Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Özet

Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.

Özet

Amphipod Parhyale hawaiensis dünya çapında tertidal deniz habitatlarda bulunan küçük kabuklu olduğunu. Geçtiğimiz on yıl içinde, Parhyale iyi okudu eklembacaklı model organizma Drosophila melanogaster yararlı bir dışgrup karşılaştırma sağlayarak, geliştirme laboratuar çalışmaları için umut verici bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila sinsityal bölünmeler aksine, Parhyale erken yarılmış holoblastic bulunmaktadır. Erken blastomerlerin enjekte tracer boyalar kullanılarak kader eşleme her üç germ tabakaları ve germ hattı sekiz-hücre aşamasına göre kurulan göstermiştir. Bu aşamada, üç blastomerler ektoderm doğuran mahkum olan, üç mezoderm doğuran mahkum ve geri kalan iki blastomerler sırasıyla endoderm ve mikrop hattının ön vardır. Ancak, blastomer ablasyon deneyler Parhyale embriyoları da önemli düzenleyici capabiliti sahip olduğunu göstermiştirsekiz hücreli aşamada ablasyon Blastomerlerin kaderi kalan blastomerlerin bazı soyundan tarafından satın alınabilir es, öyle ki. Enjeksiyon ve fototoksik boyalar ya da manuel ablasyon sonraki aktivasyonu: Blastomer ablasyon daha önceleri, iki yöntemden biri ile tarif edilmiştir. Ancak, photoablation blastomerlerdir öldürür ama embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Burada canlı ve sağlam kalan blastomerlerdir tutarken hücre gövdesinin tamamen çıkarılması için gerekli olan araçları ve manuel işlemleri gösteren, Parhyale embriyoların sekiz-hücre evresinden itibaren bir blastomerlerin elle çıkarılması için bir protokol mevcut. Bu protokol, sekiz hücre evresinde veya diğer yarılma erken aşamalarında blastomerlerin için bir Parhyale hücreye uygulanabilir. Buna ek olarak, prensip olarak, bu protokol erken Clea için geçerli olabilirDiğer holoblastically yaran Omurgasız deniz vage sahne embriyolar.

Giriş

Amphipod kabuklu Parhyale hawaiensis evrimsel gelişim biyolojisi araştırmalarında ¹ kullanım için büyük potansiyeli olan bir gelecek vaat eden bir model organizma olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Meyve. D. Drosophila melanogaster uçuyordu eklembacaklılar arasında, çoğu modeli sistemleri böceklerdir ve en yaygın olarak bu okudu melanogaster böcek Diptera takımının bir üyesi olan ve bazal biçimde dallanma böceklerin ² kişilerce ilgili olarak elde edilen bu tür görüntüler çok embriyolojik özellikler gibi. Ayrıca, böcekler böcekler pancrustaceans denilen uzun ayakta "doğal" grup içinde kendi yakın akrabaları var, yani Subphylum Pancrustacea ³ iç içe olan, ve bu grup paraphyletic olduğunu vardır. Bu ek dorsalde böcek modelleri dallanma önerir, diğer kabuklular çalışmalar gelişimsel özelliklerin evrimsel tarihinin daha geniş bir görünüm kazanmak için gerekli olan birçok iyi D. çalışılmıştır nd moleküler mekanizmalar melanogaster. Ancak, çok az kabuklular iyi gelişme deneysel laboratuar analizi için kurulmuştur. Amphipod P. hawaiensis deneysel teknikler bir dizi için uygun son derece uysal bir laboratuar model sistemidir. Amphipods kendi ana superorder Peracarida (plaj siloları, scuds, ve de karides) içinde birçok benzersiz özellikleri görüntülemek ve bu nedenle nispeten kabuklular bu grup içinde türetilmiş olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, Parhyale tarafından sunulan embriyolojik ve fonksiyonel genetik manipülasyon göreli kolaylığı bu amphipod model organizmaların mevcut envanter için değerli bir katkı yapmak.

