端脚甲殻類の8細胞胚から単セルのアブレーション<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

要約

端脚Parhyaleのhawaiensisは甲殻類発生学および比較節足動物発展と進化の研究のための有望なモデル生物である。このプロトコルは、Parhyaleの初期卵割期胚からの単一割球を手動で除去する方法を説明します。

要約

端脚Parhyaleのhawaiensisは、世界中の潮間帯の海洋生息地で見られる小型の甲殻類です。過去10年間、Parhyaleは十分に研究節足動物モデル生物ショウジョウバエにとって有用な外集団の比較を提供し、開発の実験室での研究のための有望なモデル生物として浮上している。 ショウジョウバエの多核体の切断とは対照的に、Parhyaleの早期切断は全割のです。初期の割球に注入されたトレーサー染料を使用フェイト·マッピングは、3つすべての胚葉及び生殖系列は、8細胞期によって確立されることが示されている。この段階では、以下の3つの割球は外胚葉を生じさせる運命され、3つは中胚葉を生じさせる運命、残りの2つの割球は、それぞれ、内胚葉および生殖細胞の前駆体であるている。しかし、割球の切除実験はParhyale胚でも大幅な規制capabilitiを有することが示されている8細胞期のアブレーション割球の運命は、残りの割球の一部の子孫に引き継がれることができるようなES、。注入及び光毒性色素または手動切除のその後の活性化：割球アブレーションは、以前のいずれかの方法によって記載されている。しかし、光切除は、割球を殺すが、胚から死んだ細胞体は削除されません。特定の割球の完全な物理的除去は、したがって、いくつかのアプリケーションのためのアブレーションの好ましい方法であってもよい。ここでは、生きているとそのまま残りの割球を保持したまま細胞体を完全に除去するために必要な機器や手動の手順を示す、Parhyale胚の 8細胞期から単一割球を手動で除去するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、8細胞期、または他の初期卵割段階の割球に任意Parhyaleセルに適用することができる。また、原則的に、このプロトコルは、初期のクレアにも適用できる可能性が他の全割で切断する海洋無脊椎動物のvage期胚。

概要

端脚甲殻類のParhyaleのhawaiensisは、進化発生生物学研究¹で使用するための大きな可能性を秘めた有望なモデル生物として、過去10年間にわたって浮上している。節足動物の中では、ほとんどのモデル系は昆虫であり、最も広範に研究され、これらの果物はキイロショウジョウバエフライです。D.キイロは昆虫双翅目のメンバーであり、基底に分岐昆虫²のものに対して誘導されるそのようなディスプレイの多くの発生学的特徴のような。また、昆虫は昆虫がpancrustaceansと呼ばれる長年の"自然な"グループ内の最も近い親戚があり、このグループは側系統であること。つまり、Pancrustacea ³亜門の中にネストされています。これは、基底部虫モデルを分岐に加えて、他の甲殻類の研究が発達形質αの進化の歴史のより広い視野を得るために必要であることを示唆しているとてもよくDに研究されているND分子機構キイロ 。しかし、非常に少数の甲殻類は、よく開発の実験室分析のために確立されている。端脚P. hawaiensisは、実験技術の範囲に従う非常に扱いやすい実験モデルシステムである。ヨコエビは親上目フクロエビ上目（ビーチホッパー、スカッド、井戸エビ）内の多くのユニークな機能を表示するため、比較的甲殻類のこのグループ内で誘導されると考えられている。それにもかかわらず、Parhyaleが提供する発生学的で機能的遺伝子操作の相対的な容易さは、この端脚モデル生物の現在の在庫に貴重な追加します。

