Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Resumo

O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.

Resumo

O hawaiensis anfípode Parhyale é um pequeno crustáceo encontrado em habitats marinhos intertidal em todo o mundo. Ao longo da última década, Parhyale emergiu como um organismo modelo promissor para estudos de laboratório de desenvolvimento, proporcionando uma comparação grupo externo útil para o modelo de artrópodes organismo bem estudado de Drosophila melanogaster. Em contraste com as clivagens sinciciais de Drosophila, os primeiros clivagens de Parhyale são holoblásticas. Mapeamento destino usando corantes traçadores injetados primeiros blastômeros têm mostrado que todas as três camadas germinativas e da linha germinal são estabelecidas pelo estágio de oito células. Nesta fase, três blastômeros estão fadados a dar origem ao ectoderma, três estão fadados a dar origem à mesoderme, e os restantes dois blastômeros são os precursores da linha endoderme e germe respectivamente. No entanto, as experiências de ablação blastômeros têm mostrado que os embriões Parhyale também possuem capabiliti regulador significativoes, de tal forma que os destinos de blastômeros cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes. Ablação blastomere tenha sido anteriormente descrita por um dos dois métodos: a injecção e a subsequente activação de corantes fototóxicas ou ablação manual. No entanto, fotoablação mata blastômeros, mas não remove o corpo de células mortas do embrião. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Aqui é apresentado um protocolo para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir da fase de oito células de embriões Parhyale, ilustrando os instrumentos e procedimentos manuais necessárias para a remoção completa do corpo da célula, mantendo as restantes blastómeros viva e intacta. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer célula Parhyale na fase de oito células, ou de blastómeros de outras fases de clivagem antecipada. Além disso, em princípio, este protocolo pode ser aplicável a clea precoceVåge embriões em estágio de outros invertebrados marinhos holoblastically clivagem.

Introdução

O Parhyale hawaiensis anfípode crustáceo emergiu na última década como um organismo modelo promissor e com grande potencial para uso em pesquisa evolucionária biologia do desenvolvimento ^1. Entre os artrópodes, a maioria dos sistemas modelo são insetos, e os mais extensivamente estudado delas é a mosca da fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster é um membro da ordem de insectos Diptera, e, como tal, apresenta muitas características da embriologia que são derivadas em relação aos dos insectos basalmente ramificação ^2. Além disso, os insetos são aninhados dentro do subfilo Pancrustacea ^3, o que significa que os insetos têm seus parentes mais próximos dentro do grupo "natural" de longa data chamado pancrustaceans, e que este grupo é parafilético. Isto sugere que, além de basally ramificação modelos de insetos, estudos de outros crustáceos são obrigados a ter uma visão mais ampla da história evolutiva das características do desenvolvimento de ummecanismos moleculares nd que foram muito bem estudados em D. melanogaster. No entanto, muito poucos crustáceos têm sido bem estabelecido para a análise de laboratório experimental de desenvolvimento. O anfípode P. hawaiensis é um sistema de modelo de laboratório altamente tratável, passíveis de uma variedade de técnicas experimentais. Amphipods exibir muitas características únicas dentro de sua superordem pai Peracarida (funis de praia, Scuds, e camarões bem), e, portanto, são pensados ​​para ser relativamente derivado dentro deste grupo de crustáceos. No entanto, a relativa facilidade de manipulação genética embrionária e funcional oferecido pelo Parhyale fazer este anfípode uma adição valiosa para o estoque atual de organismos modelo.

