근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

요약

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

초록

근육 위성 세포는 근육 섬유에 sublaminal 핵 2 ~ 5 %를 차지, 출생 후의 골격 근육 발달 및 재생에 필요한 줄기 세포 집단이다. 성인 근육 위성 세포는 일반적으로 mitotically 정지합니다. 손상 후, 그러나, 위성 세포는 근육의 재생을 중재하는 아세포, 그들의 자손을 생산하는 세포 증식을 시작. 위성 세포 유래 근육 모세포 이식 널리 근육 영양 장애, 심장 마비, 및 비뇨 장애 등 여러 가지 재생 질환에 대한 가능한 치료로 연구되고있다. 이영 골격 근육, 심장 경색 및 dysfunctioning 요도 관에 근 모세포 이식 접목 근원 세포가 호스트 조직에서 근육 섬유로 분화 및 이러한 질병에 부분적인 기능 개선을 표시 할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서 골격 muscl에서 정지 위성 세포의 효율적인 정제 방법의 개발전자뿐만 아니라 위성 세포 유래 근원 세포 배양 및 근육 아세포를위한 이식 방법의 확립으로, 위성 세포의자가 재생, 활성화, 차별화 뒤에 분자 메커니즘을 이해하는 데 필수적이다. 또한, 근육의 영양 장애 및 기타 재생 질환에 대한 세포 기반 치료법​​의 개발은 이러한 요인에 따라 달라집니다.

그러나, 정지 위성 세포의 현재 장래 정제 방법은 고가의 형광 - 활성 세포 선별 (FACS) 기계의 사용을 필요로한다. 여기, 우리는 (MACS)를 정렬 자기 활성화 된 셀 다음에 효소 분해에 의해 성인 마우스 골격 근육에서 정지 위성 세포의 급속한 경제적이고 신뢰할 수있는 정제를위한 새로운 방법을 제시한다. 순수한 정지 위성 세포의 분리 후,이 세포는 여러 통로 후에 근육 아세포 다수 구하는 배양 될 수있다. 이 갓 고립정지 위성 세포 또는 생체 확장 아세포는 cardiotoxin에 이식 할 수있다 (CTX) 근육 섬유 재생에 기증자 유래 세포의 기여를 검사하는 마우스 골격 근육을 재생 유도뿐만 아니라 자기 갱신의 시험 위성 세포 구획에 활동.

서문

근육 위성 세포가 골격근 섬유의 기저판 아래에 위치한 근육 조직 줄기 세포의 작은 집단이다. 그들은 Pax7, PAX3, C-메트, M-cadherin의, CD34, Syndecan-3의 발현을 특징으로하고, 칼시토닌 ^{1된다 - 3.} 위성 세포는 근육 줄기 세포로 근육의 재생을위한 책임을 입증했다. 성인 근육 위성 세포는 ^4-8 일반적으로 mitotically 정지합니다. 손상 후, 위성 세포가 MyoD 발현을 개시하고, 그 자손을 확장 세포주기를 입력, 활성화, 근육 조직 전구체 세포 또는 근육 아세포 ³ 칭했다. 세포 분열 몇 차례 한 후, 근육 아세포는 성숙한 근육 섬유 이어 멀티 핵 myotubes로 차별화를 받아야하기 위해 각각의 다른 세포주기 및 퓨즈를 종료합니다. 성인 근육에서 분리 된 근육 아세포는 쉽게 생체 확장 할 수 있습니다. 근육 재생과에 근육 섬유가 될 수 아세포의 용량nonmuscle 조직의 형태 자궁외 근육 섬유의 근 모세포 이식, Duchenne 근육 퇴행 위축 (DMD) ^4에 대한 잠재적 인 치료 방법, 비뇨기 장애 ^(9), 심장 마비 ^(10)에 의해 이용된다. 사실, 근육 아세포는 성공적으로 모두 MDX (DMD 모델) 마우스와 DMD 환자의 ^{11 ~ 14의} 근육에 이식되었다. 주입 된 정상 근원 세포는 병에 걸린 근육의 조직 학적 및 기능 향상을 위해 호스트 근육 섬유와 융합. 이전 작업은 근육 아세포의 모집단이 더 세포와 같은 줄기 근육 재생 ^5시 근육에 이상 미분화 상태로 유지하는 것을 보여 주었다. 최근 작품은 성인 근육 갓 고립 된 위성 세포는 근육 ^{5-8 재생에보다} 효율적으로 생착과 자기 갱신의 활동을 나타내는 줄기 세포와 같은 인구를 포함하는 것으로 나타났습니다. 따라서 성인 골격 MU로부터 정지 위성 세포의 순수 인구 정화용scle는 위성 세포, 근육 아세포와 근육 재생의 생물학을 이해하고, 세포 기반 치료법​​의 개발을 위해 필수적이다.