Bir laboratuar hayvanına, P. de hawaiensis bir çok avantaj sunar. Hayvanlar sıcaklık ve tuzluluk geniş bir yelpazede karşı toleranslı olan ve yapay deniz suyu ¹ büyük kültürlerinde iyi hayatta. Bu betw ayırt etmek kolaydırbelirgin morfolojik farklar, çiftleşme sırasında dişi kavramak için kullanabileceğiniz Erkeklerde en önemlisi, büyük, çengel, ön gövde uzantıları dayalı een kadın ve erkekler. Embriyolojik ve gelişimsel çalışmaları için, P. hawaiensis birkaç çok çekici özelliklere sahiptir. Embryogenezis yaklaşık 10 gün sürer ve cinsel olgunluk zamanı 28 º C'de yaklaşık altı hafta (ama Parhyale yaklaşık 20-30 º C arasında değişen sıcaklıklarda iyi hayatta unutmayın, ve bu ayrıntılı gelişimsel evreleme bilgisi 18 º C'de ⁴ yetiştirilen embriyo için kullanılabilir , 25 º C ^4, ve 26 º C ^5,6). Yetişkin laboratuvarda tüm yıl boyunca dostum, yani embriyolar yılın herhangi bir zamanında kullanılabilir. Dişiler ilk birkaç bacak çifti (Şekil 1A ve 1B) arasında yer alan bir ventral kuluçka kese içine döllenmiş yumurta (dişi yaşına bağlı olarak) 2-20 koymak ve bu embriyo toplamak mümkündürkadın öldürme veya embriyolar (Şekil 1C) zarar vermeden çok erken gelişme var. Embriyolar, tarama için süzülür yapay deniz suyu içinde hayatta sonraki gen ifadesi ya da histolojik analiz ⁷ için sabitlenebilir, ve detaylı bir hazırlama tablo geliştirilmesi ⁵ boyunca ilerleme doğru belirlenmesini sağlar. Sağlam protokolleri ya da in situ hibridizasyon ^{8-15 4,16,17} immün olarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır, ya da RNA girişim ^13,15 morpholinos ¹² ve sabit bir germ hattı ile fonksiyonel portatif ^18, genetik dönüştürme. Transgenesis sistemi, uyarılabilir ifade ¹⁴ ve ¹⁹ yöntemleri de P. gen araştırmak üzere de kullanılabilir güçlendirici tuzağı kullanılarak hawaiensis. Kamuya açık bir genom dizisi şu anda mevcut değil ise, oogenezisin ve embriyogenez sırasında üretilen transkript içeren bir transcriptome arı vardırn de novo monte edilmiş ve ²⁰ açıklamalı ve gen keşif kolaylaştıran, aranabilir bir veritabanında ²¹ yatırılır. Sonuç olarak, P. hawaiensis gelişimini anlamak için birden fazla deneysel ve genetik yaklaşımlar için uygun son derece uysal bir model organizmadır.

D. erken sinsityal bölünmeler aksine melanogaster, P. hawaiensis embriyolar holoblastically fertilizasyon (Şekil 2A), aşağıdaki bölmektedir. Köken izleme analizleri üçüncü bölünme ile, üçüncü bölme blastomerlerin her biri özel olarak üç germ tabakaların bir ya da germ hattı ⁶ (Şekil 2B) meydana getirmek için mahkum olduğunu göstermiştir. Bu veriler, birlikte mikroarray veri ^22, hücre soy ^6,23 analizleri ve blastomer izolasyon deneyleri ⁴ gelişimsel potansiyelleri cel asimetrik miras yoluyla en azından bazı üçüncü bölünme blastomerlere için ayrılmış olduğunu ileri sürmüşlerdirl kader belirleyici. Hücrelerin yokluğu ile gösterildiği gibi duruma göre, (Parhyale hücre soyu terminoloji ^6'daki "g" olarak adlandırılır) germ hattı ön sekiz hücre aşamasında uzaklaştırılmış olan blastomere ablasyon deneylerde, embriyolar, geç gelişim evrelerinde ^{4 °} germ hücreleri yoksun En metazoans ²⁴ bir germ çizgi işareti olan protein Vasa, ifade. Bunun aksine, somatik blastomere ablasyon deneyler göstermiştir ki P. hawaiensis embriyolar da önemli düzenleyici yetenekleri, sahip sekiz hücreli aşamada ablazeydi mezoderm veya ektoderm öncü blastomer kaderi kalan blastomerlerin ²⁵ bazı torunları tarafından ele olabilir böyle. Nasıl düzenleyici hücre kaderinin yedek oluşabilir, ve somatik blastomerlere otonom hücre kaderi benimsenmesi ölçüde bilinmemektedir. Örneğin blastomere ablasyonu gibi deneysel embriyolojik teknikler Understan yararlı olabilirding göreli özerklik ve hücre kaderini belirleyen ^26,27 arasında nonautonomy ve P. çalışmada ilgi bu nedenle hawaiensis embriyogenez.