Como um animal de laboratório, P. hawaiensis oferece muitas vantagens. Os animais são tolerantes a uma ampla gama de temperaturas e salinidades, e sobreviver bem em grandes culturas de água do mar artificial ^1. É fácil de distinguir entre omeen homens e mulheres com base em diferenças morfológicas claras, principalmente, das grandes, em forma de gancho, apêndices tronco anterior que os machos usam para agarrar as fêmeas durante o acasalamento. Para o trabalho embrionário e de desenvolvimento, P. hawaiensis tem várias características muito atraentes. Embriogênese dura aproximadamente 10 dias eo tempo para a maturidade sexual é cerca de seis semanas a 28 º C (mas note que Parhyale sobrevive bem em temperaturas que variam de cerca de 20-30 º C, e que a informação detalhada encenação de desenvolvimento está disponível para os embriões criados a 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, e 26 º C ^5,6). Adultos acasalar durante todo o ano no laboratório, por isso embriões estão disponíveis em qualquer época do ano. As fêmeas colocam 2-20 (dependendo da idade das fêmeas) ovos fecundados num marsúpios ventral situada entre os vários primeiros pares de pernas (Figuras 1A e 1B), e isto é possível reunir estas embriãos muito cedo no desenvolvimento sem matar a fêmea ou danificar os embriões (Figura 1C). Os embriões sobreviver em água do mar artificial filtrada através de incubação, pode ser fixado para a expressão do gene ou posterior análise histológica ^7, e uma tabela de preparação detalhada permite a identificação precisa do progresso através do desenvolvimento ^5. Protocolos robustos têm sido utilizados para realizar a análise de expressão gênica por hibridização in situ ^8-15 ou imunomarcação ^4,16,17, knockdown funcional por interferência de RNA ^13,15 ou morpholinos ^12, e germinal estável transgênese ^18. Usando o sistema de transgénese, expressão indutível ¹⁴ e ¹⁹ armadilha potenciador métodos também podem ser utilizados para investigar a função de genes em P. hawaiensis. Enquanto a sequência do genoma disponível publicamente não está disponível atualmente, um transcriptoma contendo transcrições produzido durante a ovogênese e embriogênese tem abelhan de novo reunidos e anotados ^20, e depositado em um banco de dados pesquisável ^21, facilitando a descoberta do gene. Em suma, o P. hawaiensis é um organismo modelo altamente tratável adequado para múltiplas abordagens experimentais e genéticas para a compreensão do desenvolvimento.

Ao contrário das clivagens sinciciais de D. primeiros melanogaster, P. embriões hawaiensis clivar holoblastically após a fertilização (Figura 2A). Linhagem análise rastreio mostrou que a clivagem pela terceira, cada uma das terceira blastómeros de clivagem é especificamente destinada a dar origem a uma das três camadas germinais ou da linha germinal ⁶ (Figura 2B). Estes dados, juntamente com dados de microarranjos ^22, linhagem de células analisa ^6,23, e as experiências de isolamento de blastômeros ⁴ sugeriram que os potenciais de desenvolvimento são segregados para pelo menos alguns terceiros blastômeros de clivagem por herança assimétrica de cell determinantes sorte. Deste modo, em experiências de ablação blastómero na qual o precursor de linha germinal (denominado "g" no Parhyale linhagem celular nomenclatura ⁶⁾ foi removida na fase de oito células, os embriões não tinham células germinais em ^quatro estágios de desenvolvimento posteriores, como indicado pela ausência de células expressando a proteína vasa, que é um marcador de linha germinal na maioria dos metazoários ^24. Em contraste, as experiências de ablação blastômeros somáticas mostrou que P. embriões hawaiensis também possuem capacidades regulatórias significativas, de modo que os destinos de mesoderme ou ectoderma blastômeros precursoras cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes ^25. Como substituição destino celular regulador pode ocorrer, ea extensão da adoção destino celular autônoma por blastômeros somáticas, permanece desconhecida. Técnicas embriológicas experimentais tais como a ablação blastomere pode ser útil em entending a autonomia relativa e nonautonomy de decisões destino de células ^26,27 e são, portanto, de interesse no estudo da P. embriogênese hawaiensis.

Nos experimentos que demonstraram substituição regulador da ectodérmicas e mesodérmicas linhagens, ablação blastomere foi realizada pela injeção de ²⁸ e excitação subseqüente de corantes phototoxic ^25. Embora esta técnica seja eficaz em matar a blastomere injectado (s), que não remover completamente o corpo da célula morta do embrião. Além disso, foram observadas diferenças entre os dados de linhagem de células recolhidas nos estadios gastrulação da embriogênese, injetando blastômeros com traçadores fluorescentes linhagem ^28,29, e os dados recolhidos pelo seguinte blastômeros não perturbados por meio do desenvolvimento das mesmas fases embrionárias ^23. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações.

Nós já publicou os resultados de linhagem celular de embriões analisa em que células individuais foram extirpadas manualmente ^23. No entanto, as operações delicadas necessárias para remover blastómeros individuais a partir de embriões na fase inicial de clivagem ainda não foram totalmente descritos. Aqui apresentamos um protocolo para coleta de P. embriões hawaiensis e ablação manual de um único blastômero de uma fase de embrião de oito células. O objectivo deste método é o de conseguir a remoção completa do corpo de célula do embrião, permitindo a observação dos comportamentos celulares e competências destino celular das células remanescentes durante a embriogénese e desenvolvimento pós-embrionário. Nosso protocolo mostra a remoção do precursor g linha germinal (Figura 2C), mas pode ser aplicado a qualquer célula na fase de oito células, ou para as fases de clivagem de blastómeros anteriores. Em princípio, este protocolo pode ser usado para remover as células individuais de embriões em estágio iniciais de clivagem outrr holoblastically clivagem invertebrados marinhos.