그러나, 정지 위성 세포의 현재 장래 정제 방법은 고가의 형광 - 활성 세포 선별 (FACS) 기계 ^1,2,6-8의 사용을 필요로한다. 또, FACS 레이저 노광 정지 위성 세포 ^(15)의 낮은 수율로 인해 분리시 세포 사멸을 유도하는 경향이있다. 여기, 우리는 성인 마우스 골격 근육에서 정지 위성 세포의 급속한 경제적이고 신뢰할 수있는 정제를위한 새로운 방법을 제시한다. 이 방법은 (MACS)를 정렬 자기 활성화 된 셀 다음에 효소 분해를 이용한다. 순수한 정지 위성 세포의 분리 후,이 세포는 여러 통로 후에 근육 아세포 다수 구하는 배양 될 수있다. 우리는 또한 보여 이들 갓 고립 된 정지 위성 세포 또는 전 VI의 근육 내 주사할머니 확장 아세포가 cardiotoxin에 이식 할 수있다 (CTX) 근육 섬유뿐만 아니라 자기 갱신 활동의 시험 위성 세포 구획에 재생에 기증자 유래 세포의 기여를 검사하는 마우스 골격 근육을 재생 유도.

프로토콜

동물은 SPF 환경에서 보관하고, 연구 동물 자원 미네소타 대학의 (RAR)에 의해 감시했다. . 동물 (에버 틴 (250 ㎎ / ㎏)의 IP 주입으로 마취 된 후 CO ₂ 흡입 또는 KCl을 주입 적절한 방법에 의해 안락사 된 모든 프로토콜은 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC, 코드 번호에 의해 승인되었습니다 : 1304-30492 ) 미네소타 대학의.

마우스 골격근에서 단핵 세포의 1. 격리

1. 제대로 1 또는 2 젊은 성인 마우스 (3-8 주)가 희생.
   1. 핀치와 날카로운 가위로 복부의 피부를 슬릿. 완전히 (반대 방향으로 피부를 당겨) 삼두근과 뒷다리의 근육을 보여주기 위해 피부를 벗겨.
   2. 가위로 뼈를 따라 모든 다리 골격 근육 (전 경골근, 비복근, 그리고 대퇴사 두근)과 삼두근을 제거합니다. 그런 다음 10cm 접시에 얼음처럼 차가운, 멸균 PBS에 근육을 전송.
2. 새로운 멸균 6cm 판에 PBS에있는 근육 및 전송 근육의 혈액을 씻어 : 1 판을 1-2 마우스의 경우.
3. 해부 현미경으로 결합 조직, 혈관, 신경 번들 및 지방 형성 조직을 제거합니다.
4. (그림 1A 및 1B) 잘라 부드러운 펄프로 조직을 말하다, 안과 용 가위를 사용. 그들은 효소 용액에 의해 쉽게 분해되지 않으므로, 큰 조각을 남기지 않도록하십시오.
5. 팔콘 50 ML 튜브에 다진 근육을 전송하고, 콜라게나 제 용액 (0.2 % 콜라게나 제 유형 DMEM에있는 10 %의 FBS) 5 ㎖를 추가합니다. 60 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
6. 씹다 (상하 18 G 바늘) 혼합물 (그림 1C)을 균일화 할 수 있습니다. 그런 다음 추가로 15 분 동안 37 ° C에서 혼합물을 품어.
7. 단일 세포 현탁액으로 해리 된 혼합물을 균질화 다시 씹다. 최대 단일 세포 현탁액에 50 ml의 DMEM에서 2 % FBS를 추가하고 혼합잘.
8. 팔콘 50 ML 튜브 (그림 1D)에 셀 스트레이너 (70 μm의)를 배치합니다. 셀 스트레이너 상에 해리 된 세포를 포함하는 상등액을 전송하며, 그것을 통해 통과 할 때까지 상하 필터에 세포 현탁액을 피펫.
9. 혈구에 의해 세포 수를 계산합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기 튜브; 대기음 상층 액을 버린다.
10. DMEM에 10 ㎖의 2 %의 FBS로 재현 탁. 5 분 동안 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기 튜브; 대기음 상층 액을 버린다.
11. 200 DMEM에서 2 % FBS ㎕의 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액을 전송로를 Resuspend. 일반적으로, 약 2 × 10 ⁶ 세포는 1 쥐의 근육에서 채취해야한다. 세포는 DMEM에서 2 % FBS 100 ㎕의 1 X 10 ⁶ 세포의 농도로 희석한다.

