Изоляция, культура, и трансплантация мышечных сателлитных клеток

Резюме

Выделение и культура чистой популяции покоящихся сателлитных клеток, мышц стволовых клеток населения, имеет важное значение для понимания мышечной биологии стволовых клеток и регенерации, а также трансплантации стволовых клеток для лечения в мышечной дистрофии и других дегенеративных заболеваний.

Аннотация

Мышцы спутниковые клетки стволовых клеток населения необходимы для постнатального развития скелетных мышц и регенерации, что составляет 2-5% от sublaminal ядер в мышечных волокнах. Во взрослой мышцы, клетки-сателлиты, как правило, митотически покоя. После травмы, однако, сателлитные клетки инициировать пролиферацию клеток, чтобы произвести миобластов, их потомство, посреднические регенерацию мышц. Трансплантация клеток, полученных миобластов спутниковых был широко изучен в качестве возможного лечения в течение нескольких регенеративных заболеваний, включая мышечную дистрофию, сердечной недостаточности, и урологической дисфункции. Трансплантация миобластов в дистрофических скелетных мышцах, инфаркта сердца, и неблагополучных мочевыводящих протоков показал, что привитые миобласты могут дифференцироваться в мышечные волокна в ткани хозяина и отображения частичное функциональное улучшение в этих заболеваний. Таким образом, разработка эффективных способов очистки покоящихся сателлитных клеток из скелетной MUSCLэ, а также созданию клеточных полученных культур миобластов спутниковых и методов трансплантации для миобластов, имеют важное значение для понимания молекулярных механизмов позади спутниковым клеток к самообновлению, активации и дифференциации. Кроме того, развитие клеточной терапии для мышечной дистрофии и других заболеваний регенеративных также зависит от этих факторов.

Однако современные перспективные методы очистки покоящихся сателлитных клеток требуют использования дорогостоящего флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS машин). Здесь мы представляем новый метод для быстрого, экономичного и надежного очистки покоящихся сателлитных клеток из взрослых мыши скелетных мышцах по ферментативной диссоциации с последующим магнитного активированный сортировки клеток (ПДК). После выделения чистых покоящихся сателлитных клеток, эти клетки могут быть культивированы для получения большого количества миобластов после нескольких пассажей. Эти Свежевыделенныепокоящиеся клетки-сателлиты или Экс Vivo расширенные миобласты можно пересадить в cardiotoxin (CTX), вызванной регенерации мыши скелетных мышц изучить вклад донора клеток в регенерации мышечных волокон, а также спутниковое клеток отделениями для рассмотрения самообновления деятельность.

Введение

Мышцы спутниковые клетки небольшая популяция миогенных стволовых клеток, расположенных под базальной пластинки скелетных мышечных волокон. Они характеризуются выражением Pax7, Pax3, с-Met, М-кадгерина, CD34, синдекана-3, и кальцитонин ^{1 - 3.} Спутниковые клетки оказались ответственны за регенерации мышц как мышечных стволовых клеток. Во взрослой мышцы, клетки-сателлиты, как правило, митотически покоя ^4-8. После травмы, спутниковые клетки активируются, инициировать выражение MyoD и введите клеточный цикл, чтобы расширить свое потомство, называется миогенные клетки-предшественники или миобластов ^3. После нескольких раундов деления клеток, миобластов выхода из цикла и предохранитель клеток друг с другом для того, чтобы пройти дифференцировку в мульти-дерных мышечных трубок, после чего зрелый мышечных волокон. Миобласты выделенные из взрослой мышцы легко может быть расширена экс естественных. Способность к миобластов стать мышечные волокна в регенерации мышц иформа внематочной мышечные волокна в немышечно тканей эксплуатируется трансплантации миобластов, потенциальный терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) ^4, урологической дисфункции ^9, и сердечной недостаточности ^10. Действительно, миобласты успешно пересадили в мышцах обеих MDX (ДМД модель) мышей и пациентов с МДД ^11-14. Инъецированные нормальные миобласты сливаться с хост мышечных волокон для улучшения гистологии и функции пораженного мышцы. Предыдущая работа показала, что субпопуляции миобластов более стволовых клеток, как и остаются в недифференцированном состоянии больше в мышцах во время регенерации мышечной ^5. Последние исследования показали, что свежевыделенных спутниковые клетки из взрослых мышцы содержат клетки, как население штока, которая демонстрирует более эффективное приживление и самообновлению деятельность в регенерации мышц ^5-8. Таким образом, очистка чистой популяции покоящихся сателлитных клеток из взрослых скелетных муSCLE имеет важное значение для понимания биологии сателлитных клеток, миобластов и регенерации мышц, и для развития клеточной терапии.