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Protocolo

Comentários que podem ser úteis na execução de certas etapas são indicados em itálico.

1. Dia 1: Preparação de Materiais

1. Prepare os seguintes materiais (ver Tabela de Materiais e Equipamentos):
   • 15 cm e 22 cm de pipetas de Pasteur
   • Escriba Diamante
   • Filtrou água do mar artificial (salinidade entre 0,0018-0,0020) contendo 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de uma solução de estoque de 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina (1:50 de uma solução de estoque contendo 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 mg / ml de estreptomicina)
   • filtrada água do mar artificial (salinidade entre ,0018-0,0020) sem aditivos
   • um recipiente de plástico grande para casais de habitação (pelo menos 15 cm x 15 cm x 5 cm)
   • pequeno (3 cm ou 5 cm), placas de Petri forradas com Sylgard
   • pequena (3 cm ou 5 cm), os pratos de Petri
   • um vidro de relógio ou de vidro multi-bem placa
   • fórceps (usamos uma pinça sem corte derivado from de idade Dumont # 5 fórceps que foram danificados acidentalmente em outros procedimentos laboratoriais, os quais têm reaproveitado utilizando uma pinça de pedra de afiar para garantir que as extremidades das pinças são lisas, que ambos os dentes são do mesmo comprimento, e que eles não têm pontas afiadas. Fórceps extremamente fina, como novas Dumont # 5 fórceps, são indesejáveis, pois podem ferir os embriões e / ou fêmeas).
   • uma pipeta Pasteur com o fim arregalou (veja o passo 1.2 abaixo)
   • uma ferramenta de recuperação de embrião constituído por um fio de tungsténio curvado fino incorporado na extremidade mais fina de uma pipeta de Pasteur (poderia ser substituída por uma alternativa implementar; ver 1.3 abaixo)
   • uma pipeta de boca, com uma pequena abertura (veja o passo 1.4)
   • uma agulha de vidro feito de um capilar de vidro puxado (veja o passo 1.5)
   Não há materiais tóxicos para os seres humanos são utilizados neste protocolo. No entanto, os pesquisadores devem garantir que eles usam luvas ou outras vestimentas de proteção, conforme exigido pelo guidel gestão de riscoines da sua instituição.
2. Para fazer com que a pipeta Pasteur alargado, primeiro pontuação em torno de uma pipeta de Pasteur 15 centímetros no ponto em que a pipeta começa a diminuir com um estilete de diamante, embrulhar a região marcado da pipeta numa toalha de papel Kimwipe ou para proteger os dedos, e, em seguida, cuidadosamente romper a ponta na linha de pontuação. Segure a extremidade quebrada da pipeta sobre a chama do queimador de Bunsen por alguns segundos para suavizar as bordas. A abertura deve ser ligeiramente mais estreito do que a largura máxima da pipeta.
3. Para fazer com que a ferramenta de dissecação de arame de tungsténio, inserir um fio de tungsténio para dentro da extremidade de 15 centímetros uma pipeta de Pasteur de vidro, e mantenha rapidamente ao longo de um queimador de chama de Bunsen para fundir o vidro, a fixação do fio no lugar. Use uma pinça de curva suavemente a extremidade do fio para uma forma de gancho. Ver Figura 3 para um exemplo de uma forma adequada para esta ferramenta.
4. Para fazer uma pequena abertura para a pipeta de boca, puxe a ponta fina de uma pipeta Pasteur 22 centímetros em duas peças over uma chama, e quebrar a ponta da ponta pequena. Inserir a extremidade do suporte da pipeta a boca.
5. Fazer a agulha de vidro que vai ser utilizado para perfurar os blastómeros de interesse durante o processo de ablação com um extractor de agulha. Uma agulha em forma adequada é mostrado na Figura 4. Esta agulha foi retirado em um extrator de agulhas Sutter P97 usando um programa com os parâmetros 2x (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 20, tempo = 250) + 1X (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 100, time = 250). O programa e instrumento específico usado para fazer a agulha pode variar, mas a agulha deve ter uma ponta fina, mas também ser resistente o suficiente para não quebrar quando empurrado contra o córion do embrião.