2. 항체 염색법과 맥 분리

다음 홍보 중ocedures, 멸균 버퍼를 사용하여 무균 조건을 유지한다. 항체의 각각의 양을 첨가하고, 세포 현탁액 매질 한 쥐의 근육 전체에서의 셀들에 대해 계산된다. 세포는 2 이상의 마우스에서 수확하는 경우, 시약의 양을 최적화해야한다.

1. 1 ㎕의 CD31-PE, CD45-PE, 무서-1-PE 및 세포 현탁액 200 μL에 인테 α7 항체를 각각 추가합니다. 30 분 동안 얼음에 품어.
2. 세포를 세척 : 부화 후, 1.5 ML 튜브에 세포 현탁액에 DMEM에서 1 ㎖ 2 %의 FBS를 추가하고, 3 분 동안 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기. 두 번이 단계를 반복합니다.
3. 기음과 상층 액을 버린다.
4. 200 DMEM에서 2 % FBS의 μL 및 안티-PE 자석 구슬의 10 μl를 추가로 세포를 Resuspend. 30 분 동안 얼음에 품어.
5. 세포를 세척 : 부화 후, 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액에 MACS 버퍼 1 ㎖를 추가 한 다음 3 분 동안 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기. 이 단계의 TW를 반복얼음. 세포는 자기 칼럼에 의해 분리되기 전에 MACS 버퍼로 세척해야합니다.
6. 기음과 상층 액을 버린다. MACS 완충액 1.0 ㎖로 세포를 재현 탁.
7. 자석 보드에 LD 열을 설정하고 MACS 버퍼 (그림 1E)의 2.0 ㎖로 컬럼을 씻어.
8. LD 칼럼 상에 세포 현탁액을 전송하며, 1.5 ㎖의 튜브에 관류 분획을 수집한다. 이 부분은 PE-음성 세포가 포함되어 있습니다.
9. 3 분, 대기음 상층 액을 버린다 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기.
10. 200 DMEM에서 2 % FBS의 μL 및 안티 - 마우스 IgG 자석 구슬의 10 μl를 추가로 세포를 Resuspend. 30 분 동안 얼음에 품어.
11. 세포를 세척 : 부화 후, 1.5 ML 튜브에 세포 현탁액에 MACS 버퍼 1 ㎖를 추가 한 다음 3 분 동안 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기. 기음과 상층 액을 버린다. 두 번이 단계를 반복합니다. MACS 버퍼 500 μL와 세포를 Resuspend.
12. 자석 보드에 MS의 열을 설정하고 MACS 버퍼 (그림 1 층) 500 μL에 열을 씻어.
13. 전송 MS 칼럼 상 세포 용액을 현탁하고, 플로우 스루 분획 (인테그린 α7-음성 세포)를 버린다.
14. MACS 버퍼의 1 ㎖로 씻어, 두 번이 단계를 반복합니다.
15. 세척 한 후, 분리의 자기장에서 열을 제거합니다. 칼럼 상 MACS 완충액 1.0 ㎖를 적용하고, 칼럼의 상부로부터 주사기 플런저를 밀어 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 자기 적으로 표지 된 세포 (인테그린 α7-양성 세포)를 용출한다. 1.5 ML 튜브에 흐름을 통해 수집합니다. MACS 버퍼의 1.5 ㎖로 용출을 반복하고 흐름을 통해 수집합니다.
16. 3 분, 대기음 상층 액을 버린다 4 ° C에서 2,000 rpm으로 원심 분리기.
17. 근원 세포 배지 1 ㎖로 정제 된 세포를 재현 탁 (20 % FBS가 bFGF를 함께 햄 F-10을 포함) 및 마트 리겔 - 코팅 10cm 접시에 세포근원 세포 중간의 8 ㎖ (6cm 판에 5 ㎖) (그림 1G)와 함께 접시. 1-2 × 10 ⁵ 세포는 잠재적으로 1 그대로 마우스 근육에서 분리 될 수 있습니다.

3. 유지 보수

1. 근원 세포 배지로 매일 세포에게 공급. 근육 아세포 성장의 외형은 핵에서 MyoD (도 2)와 Pax7 (데이터는 도시하지 않음)을 발현하는 작고 둥근 형상이다.
2. 세포 융합을 시작할 때 근육 아세포가 50 % 합류하기 전에 계대 또는해야한다. PBS로 한번 세척 한 후, CO ₂ 배양기에서 3 분 동안 37 ° C에서 0.25 % 트립신 용액으로 세포를 배양하고 근원 세포 배지로 해리 된 세포를 수집합니다. 원심 분리기 세포 (5 분 1,000 RPM) 한 후, 근원 세포 매체를 일시 중단하고 새로운 리겔 코팅 된 플레이트에 세포를 replate. 콜라겐 코팅 된 플레이트는 통로 (3) 후 사용할 수 있습니다. 한 판은 보통 3-5 플레이트로 분할 할 수 있습니다.