実験動物、Pとしてhawaiensisは多くの利点を提供しています。動物は、温度と塩分の広い範囲に寛容であり、人工海水¹の大文化でよく生き残る。それはbetwを区別することは容易である最も顕著なのは、明確な形態​​的な違いに基づいてEENの男性と女性、交尾の際にメスを把握するために使用する男性が大規模な、フック、前トランク付属。発生学的と開発作業のために、P. hawaiensisはいくつかの非常に魅力的な特徴を持っています。胚形成は、約10日間持続し、性的に成熟するまでの時間は、28ºC（約6週間ですが、Parhyaleは約20〜30ºCの範囲の温度で十分に生存し、その詳細な発達ステージング情報は、C ⁴ 18度で昇胚のために利用可能であることに注意してください、25ºC ^4、および26ºC ^5,6）。大人の実験室で一年中交尾ので、胚は、一年中いつでも可能です。女性は最初のいくつかの脚部の対（ 図1Aおよび図1B）との間に位置する腹側育児嚢への受精卵（雌の年齢に応じて）2-20を置き、それは、これらの胚を収集することが可能である女性を殺すか、胚（ 図1C）を損傷することなく、非常に早い段階で開発中のS。胚が孵化に通して濾過した人工海水中で生き残り、その後の遺伝子発現または組織学的分析のために固定^7、詳細ステージング表⁵を介して、現像進行の正確な同定を可能にすることができる。堅牢なプロトコルは、RNA干渉^13,15又はモルホリノ^12、及び安定した生殖系列遺伝子導入¹⁸による機能ノックダウン、in situハイブリダイゼーション ^{8-15 4,16,17}または^免疫染色におけるによる遺伝子発現解析を行うために使用されている。遺伝子導入システム、誘導発現¹⁴および¹⁹の方法はまた、P.における遺伝子機能を研究するために用いることができるエンハンサートラップを使用してhawaiensis。公的に利用可能なゲノム配列は、現在利用可能ではありませんが、卵形成および胚発生中に生成転写物を含んだトランスクリプトームは、蜂を持っているN デノボを組み立て^、20の注釈付き、および遺伝子発見を容易に検索可能なデータベース²¹に寄託。要するに、P. hawaiensisは、開発を理解するための複数の実験的および遺伝的アプローチに適し、非常に扱いやすいモデル生物である。

Dの初期の多核体の切断とは異なり、 キイロ、P. hawaiensis胚は受精（ 図2A）以下の全割で切断する。分析のトレースは、第三の系統切断により、第三の開裂割球の各々が具体的に三胚葉又は生殖細胞系^6（ 図2B）のいずれかを生じさせるように運命づけられていることを示している。これらのデータは、一緒になって、マイクロアレイデータ²²と、細胞系統は^6,23を解析し、割球分離実験^4は、発生電位はセルの非対称継承によって、少なくともいくつかの第三の開裂割球に偏析していることを示唆しているLの運命決定因子。細胞の非存在によって示されるように従って、（Parhyale細胞系統命名法⁶の「 グラム 」と呼ばれる）の生殖細胞系前駆体は、8細胞期で除去された割球アブレーション実験において、胚は、後期発生段階⁴から生殖細胞を欠いていほとんどの後生動物²⁴における生殖細胞系列のマーカーであるタンパク質ヴァーサ号を発現する。対照的に、体細胞割球アブレーション実験は、P. hawaiensis胚も8細胞期で切除され、中胚葉または外胚葉前駆割球の運命は、残りの割球²⁵のいくつかの子孫に引き継がれ ​​ることができるような大幅な規制能力を持っている。どのように調節的細胞運命の交換が発生する可能性があり、体細胞割球による自律的な細胞運命の採用の程度は、未知のままである。このような割球アブレーションなどの実験発生学的手法は、understanに便利です鼎は相対的な自律性と細胞運命決定^26,27のnonautonomyとは、P.の研究に興味がある、したがってhawaiensisの胚発生。

外胚葉および中胚葉系統の調節的置換を示した実験において、割球アブレーションは、注射²⁸及び光毒性色素²⁵の後続の励起により行った。この技術は注入された割球（複数可）を殺すのに効果的であるが、それは完全に胚から死んだ細胞体は削除されません。また、違いは細胞系譜蛍光系統トレーサー^28,29と割球を注入することによって、胚発生の原腸段階に至るまで収集されたデータ、及び同じ胚のステージ²³の開発を通じて非摂動割球に従うことによって収集されたデータとの間で観察されている。特定の割球の完全な物理的除去は、したがって、いくつかのアプリケーションのためのアブレーションの好ましい方法であってもよい。