2. Dia 1: Casais Gathering Parhyale Acasalamento

1. Use a pipeta Pasteur ampliou (passo 1.2 acima) para coletar acasalamento P. casais hawaiensis do grande recipiente de cultura, e transferi-los para um recipiente contendo separado cinclinar-se a água do mar artificial. Não é necessário que esta água do mar ser filtrada. É melhor recolher pares conjugadas no fim da tarde e deixar os casais à temperatura ambiente (20-23 ° C) durante a noite, de modo que, na manhã seguinte, a maioria dos embriões foram recentemente fertilizados e depositado, e, assim, a clivagem inicial fases apropriado para ablação. Reúna pelo menos 20 pares de acasalamento para assegurar que algumas fêmeas estará carregando embriões em estágio inicial de clivagem pela manhã seguinte.

3. Dia 2: Encontro Parhyale Embriões

• Na manhã seguinte, filtrou-infundir água do mar artificial (FASW) com CO _2. Algumas das mulheres terá nadado livre de seus homens durante a noite, recolhendo estas fêmeas separados e anestesiar-los em FASW / CO _2. Os restantes machos desemparelhados podem ser removidos do recipiente par de acoplamento e devolvido para a grande cultura. Pares de acasalamento restante pode ser guardado para coleta de embriões mais tardedurante o dia ou no dia seguinte.
• Transferir uma única fêmea anestesiado transportar embriões para um vidro de relógio em FASW / CO _2. Todas as fêmeas separados, provavelmente, tenham depositado os ovos, que será visível a olho nu, como rosa pálido ou esferóides roxo através das placas coxal transparentes das mulheres (Figura 1A). Para determinar se os embriões estão em estágios iniciais de clivagem e, portanto, apropriado para a ablação de blastômeros, o pesquisador terá que remover os embriões da bolsa ninhada e examiná-las sob um microscópio.
• Visualizando o procedimento sob um microscópio de dissecação, segure as placas da coxa ao longo de um lado do corpo com uma pinça. Os embriões serão visíveis na bolsa ninhada entre essas placas ventral da coxa (Figura 1B).
• Insira a ferramenta de arame fino e curvo (Figura 3; passo 1.3 acima) na extremidade posterior da bolsa ninhada, e levante cuidadosamente o fio no final anterior da bolsa incubadora para separar a ninhadarevestimentos bolsa (estes são modificados apêndices ventrais chamados oostegites ^30), abrindo a bolsa e soltando os embriões. Os embriões que estão dentro da primeira hora ou assim de ser colocado estão todos fechados dentro de uma membrana muito fina e transparente, que será facilmente perturbada pela ferramenta de arame, esta membrana desaparece por cerca de 2-3 horas após a postura de ovos, e os embriões não se limite uns com os outros ou para a fêmea de qualquer forma a partir deste ponto em diante todo embriogênese. Se os investigadores achar inconveniente ou difícil de manobrar a ferramenta de arame curvo para remover os embriões a partir da bolsa de ninhada, uma alternativa pode ser usado implementar, enquanto os movimentos são suaves e sem pressão dura é aplicado ao embrião ou ao marsúpios. Outras ferramentas apropriadas para a remoção de embriões da bolsa ninhada incluem pinças embotados ou um capilar de vidro com uma extremidade selada e suavizada.
• Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para liberar água através da bolsa incubadora abriu, empurrando para fora tele embriões, o qual deve assentar no fundo do vidro de relógio. Transfira a fêmea para limpar FASW (sem CO ₂₎ para permitir a recuperação antes de reintroduzir-la para a cultura principal. Várias fêmeas podem ser colocados no mesmo prato de recuperação, mas permitir que as fêmeas para se recuperar totalmente antes de devolvê-los à cultura principal, como eles podem ser comidos por outros animais, se eles ainda estão parcialmente anestesiado.
• Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para transferir os embriões para uma placa de Petri com FASW limpo e visualizar ao microscópio para determinar o seu estágio embrionário. Embriões separados que estão na terceira clivagem (fase 4 ^5), que são adequados para este procedimento. Deve também ser possível aplicar este protocolo para qualquer fase clivagem antes da formação do disco germe (encena ^07-08 maio).