4. Differentiation

1. 매일 분화 배지로 재 공급.
2. 차별화 중간에 하루 1으로 근육 아세포는 세포주기를 종료하고 마이 오신 중쇄 (MHC) 양성 근육 세포로 분화를 받고있다. 이 myoctyes는 다핵 myotubes를 생성하기 위해 서로 세포 융합을 시작한다. 일반적으로 대부분의 근원 세포는 MHC-긍정적 인 차별화 단핵 근육 세포 또는 myotubes 차별화 중간에 하루 3-5로 (그림 2)이된다.

골격 근육의 재생을위한 마우스에 5. 근 모세포 이식

1. 복강 내 (IP) 주입에 의해 에버 틴 (250 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취시키다.
2. 전 경골근 (TA) 근육의 피부 머리 주위를 면도. 주야의 근 모세포 이식하기 전에, 10 μM CTX (50 μL)은 근육 면도 피부 (그림을 통해 31 G 인슐린 주사기를 통해 근육의 재생을 유도하는 끄덕임 / SCID 마우스 TA 근육에 주입60, 3).
3. 근육 아세포 증식은 0.25 % 트립신 용액으로 분해하고, 5 분 동안 1000 rpm에서 원심 분리된다. 기음과 상층 액을 버린다. DMEM에서 2 % FBS의 50 μL로 재현 탁 1 X 10 ⁶ 세포. 31 G 인슐린 주사기로 일시 중단 된 세포를 전송합니다.
4. 받는 마우스는 IP 주입하여 에버 틴 (250 ㎎ / kg)로 마취되고, 1 × ¹⁰⁶ 아세포 (도 2)을 근육 내 TA 근육 재생 주입된다.
5. 조직 학적 분석을위한 세포 주입 (그림 3) 후 1~4주으로 수확 TA 근육.

결과

갓 고립 된 정지 위성 세포는 정지 위성 세포에 대한 최종 마커로 작고 둥근 모양 (그림 1G), 간편 Pax7를 표시합니다. 갓 고립 된 세포의 90 % 이상이 Pax7 (그림 1H와 1I)를 표현한다. 대부분의 오염 된 세포가 효율적으로 근원 세포 배양 조건 다음 체외에서 성장하지 않습니다 혈액 세포에서합니다. 따라서, 위성 세포 유래 근육 아세포는 문화에 지배. 선택적으로, 우리?...

토론

이 프로토콜에서, 정지 위성 세포 간단 콜라게나 제 소화 표면 항체 - 매개 MACS 분리에 의해 생쥐의 성인 골격근으로부터 정제 될 수있다. 이 방법은 약 6 시간 소요하고 FACS 기계와 같은 고가의 장비를 필요로하지 않는다. 또한,이 방법은 표면 항체 - 매개 FACS 분리에 비해 상대적으로 저렴합니다. FACS 레이저 노출은 분리 중에 ¹⁵ 세포 죽음을 유도하는 경향이 이후 정지 위성 세포의 높은 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Collagenase Type 2	Worthington	CLS-2	100 mg
Marigel	BD Biosciences	356234	5 ml
DMEM	Gibco-Invitrogen	10569010	500 ml
Collagen (Rat Tail)	BD Biosciences	354236	100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML	500 ml
bFGF, human, Recombinant	Gibco-Invitrogen	PHG0263	1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A5611-1G	1 g
Ham’s F10 Medium	Gibco-Invitrogen	11550-043	500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco-Invitrogen	26050088	500 ml
Penicillin/Streptmycin	Gibco-Invitrogen	15640055	100 ml
Phosphate Buffered Saline	Gibco-Invitrogen	14190144	500 ml
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco-Invitrogen	25200072	500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe	Fisher Scientific	22-256-563
Cell strainer (70 μm)	Fisher Scientific	22-363-548
Falcon 50 ml tube	BD Biosciences	352098
Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
10 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353003
6 cm Tissue culture plate	BD Biosciences	353004
Falcon 10 ml disposable pipette	BD Biosciences	357551
Anti-CD31 antibody-PE	eBiosciences	12-0311
Anti-CD45 antibody-PE	eBiosciences	30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE	eBiosciences	Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody	MBL International	ABIN487462
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-091-632
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LD Column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Cardiotoxin	Sigma Aldrich	C9759-1MG	Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe	BD Biosciences	328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R)	Beckman Coulter	368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor	Beckman Coulter	368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R)	Beckman Coulter	392187
Nod/Scid immunodeficient mice	Charles River Laboratories	Strain Code 394	Use 2 months old mice
Reagents			Recipe
10% and 2% FBS DMEM			DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution			Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution			Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate			Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution			Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate			Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution			bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium			500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium			500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock			1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.