Однако современные перспективные методы очистки покоящихся сателлитных клеток требуют использования дорогостоящего флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS) машины ^1,2,6-8. Кроме того, FACS лазерное облучение имеет тенденцию вызывать гибель клеток в процессе разделения, которое вызывает низкий выход покоящихся клеток спутников ^15. Здесь мы представляем новый метод быстрого, экономичного и надежного очистки покоящихся сателлитных клеток из взрослых мышей скелетных мышцах. Этот метод использует ферментативной диссоциации с последующим магнитного активированный сортировки клеток (ПДК). После выделения чистых покоящихся сателлитных клеток, эти клетки могут быть культивированы для получения большого количества миобластов после нескольких пассажей. Показано также, что внутримышечные инъекции этих свежевыделенных покоящихся сателлитных клеток или экс VIВ.О. расширенные миобласты можно пересадить в cardiotoxin (CTX), вызванной регенерации мыши скелетных мышц изучить вклад донора клеток к регенерации мышечных волокон, а также в отделениях спутниковых клеток для рассмотрения самообновления деятельности.

протокол

Животных содержали в условиях SPF и контролировались исследовательских животных ресурсов (RAR) из Университета Миннесоты. . Животных умерщвляли с помощью соответствующих средств (СО ₂ ингаляции или KCl инъекции после того, как под наркозом с IP инъекции Avertin (250 мг / кг) Все протоколы были одобрены уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC, кодовый номер по: 1304-30492 ) из Университета Миннесоты.

1. Выделение мононуклеарных клеток из мыши скелетных мышц

1. Правильно пожертвовать 1 или 2 молодых взрослых мышей (3-8 недели).
   1. Pinch и разрезать кожу живота с острыми ножницами. Снимите кожу, чтобы полностью показать трицепсы и мышцы задней конечности (потяните кожу в противоположных направлениях).
   2. Удалите все ноги скелетных мышц (передней большеберцовой, икроножной и четырехглавой) и трицепсы вдоль костей с ножницами. Затем трансфер мышцы ледяной стерильной PBS в 10 см пластины.
2. Вымойте кровь с мышцы в PBS и мышцы передачи на новый стерильный 6 см Столешница: 1 тарелку на 1-2 мышей.
3. Удалить соединительную ткань, кровеносные сосуды, нервные пучки и Adipogenic ткани под микроскопом рассечение.
4. С помощью ножниц для офтальмологии, вырезать и фарш ткани в гладкую целлюлозы (фиг. 1A и 1B). Старайтесь не оставлять большие куски, так как они не будут разбиты готовностью ферментного раствора.
5. Трансфер фарш мышцы в мл трубки Falcon 50, и добавляют 5 мл раствора коллагеназы (0,2% коллагеназы типа 2 в 10% FBS в DMEM). Инкубировать при 37 ° С в течение 60 мин.
6. Triturate (вверх и вниз с 18 G иглы) гомогенизации смеси (рис. 1в). Затем дополнительно инкубировать смеси при 37 ° С в течение 15 мин.
7. Растирают снова гомогенизировать смесь диссоциировать в суспензии отдельных клеток. Добавить 2% FBS в DMEM до 50 мл в суспензии отдельных клеток и смешатьхорошо.
8. Наведите сотовый сетчатый фильтр (70 мкм) на Falcon 50 мл трубки (рис. 1D). Передача супернатант, содержащий диссоциированных клеток на клеточный фильтр и пипетки клеточной суспензии вверх и вниз на фильтре, пока он не проходит.
9. Подсчитать количество клеток, гемоцитометре. Центрифуга трубки на 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 мин; аспирации и отбросить супернатант.
10. Ресуспендируют с 10 мл 2% FBS в DMEM. Центрифуга трубки на 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 мин; аспирации и отбросить супернатант.
11. Ресуспендируют с 200 мкл 2% FBS в DMEM и передачи клеточной суспензии в 1,5 мл микропробирок. Как правило, около 2 × 10 ⁶ клетки должны быть собраны из мышц 1 мыши. Клетки будут разбавлены до концентрации 1 × 10 ⁶ клеток в 100 мкл 2% FBS в DMEM.

2. Антитела Окрашивание и разлуки с MACS

В течение следующего прocedures, поддержания стерильных условий с помощью стерильных буферов. Каждый том антител добавил и суспензию клеток среднего рассчитывается для клеток из целых мышц 1 мыши. Если клетки собирают из 2 или более мышей, количество реагентов должны быть оптимизированы.