4. Dia 2: ablação de células individuais

1. Preencha Sylgard-alinhado placa de Petri com uma camada superficial de FASW. Use um inalterado 15 centímetros Pasteur piPette para transferir um único embrião para a placa.
2. Usando fórceps rombas, rolar suavemente o embrião para identificar a célula a ser cauterizado (Figuras 2A e 2B). A linha germinal precursora g pode ser identificada como sendo a menor micrômetros, que fica no topo da menor Mav macromere. Além disso, g não contactar directamente a célula en, que é o micrômetros em frente, como os micrômeros mesoderme precursoras ml e share mr uma borda de célula no meio do embrião. Mr é a blastomere à direita de g, e mL é o micrômetros à esquerda de g. Os macromeres irmã de mr, ml, e en são os precursores ectoderma Er, EL, e Ep respectivamente.
3. Com uma pinça na ABLt lado, se o pesquisador é destro (ou na mão direita se o pesquisador é canhoto), orientar o embrião com a célula de interesse para a direita (ou à esquerda se o pesquisador é canhoto) e agarrar suavemente o embrião entre a pinça para estabilizá-la.
4. Usando uma agulha puxada vidro (passo 1.5 acima, a Figura 4), ​​punção suavemente a célula de interesse. Não inserir a agulha demasiado longe, de modo a não empurrar a agulha para dentro das células vizinhas ou abaixo da célula de interesse. A agulha tem apenas para perfurar o cório e membrana celular subjacente, e não precisa de estender profundamente para dentro da célula a ser cauterizado.
5. Troque a agulha usada para perfurar o embrião para o final de vidro de uma pipeta de boca com um bom puxado ponta da pipeta Pasteur (passo 1.4 acima). Segurar a ponta da pipeta para fechar o orifício criado na célula de interesse, e aplicar o vácuo muito suave.
6. Muito aperte delicadamente o embrião com a pinça. À medida que o conteúdo do blastomero é empurrado para fora do córion através do orifício criado na etapa 4.4, sugá-lo para a pipeta boca para permitir uma visão desobstruída do embrião. Se o orifício for suficientemente grande, o núcleo da célula perfurado pode ser visto a emergir também. Esta é uma boa verificação para certificar-se o conteúdo da célula inteiros foram removidos e não pode ser regenerada.
7. Observar atentamente o embrião como blastômeros de interesse é removido. A borda da célula perfurado vai recuar em direção ao buraco no córion, tornando as intersecções das células subjacentes visíveis. Continuar a aplicar pressão até que todo o blastómero de interesse tenha sido removido. Use uma pinça para a implantação do embrião de lado a lado e confirmar visualmente que todo o blastômeros de interesse é ido.
8. Usando um inalterado 15 centímetros pipetas de Pasteur, transferir o embrião para limpar FASW + (FASW + 1 mg / mL de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina).
9. Levante embriões ablated-blastômeros em poços individuaisde um ambiente limpo placa 48 poços em FASW +, mudando 50% da FASW suplementados com antibiótico + diária. Em nossas mãos embriões sobreviver e se desenvolver bem, mesmo após a ablação, em um intervalo de temperaturas 18-28 º C. Os investigadores devem elevar seus embriões a uma temperatura para a qual eles têm uma superfície limpa (mas não necessariamente estéril) em que para levantar os embriões com o mínimo de perturbação. Para ser capaz de comparar o tempo dos eventos de desenvolvimento em embriões ablated-blastômeros com controles, nos referimos ao leitor a informação encenação de desenvolvimento detalhado, que está disponível para os embriões criados a 18 º C ^4, 25 º C ^4, e 26 º C ^5,6.

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Resultados

Após a ablação bem sucedida de solteiro terceira clivagem P. micrômeros hawaiensis conforme descrito neste protocolo, os micrômeros restantes gradualmente mudar suas posições ligeiramente, de modo a ocupar parcialmente o espaço anteriormente ocupado pelo blastomere ablacionada. Por exemplo, quando g é removida, o vizinho blastômeros mr e ml deslocar um pouco e chegar a compartilhar as bordas das células laterais que estavam anteriormente em ...

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Discussão

Nós descrevemos um protocolo para a ablação manual e remoção física completa de blastômeros individuais de estágios iniciais de clivagem da anfípode P. hawaiensis. Demonstramos uso deste protocolo, removendo a única linha germinal célula precursora g de uma fase de embrião de oito células, e mostrar que a ablação tem sido bem sucedida, confirmando a ausência de células-filhas g 's na embriogênese mais tarde. Este protocolo pode ser usada para remover qualq...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630 VWR	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632 VWR	For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	For creating FASW (See below).
Bunsen burner	VWR	89038-530 VWR	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650 VWR	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000 A-M Systems	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.