Ektodermal ve mezodermal soy düzenleyici değiştirilmesini gösterdi deneylerde, blastomer ablasyon enjeksiyon ²⁸ ve fototoksik boyaların ²⁵ sonraki uyarılması ile yapıldı. Bu teknik enjekte blastomer (ler) öldürmede etkili olsa da, tamamen embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Buna ek olarak, farklılıklar hücre soyu floresan soy izleyiciler ^28,29 ile blastomerlerdir enjekte ederek embriyojenezin Gastrulasyon aşamalarında aracılığıyla toplanan verilerin, ve aynı embriyonik aşamalarında ²³ geliştirilmesi yoluyla soğukkanlı blastomerlerdir izleyerek toplanan veriler arasında gözlenmiştir. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir.

Daha önce hücre soyunun sonuçlarını yayınladı tek hücreler elle ²³ ablazeydi hangi embriyoların analizleri. Ancak, erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerdir çıkarmak için gerekli olan hassas işlemleri henüz tam olarak tarif edilmemiştir. Burada P. toplanması için bir protokol mevcut hawaiensis embriyolar ve sekiz hücreli evre embriyo tek blastomer manuel ablasyon. Bu yöntemin amacı, hücresel davranışları ve embriyogenez ve post-embriyonik gelişimi sırasında, kalan hücrelerin hücre hayati yeterliliklerinin gözlem sağlayan, embriyo, hücre gövdesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktır. Bizim protokol germ hattı ön g (Şekil 2C) çıkarılmasını gösterir, ancak veya daha bölünme aşamaları blastomerlerin için, sekiz-hücre aşamasında herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prensip olarak, bu protokol tasarımlarıyla erken bölünme evresindeki embriyolar, tek hücreleri çıkarmak için uygulanabilirr holoblastically deniz omurgasız bölünmesi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bazı adımları yürütülmesi faydalı olabilir görmediniz italik olarak gösterilmiştir.