1. Добавить 1 мкл каждого из CD31-PE, CD45-PE, SCA-1-PE, и интегрином α7 антитела в 200 мкл клеточной суспензии. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
2. Промыть клеток: После инкубации добавляют 1 мл 2% FBS в DMEM в клеточной суспензии в 1,5 мл пробирку, и центрифуге при 2000 оборотах в минуту при 4 ° С в течение 3 мин. Повторите этот шаг дважды.
3. Аспирируйте и отбросить супернатант.
4. Ресуспендируют клеток с 200 мкл 2% FBS в DMEM и добавить 10 мкл анти-PE магнитных шариков. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
5. Промыть клеток: После инкубации добавляют 1 мл буфера MACS к клеточной суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 2000 оборотов в минуту при 4 ° С в течение 3 мин. Повторите этот шаг служлед. Следует отметить, что клетки должны быть промывают MACS буфера перед разделены магнитного колонки.
6. Аспирируйте и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток с 1,0 мл буфера MACS.
7. Настройка колонку LD на магнитной доске, и промойте колонку 2,0 мл MACS буфера (рис. 1E).
8. Передача клеточной суспензии на колонку LD, и собирать проточный долю в 1,5 мл трубки. Эта фракция содержит PE-отрицательных клеток.
9. Центрифуга при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 3 мин, аспирата и отбросить супернатант.
10. Ресуспендируют клеток с 200 мкл 2% FBS в DMEM и добавить 10 мкл анти-мышь IgG магнитных шариков. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
11. Промыть клеток: После инкубации добавляют 1 мл буфера MACS в клеточной суспензии в 1,5 мл пробирку, а затем центрифугируют при 2000 оборотов в минуту при 4 ° С в течение 3 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют клеток с 500 мкл MACS буфера.
12. Настройте колонки MS на магнитной доске, и промойте колонку с 500 мкл MACS буфера (рис. 1F).
13. Передача приостановлено решение клеток на колонку MS, и выбросьте проточный фракцию (интегрина α7-отрицательных клеток).
14. Промыть 1 мл MACS буфера, и повторить этот шаг дважды.
15. После промывки удалить столбец из магнитного поля сепаратора. Применение 1,0 мл буфера MACS на колонку и элюируют магнитно меченых клеток (интегрина α7-позитивных клеток) в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, нажав на поршень шприца из верхней части колонны. Сбор проточные в 1,5 мл трубки. Повторите вымывание с 1,5 мл MACS буфера и собирать проточные.
16. Центрифуга при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 3 мин, аспирата и отбросить супернатант.
17. Ресуспендируют очищенные клетки с 1 мл среды миобластов (20% FBS, содержащиеся Hams F-10 с оФРФ) и пластинчатые элементы на Матригель покрытием 10 смпластина с 8 мл миобластов Medium (5 мл в 6 см пластины) (рис. 1 г). Следует отметить, что 1-2 × 10 ⁵ клеток потенциально могут быть выделены из 1 цельной мышцы мыши.

3. Техническое обслуживание

1. Поток ячеек через день с миобластов среды. Появление растущих миобластов является небольшой и круглой формы, выражающей MyoD (рисунок 2) и Pax7 (данные не показаны) в их ядра.
2. Миобласты следует пассировать до 50% слияния или при запуске слияния клеток. После промывки один раз ЗФР, инкубировать клетки с 0,25% раствором трипсина при 37 ° С в течение 3 мин в СО _{2-инкубаторе} и собирать диссоциированных клеток миобластов среды. После центрифуг клеток (1000 оборотов в минуту в течение 5 мин), приостановить миобластов среды и replate клетки на новые пластины Матригель покрытием. Коллагеновые покрытием пластины могут быть использованы после прохождения 3. Одна пластина обычно можно разделить на 4:57 пластин.

4. Differentiation

1. Подпитку с дифференциацией среды через день.
2. Днем 1 в дифференциации среды, миобласты выходят из клеточного цикла и подвергаются дифференцировке в тяжелой цепи миозина (МНС)-положительных миоцитов. Эти myoctyes начать слияние клеток друг с другом для создания многоядерные мышечные трубки. Как правило, большинство миобласты стать MHC-положительные отличающих одноядерные миоциты или мышечных трубках (рис. 2) в день 3-5 в дифференциации среды.

5. Миобластов Трансплантация в мышь для скелетных мышц регенерации

1. Анестезировать мышь авертином (250 мг / кг) по внутрибрюшинно (IP) инъекции.
2. Бритье волос кожи вокруг на большеберцовой передней (ТА) мышцы. Двадцать четыре часа до трансплантации миобластов, 10 мкМ CTX (50 мкл) внутримышечно вводят в NOD / мышцы Scid мыши TA, чтобы вызвать регенерацию мышц через 31 G инсулина шприцем через бритой кожи (рис.60, 3).
3. Пролиферирующие миобластов диссоциируют с 0,25% раствором трипсина и центрифугировали при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант. Ресуспендируют 1 × 10 ⁶ клеток с 50 мкл 2% FBS в DMEM. Трансфер приостановленные клетки в инсулиновый шприц 31 G.
4. Мыши-реципиенты будут анестезии авертином (250 мг / кг) путем инъекции IP, и 1 х 10 ⁶ миобласты (рис. 2) внутримышечно вводят в регенерации мышц TA.
5. Мышцы Урожай Т.А. на 1-4 недели после инъекции клеток для гистологического анализа (рис. 3).

Результаты

Свежевыделенные покоящиеся клетки-сателлиты отображать небольшую, круглую форму (рис. 1 г) и ускоренная Pax7 качестве окончательного маркера для покоящихся сателлитных клеток. Более 90% свежевыделенных клеток выразить Pax7 (Рисунок 1H и 1i). Самые загрязненные клет?...

Обсуждение

В этом протоколе покоя спутниковые клетки могут быть легко очищен от взрослых скелетных мышцах мышей по коллагеназой и поверхностных антитело-опосредованной разделения MACS. Этот метод принимает около 6 часов и не требует дорогостоящего оборудования, таких как машины FACS. Кроме того, это...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.