continuo in una provetta da 1,5 ml. Ripetere l'eluizione con 1,5 ml di tampone MACS e raccogliere il flow-through.
16. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
17. Risospendere le cellule purificate con 1 ml di Myoblast medio (20% FBS conteneva Hams F-10 con bFGF), e cellule piastra su Matrigel rivestite 10 centimetripiastra con 8 ml di Myoblast Piano (5 ml a 6 centimetri piastra) (Figura 1G). Si noti che 1-2 x 10 ⁵ cellule possono potenzialmente essere isolate dal 1 muscolo intatto il mouse.

3. Manutenzione

1. Concime cellule ogni altro giorno con mezzo Myoblast. La comparsa di mioblasti crescita è di un piccolo e rotondo esprimere MyoD (Figura 2) e Pax7 (dati non mostrati) nel loro nucleo.
2. Mioblasti dovrebbero essere diversi passaggi prima che il 50% di confluenza o quando si inizia la fusione cellulare. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule con soluzione di tripsina 0,25% a 37 ° C per 3 minuti in un incubatore CO ₂ e raccogliere le cellule dissociate con mezzo Myoblast. Dopo cellule centrifuga (1000 rpm per 5 min), la sospensione con il mezzo Myoblast e replate cellule su nuove piastre Matrigel rivestite. Piastre di collagene rivestite possono essere utilizzati dopo il passaggio 3. Un piatto di solito può essere suddiviso in 3-5 piatti.

4. Differentiation

1. Inserire di nuovo con Differenziazione medio ogni altro giorno.
2. Di giorno 1 nella differenziazione Medium, mioblasti escono dal ciclo cellulare e subiscono differenziazione in catena pesante della miosina (MHC)-positivo miociti. Questi myoctyes iniziano fusione cellulare con l'altro per generare miotubi multinucleate. In genere, la maggior parte dei mioblasti diventano MHC-positivi di differenziazione miociti mononucleate o miotubi (Figura 2) di giorno 3-5 in Differenziazione Medium.

5. Myoblast trapianto in mouse per la rigenerazione muscolare scheletrica

1. Anestetizzare il mouse con Avertin (250 mg / kg) per via intraperitoneale (IP) iniezione.
2. Radersi i capelli pelle intorno sul tibiale anteriore (TA) muscolare. Ventiquattro ore prima del trapianto di mioblasti, 10 pM CTX (50 microlitri) viene iniettato per via intramuscolare nel Nod / Scid topo TA muscolare per indurre la rigenerazione muscolare attraverso una siringa da 31 G insulina attraverso la pelle rasata (Figura60, 3).
3. Mioblasti proliferanti sono dissociate con 0,25% di soluzione di tripsina, e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere 1 x 10 ⁶ cellule con 50 ml di 2% FBS in DMEM. Trasferire le cellule in sospensione in una siringa da insulina 31 G.
4. Topi riceventi saranno anestetizzati con Avertin (250 mg / kg) per iniezione IP, e 1 x 10 ⁶ mioblasti (Figura 2) vengono iniettati per via intramuscolare nel muscolo rigenerante TA.
5. Harvest TA muscolare 1-4 settimane dopo l'iniezione delle cellule per l'analisi istologica (figura 3).

Risultati

Cellule satelliti quiescenti appena isolate mostrano un piccolo, forma rotonda (Figura 1G), e Pax7 espresso come marcatore definitivo per le cellule satellite quiescenti. Più del 90% delle cellule appena isolate esprimono Pax7 (Figura 1H e 1I). Maggior parte delle cellule contaminate sono da cellule del sangue che non crescono in modo efficiente in vitro seguente condizioni di coltura mioblasti. Così, mioblasti derivati ​​dalle cellule satelliti dominano ...

Discussione

In questo protocollo, cellule satelliti quiescenti possono essere facilmente purificati da adulto muscolo scheletrico di topi da digestione con collagenasi e separazione MACS mediata da anticorpi superficie. Questo metodo richiede circa 6 ore e non necessita di apparecchiature costose come una macchina FACS. Inoltre, questo metodo è relativamente poco costoso rispetto alla superficie di separazione FACS mediata da anticorpi. Una maggiore resa di cellule satelliti quiescenti si aspetta anche in confronto a FACS per ques...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.