1.. Gün 1: Malzemelerinin Hazırlanması

1. Aşağıdaki malzemeleri (Malzeme ve Ekipmanları bkz. Tablo) hazırlayın:
   • 15 cm ve 22 cm Pasteur pipetler
   • Elmas kâtip
   • Süzülen yapay deniz suyu 1 mg / ml Amfoterisin B (100 mg / ml stok çözeltisi 1:100), 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (stok çözeltisi ihtiva eden 01:50 (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk) penisilin 5000 ünite / ml streptomisin ve 5.000 mg / ml ihtiva eden)
   • katkı maddesi olmadan filtrelenmiş yapay deniz suyu (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk)
   • Konut çiftler için büyük bir plastik kap (en az 15 cm x 15 cm x 5 cm)
   • Sylgard ile kaplı küçük (3 cm veya 5 cm) petri
   • küçük (3 cm veya 5 cm) Petri kapları
   • bir gözlem ya da cam, çok oyuklu plaka
   • forseps (Kullandığımız künt forseps sağa sola türetilmişbiz yanlışlıkla forseps uçları iki çatal dişleri aynı uzunlukta olduğunu, pürüzsüz olmasını sağlamak için bileme taşı bir forseps kullanarak, ve artık sahip olduğu ile değiştirdikleri diğer laboratuvar prosedürleri, hasar gören m eski Dumont # 5 forseps kindir. Böyle yeni Dumont # 5 forseps gibi son derece ince forseps, bunlar embriyo ve / veya dişileri yaralayabilir olarak istenmemektedir.)
   • Sonunda bir Pasteur pipet (aşağıya adım 1.2) genişledi
   • Pasteur pipet ince ucu içine gömülü ince, kavisli tungsten telinin oluşan bir embriyo alma aracı (uygulamak alternatif yerini olabilir; aşağıya 1.3 bakınız)
   • küçük bir açıklığı olan bir ağız pipet (aşağıya adım 1.4)
   • Bir cam kapiller çekti yapılmış bir cam iğne (aşağıya adım 1.5 'e bakınız)
   Insanlar için toksik malzemeler yoktur bu protokol kullanılır. Risk yönetimi Guidel gereği Ancak, araştırmacılar eldiven veya diğer koruyucu kıyafetleri giymek emin olmalıdırkurumlarının ines.
2. Daha sonra genişletilmiş Pasteur pipet, pipet, bir elmas çizici ile dar parmaklarını korumak için bir Kimwipe'dan veya kağıt havlu pipet attı bölgeyi sarmak başlar noktada 15 cm Pasteur pipeti etrafında ilk puanını ve dikkatle yapmak için skor çizgisinde ucunu kırın. Kenarlarını düzeltmek için birkaç saniye için bir Bunsen beki alev üzerinde pipet kırık ucunu tutun. Açılış pipet maksimum genişliğinden az daha dar olmalıdır.
3. Tungsten tel kesme aletini yapmak için, 15 cm cam Pasteur pipet ucunu bir tungsten teli ve cam eritmek için bir Bunsen beki alev üzerinde kısa bir süre tutun, yerinde tel sabitleme. Bir çengel şekil için hafifçe eğri telin ucu forseps kullanın. Bu araç için uygun bir şekle sahip bir örnek için Şekil 3'e bakınız.
4. Ağız pipet için küçük bir açılış yapmak için, iki parça ov içine 22 cm Pasteur pipet ince ucunu çekinbir alev, ve küçük sonu ucu koparak er. Ağız pipet tutucu ucuna yerleştirin.
5. Bir iğne çektirmenin kullanılarak ablasyon prosedürü sırasında, ilgi konusu blastomerlerdir delmek için kullanılacak olan cam iğne yapın. Uygun bir biçimde şekillendirilmiş bir iğne, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Bu iğne 2x parametreleri ile bir program kullanarak bir Sutter P97 iğne çektirmesi çekildi (ısı = 566, = 100 çekin, hız = 20 = 250, zaman) + 1X (ısı = 566, çekin = 100, hız = 100, zaman = 250). Ama aynı zamanda embriyo koryon karşı itilir kırmaya yeterli sağlam olması, iğne yapmak için kullanılan belirli bir program ve alet değişebilir, ancak ince bir iğne noktası olması gerekir.

2. 1. Gün: Gathering Parhyale Çiftleşme Çiftler

1. P. çiftleşme toplamak için genişletilmiş Pasteur pipet (adım 1.2 yukarıda) kullanın hawaiensis büyük kültür kabından çiftler ve ayrı bir kap içeren bir c aktarmakYapay deniz suyu eğiliyorum. Bu tuzlu su filtre edilmesi gerekli değildir. Bu, daha sonra öğleden sonra eşleşme çiftleri toplamak ve ertesi sabah, en son döllenmiş embriyolar ve biriken ve dolayısıyla erken bölünme edilmiş, böylece, (20-23 ° C) bir karışımı, oda sıcaklığında gece çiftler bırakmak için en iyi uygun aşamaları ablasyon. Bazı kadın ertesi sabah erken bölünme aşamasında embriyo taşıyan olmasını sağlamak için en az 20 çiftleşme çiftleri toplamak.