我々は以前、細胞系統の結果は、単セル^23を手動でアブレーションされた胚の分析を発表した。しかし、初期の卵割期胚からの単一割球を除去するために必要な繊細な操作は、まだ完全に記載されていない。ここでは、Pの収集のためのプロトコルを提示hawaiensis胚と8細胞期胚からの単一割球を手動で切除。この方法の目的は、胚発生および後胚発生中に残存する細胞の細胞挙動の観察および細胞運命の能力を可能にする胚からの細胞体の完全な除去を達成することである。我々のプロトコルは、生殖細胞系前駆グラム （ 図2C）の除去を示しているが、以前の開裂段階の割球を、8細胞段階で任意のセルに適用することができる。原則として、このプロトコルは、パーソナルプラグインの初期卵割期胚から単一細胞を除去するために適用することができるR全割で海洋無脊椎動物を切断。

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プロトコル

特定の手順を実行する際に役立つかもしれないコメントはイタリック体で示されている。

1。 1日目：材料の調製

1. 以下の材料を（材料および装置の表を参照）準備します。
   • 15センチメートルと22センチパスツールピペット
   • ダイヤモンドスクライブ
   • 1 mg / mlのアムホテリシンB（100 mg / mlの保存溶液の1:100）、100単位/ mlペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（原液の1:50に含むフィルター人工海水（0.0018から0.0020の間に塩分） ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン5,000 mg / mlの5,000単位/ mlを含有する
   • 無添加フィルター人工海水（0.0018から0.0020の間塩分）
   • 住宅カップルのための大規模なプラスチック容器（15cm以上×15センチ×5cm）に
   • 小さな（3 cm以上5cm）にシルガードを敷いたペトリ皿
   • 小さな（3 cm以上5cm）にペトリ皿
   • 時計皿またはガラス製マルチウェルプレート
   • 鉗子（私たちはあちこちに派生鈍鉗子を使用我々は鉗子の端が両方の歯が同じ長さであることを、滑らかであり、彼らはもはや持っていることをことを保証するために、石を研ぐ鉗子を使用して再利用している、誤って他の実験手順で被害を受けたM旧デュモン＃5鉗子、シャープポイント。彼らは胚および/または女性を傷つける可能性がある新たなデュモン＃5鉗子などの非常に微細な鉗子は、望ましくない。）
   • 終了したパスツールピペット（下記ステップ1.2を参照）を広げ
   • パスツールピペットの細い端部に埋め込まれた薄い、湾曲タングステンワイヤからなる胚検索ツール（代替の実装で置き換えることができ、1.3以下を参照のこと）
   • 小さな開口部で口ピペット（以下のステップ1.4を参照してください）
   • プルガラスキャピラリーから作られたガラス針（以下のステップ1.5を参照してください）
   人間に有毒ない材料は、このプロトコルで使用されていません。リスク管理のGuidelで必要とされるが、研究者は、手袋などの保護服装を着用することを確認する必要があります所属機関のINES。
2. それから広がったパスツールピペット、ピペットは、ダイヤモンドスク狭い指を保護するためにキムワイプや紙タオルでピペットの得点部位をラップし始めの時点で15cmのパスツールピペットの周りの第1のスコア、慎重を作成するにはスコアラインの先端を解消。エッジを滑らかにするために、数秒間ブンゼンバーナーの炎の上ピペットの壊れた端を持ってください。開口部は、ピペットの最大幅より若干狭くする必要があります。
3. ツールを解剖タングステン線を作るために、15cmのガラスパスツールピペットの端部にタングステン線を挿入し、所定の位置にワイヤーを固定し、ガラスを溶融するブンゼンバーナーの炎の上に簡単に保持します。フック形状に穏やかにカーブワイヤの端に鉗子を使用してください。このツールの適切な形状の例については、 図3を参照してください。
4. 口のピペット用の小さな開口部を作るために、二つの部分OV開始22センチパスツールピペットの細い端を引っ張るER炎、小端の先端を解消。口のピペットホルダーの端部に挿入します。
5. ニードルプラーを用いて切除処置中に関心対象の割球を穿刺するために使用されるガラス針を作る。適切な形状の針が図4に示されている。この針は、パラメータ2X（熱= 566、プル= 100、速度= 20時間= 250）+ 1Xでプログラムを使用してサターのP97針プラーで引いた（熱= 566、プル= 100、速度= 100時間= 250）。まだまた、胚の絨毛膜に押し付けたときに破損しないよう十分に頑丈であること、針を作るために使用される特定のプログラムと機器を変えることができるが、針は細かい点を持っている必要があります。

2。 1日目：ザ·ギャザリングParhyale嵌合カップル

1. Pを交配収集するために拡大し、パスツールピペット（上記の手順は1.2）を使用して、大規模な培養容器からhawaiensisカップル 、およびCを含む別の容器に転送人工海水を傾けます。これは海水を濾過する必要はない。翌朝は、ほとんどの胚は最近受精や堆積ため、早期の切断に適したステージされていますように、後の午後には、相手のペアを収集し、室温で一晩（20〜23℃）でカップルを残すために最善のことですアブレーション。一部の女性は、次の朝までに初期卵割期胚を運ぶされることを保証するために、少なくとも20の嵌合ペアを収集します。

3。 2日目：ザ·ギャザリングParhyale胚

• 翌朝、CO ₂を用いて濾過人工海水（FASW）を注入する。メスの中には、夜の間にその男性から無料で泳いているでしょう。これらの分離の女性を集めて、FASW / CO ₂でそれらを麻酔。 残りの不対男性は交配対容器から取り出し、大きな培養に戻すことができる。残りの交配のペアは、後の胚の収集のために保存することができます当日または翌日中。
• FASW / CO ₂中の時計皿に胚を運ぶ単一の麻酔をかけた女性を転送します。すべての分離の女性はおそらく、女性の透明寛骨プレート（ 図1A）を介して淡いピンクや紫色の球状体などの目で見えるようになりますこれ、卵を堆積しているでしょう。胚は初期卵割段階にあると割球の切除のためこのように適切かどうかを判断するために、研究者が育児嚢から胚を削除し、顕微鏡下でそれらを検討する必要があります。
• 解剖顕微鏡下で手順を見て、鉗子で体の片側に沿って寛骨プレートを把握する。胚は、これらの寛骨プレート（ 図1B）間の腹側育児嚢に表示されます。
• 育児嚢の後端に、ゆっくりひなを分離するために育児嚢の前端に向かってワイヤーを持ち上げ、細い、曲がったワイヤ工具（上記の手順1.3 の図3）を挿入しますポーチ用敷物（これらは³⁰ oostegites呼ばれる腹側の付属を修正している）、ポーチを開いて胚を緩める。この膜は、産卵後約2〜3時間で消え、胚はバインドされていない、すべてが簡単にワイヤ工具によって破壊され、非常に薄い、透明な膜で囲まれて置かれている最初の1時間かそこら内にある胚お互いに、またはどのような方法で女性に胚形成を通じてこれ以降。研究者が育児嚢から胚を除去するための湾曲したワイヤ工具を操縦することは、不都合なまたは困難見つけた場合、代わりの実装がある限り動きが穏やかであり、全く厳しい圧力が胚または育児嚢に適用されていないとして、使用することができる。育児嚢から胚を除去するのに適切な他のツールを密封し、平滑末端と平滑化鉗子やガラスキャピラリーが含まれています。
• Tを押し出し、開かれた育児嚢を介して水をフラッシュするために変更されていない15cmのパスツールピペットを使用して、彼は時計皿の底に沈殿べき胚。本培養に彼女を再導入する前に、リカバリを可能にするために（CO ₂を含まない）FASWをきれいにする女性を転送します。複数の雌は同じリカバリ·皿に入れたが、彼らはまだ部分的に麻酔をかけた場合、彼らは他の動物に食べられるように、女性がメインの文化にそれらを返す前に完全に回復することを可能にすることができます。
• きれいなFASWでペトリ皿に胚を転送し、その胚の段階を決定するために、顕微鏡下で表示する変更されていない15cmのパスツールピペットを使用してください。この手順に適している第三の切断（ステージ4 ^5）にある別々の胚。また、従来の生殖ディスク成立の卵割期にこのプロトコルを適用することが可能であるべきである（7-8 ^5段 ）。