3. 2. Gün: Gathering Parhyale Embriyolar

• Ertesi sabah, CO ₂ ile süzülmüş yapay deniz suyu (FASW) demlenmeye. Kadınlarda Bazı gece boyunca kendi erkeklerden ücretsiz swum olacak, bunlar ayrılmış kadın toplamak ve FASW / CO ₂ onları uyutmak. Kalan eşleştirilmemiş erkek çiftleşme çifti kaptan çıkarıldı ve büyük kültüre geri döndürülebilir. Kalan çiftleşme çiftleri daha sonra embriyo toplanması için kaydedilebilirgün veya ertesi gün.
• FASW / CO ₂ saat camı embriyo taşıyan tek Aneztezi kadın aktarın. Tüm ayrılan kadın büyük olasılıkla kadın şeffaf coxal plakaları (Şekil 1A) ile soluk pembe ya da mor küremsilerden gibi gözle görülebilir olacak, yumurta yatırılır olacak. Embriyoların erken bölünme aşamalarında ve blastomer ablasyon için bu nedenle uygun olup olmadığını belirlemek için, araştırmacı kuluçka torbadan embriyolar kaldırmak ve bir mikroskop altında incelemek gerekir.
• Bir mikroskop altında prosedürü görüntülerken, forseps ile vücudun bir tarafında coxal plakaları kavramak. Embriyolar bu coxal plakaları (Şekil 1B) arasındaki ventral yavru kese görünür olacak.
• Damızlık kese arka ucunu, yavaşça damızlık ayırmak için kuluçka kesesinin ön sonuna doğru kabloyu kaldırın, ince, kavisli tel aracı (yukarıdaki adım 1.3 Şekil 3) takınkese kaplamaları (bu ³⁰ oostegites denilen ventral uzantıları modifiye), keseyi açıp embriyolar gevşeterek. Bu membran Yumurtlayarak sonra yaklaşık 2-3 saat kaybolur ve embriyolar bağlı değildir, tüm kolayca tel aracı tarafından bozulacak bir çok ince, şeffaf bir zar içine konur atılmaktadır ilk saat içinde embriyolar birbirleriyle ya da herhangi bir şekilde dişi embriyojenez boyunca bu noktadan itibaren. Araştırmacılar bu rahatsız edici ya da zor damızlık torbadan embriyolar kaldırmak için kavisli tel aracı manevra bulursanız, alternatif bir sürece hareketler yumuşak ve hiçbir sert basınç embriyolar veya damızlık kese uygulanır olarak kullanılabilir uygulamak. Damızlık kese embriyolar kaldırmak için uygun diğer araçlar köreltilmiş forseps ya da mühürlü ve düzeltti sonunda bir cam kılcal bulunmaktadır.
• T dışarı iterek, açılan yavru kese ile su temizlemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanıno saat camın altına yerleşmek gerektiğini, hangi embriyoların. Ana kültürün onu reintroducing önce kurtarma izin (CO ₂ olmadan) FASW temizlemek için kadın aktarın. Birden fazla kadın aynı kurtarma çanak içine yerleştirilmiş, ancak onlar hala kısmen anestezi eğer diğer hayvanlar tarafından yemiş olabilir gibi kadın, ana kültürüne onları dönmeden önce tamamen kurtarmak için izin olabilir.
• Temiz FASW ile bir Petri kabı embriyo transferi, ve embriyonik evresini belirlemek için mikroskop altında görüntülemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanın. Bu işlem için uygun olan üçüncü bir bölünme (aşama 4 ^5), en vardır ayrı embriyolar. Ayrıca önceki germ disk oluşumuna herhangi bir bölünme aşamasına bu protokolü uygulamak mümkün olmalıdır ^(07-08 Mayıs aşamaları).

4. 2. Gün: Kesip Tek Hücreler

1. FASW sığ bir tabaka ile Sylgard kaplı Petri çanak doldurun. Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pi kullanınpette plakasına tek bir embriyo transfer etmek.
2. Künt forseps kullanılarak, hafifçe ablasyon edilecek olan hücre (Şekil 2A ve 2B) tanımlamak için embriyo döndürün. Germ hattı ön g küçük macromere Mav üstüne oturur micromere küçük olarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, doğrudan g mezoderm ön micromeres ml mr payı olarak embriyonun ortasında bir sınır hücre. Mr g sağındaki blastomere olup, bunun üzerine doğrudan karşısında micromere olan en hücreyi temas ve etmez mi g solundaki micromere olduğunu. Mr, ml, ve EN kardeş macromeres ektoderm öncüleri sırasıyla Er, El ve Ep vardır.
3. LEF forseps ilearaştırmacı sağ elini ise t el (veya sağ elinde araştırmacı sol elini ise), sağa ilgi hücre ile embriyo şark (veya sola araştırmacı sol elini ise), ve yavaşça stabilize forseps arasında embriyo kavramak.
4. Çekilmiş bir cam iğne (yukarıdaki adım 1.5, Şekil 4) kullanılarak, yumuşak, ilgi konusu bir hücreyi delinme. Komşu hücrelere veya ilgi hücrenin altında iğne itin şekilde değil, çok uzak iğne takmayın. İğne sadece koryon ve temel hücre zarı delinme vardır ve ablasyon üzere hücre içine derin uzatmak gerekmez.
5. Alışverişi para cezası ile bir ağız pipet cam sonu için embriyo delmek için kullanılan iğne Pasteur pipet (yukarıdaki adım 1.4) çekti. Ilgi hücrede oluşturulan deliğe yakın pipet ucu tutun ve çok hafif bir emme uygulanır.
6. Çok hafifçe forseps ile embriyo sıkmak. Blasto içeriği itibariylesadece, adım 4.4 oluşturulan delikten koryon dışına itti embriyo engelsiz bir görünüm sağlamak için ağız pipet içine emmek. Delik yeterince büyükse, delinmiş bir hücrenin çekirdeğinde de ortaya görülebilir. Bu tüm hücre içeriğini kaldırıldı ve rejenere olamaz emin olmak için iyi bir kontroldür.
7. Ilgi blastomere kaldırılır dikkatle embriyo gözlemlemek. Delinmiş hücrenin sınır görünür yatan hücrelerinin kavşak yapım, koryon delikten doğru kayacaktır. Ilgilenilen blastomer tüm kaldırıldı kadar basınç uygulamaya devam edilir. Yan yana gelen embriyo rulo forseps kullanın ve görsel ilgi blastomer hepsi gitti olduğunu onaylayın.
8. Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pipeti kullanılarak, (FASW + 1 mg / ml amfoterisin B, 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin) FASW + temizlemek için embriyo transferi.
9. Bireysel kuyularda blastomere-ablasyon embriyolar kaldırınFASW + temiz bir 48-çukurlu plaka içinde, günlük antibiyotik takviye FASW +% 50 değiştirilmesi. Elimizde embriyo hayatta ve 18-28 ° C arasında bir sıcaklık aralığında, daha iyi takip ablasyonu geliştirmek Araştırmacılar minimal rahatsızlık ile embriyolar yükseltmek için bir temiz (ama mutlaka steril değil) bir yüzeye sahip olduğu için bir sıcaklıkta kendi embriyolar yükseltmek gerekir. Kontrolleri ile blastomer ablasyon embriyoların gelişimsel olayların zamanlamasını karşılaştırma yapabilmek için, 18 º C ^4, 25 º C ⁴ yetiştirilen embriyo için kullanılabilir detaylı gelişimsel hazırlama bilgilere okuyucu bakın, ve 26 º C ^5,6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir üçüncü bölge P. başarı ablasyon sonra Bu protokol daha önce tarif edildiği gibi, kısmen kesilip alınmış blastomer tarafından işgal edilen alanı işgal edecek şekilde hawaiensis micromeres, kalan micromeres yavaş yavaş hafif konumlarını kayması. G kaldırıldığında Örneğin, blastomerler MR komşu ve biraz vardiya ve g ile doğrudan temas (Şekil 2A ve 2C karşılaştırın) eskiden olduğu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz manuel ablasyon ve amphipod P. erken bölünme aşamalarında tek blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması için bir protokol açıklar hawaiensis. Biz bir sekiz-hücreli aşamada embriyo tek germ hattı öncü hücre g kaldırarak bu protokolün kullanımını göstermek ve ablasyon sonra embriyojenezinde g 'nin kızı hücrelerin yokluğunu teyit başarılı olduğunu gösteriyor. Bu protokol, erken aşamalarında bölünme embriyo micromeres herhangi kald...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630 VWR	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632 VWR	For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	For creating FASW (See below).
Bunsen burner	VWR	89038-530 VWR	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650 VWR	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000 A-M Systems	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.