4。 2日目：単一細胞を切除する

1. FASWの浅い層でのSylgardが並ぶペトリ皿を埋める。変更されていない15cmのパスツールPIを使用してくださいプレートに、単一の胚を転送するpette。
2. 鈍鉗子を用いて、穏やかに（ 図2Aおよび2B）切除される細胞を同定するために胚をロール。生殖細胞系前駆体gは、最小の大割球MAVの上に座っている最小の小割球として同定することができる。また、Gは、直接中胚葉前駆体micromeres ML、MRをシェア胚の中央にあるセルの境界線として、その向かいに直接小割球である、専用のセルに接触しない。MRがGの右の割球であり、 ミリリットルは、Gの左側の小割球です。 MR、ML、および ENの姉妹macromeresは外胚葉前駆体それぞれのEr、EL、および EPである。
3. LEF中のピンセットで研究者が右利きの場合は、Tの手が（あるいは右手の研究者が左利きされている場合）、右に目的の細胞と胚の向き（または左に研究者が左利きされている場合）、および静かに安定させる鉗子間の胚を把握する。
4. プルガラス針（上記の手順1.5、 図4）を使用して、ゆっくりと目的の細胞に穴を開ける。隣接する細胞へ、または目的の細胞の下に針をプッシュしないように、あまりにも遠くに針を挿入しないでください。針は絨毛膜とその下の細胞膜に穴を開ける必要があり、切除される細胞内に深く拡張する必要はありません。
5. 交換罰金口のピペットのガラス終わりのための胚を穿刺するために使用される針は、パスツールピペットチップ（上記のステップ1.4）を引っ張った。目的の細胞内に作成穴の近くにピペットの先端を持ち、非常に穏やかな吸引を適用します。
6. 非常に静かに鉗子で胚を絞る。胚盤の内容として単なるステップ4.4で作成した穴から絨毛膜の外に押し出され、胚の遮るもののないビューを可能にするために口のピペットにそれを吸う。孔が十分に大きい場合、パンクチャ細胞の核は、同様に現れることが分かる。これは全体のセルの内容が削除されていると再生できないことを確認するには良いチェックです。
7. 興味の割球が取り除かれたとして、慎重に胚を観察します。パンクしたセルの枠線は、基礎となる細胞の交点が見えるように、絨毛膜の穴の方に後退します。興味の割球のすべてが除去されるまで圧力をかけ続ける。左右に胚をロールバックする鉗子を使用して、視覚的に興味のある割球のすべてがなくなっていることを確認してください。
8. 変更されていない15cmのパスツールピペットを用いて、（FASW + 1 mg / mlのアムホテリシンB、100単位/ mlペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン）FASW +をきれいに胚を移す。
9. 個々のウェル中の割球アブレーション胚を上げるFASW +クリーン48ウェルプレートの、日々の抗生物質を補充FASW +の50％を変更する。私たちの手の中に胚が生存し、18〜28ºCからの温度範囲で、よくても、次のアブレーションを開発研究者は、最小限の乱れで胚を上げるために、クリーン（必ずしも無菌ではない）の面を持っている温度で、その胚を発生させる必要があります。コントロールと割球アブレーション胚における発生事象のタイミングを比較できるように、我々は18ºC ^{4、25ºC 4}で上昇胚可能です詳細な発達ステージング情報を読者に参照し、26ºC ^5,6。

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結果

単一の第3の切断Pの成功アブレーション次このプロトコルで説明したように部分的に切除された旧割球の占有スペースを占めるようにhawaiensisの micromeresは、残りのmicromeresは徐々に少しの位置をずらす。 Gが除去されると、たとえば、割球のMRに隣接しては若干シフトし、Gと直接接触する（ 図2Aおよび2Cの比較）で、?...

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ディスカッション

我々は、手動の切除や端脚Pの初期卵割段階から単一割球を完全に物理的に除去するためのプロトコルを記述hawaiensis。我々は、8細胞期胚から単一の生殖系列前駆細胞gを除去することによって、このプロトコルの使用を示す、アブレーションは、後胚発生におけるグラムの娘細胞の有無を確認することに成功していることを示している。このプロトコル?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630 VWR	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632 VWR	For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	For creating FASW (See below).
Bunsen burner	VWR	89038-530 VWR	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650 VWR	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000 A-M Systems	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.