Устранение одну клетку от Восемь клеток эмбрионов из амфипод ракообразных<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Резюме

Амфипода Parhyale hawaiensis является перспективным модельным организмом для изучения ракообразных эмбриологии и сравнительной развития членистоногих и эволюции. Этот протокол описывает способ ручного удаления отдельных бластомеров из ранних эмбрионов на стадии дробления из Parhyale.

Аннотация

Амфипода Parhyale hawaiensis небольшой рачок найдено в приливных морских мест обитания по всему миру. За последние десять лет, Parhyale стала перспективный модельный организм для лабораторных исследований развития, обеспечивая полезное сравнение аутгруппе к хорошо изученной членистоногих модельного организма дрозофилы. В отличие от синцитиальных расколов дрозофилы, ранние расколы из Parhyale являются holoblastic. Отображение Судьба использованием индикаторных красителей внедрен в начале бластомеров показали, что все три зародышевых листка и зародышевой линии устанавливаются на стадии восьми клеток. На данном этапе, три бластомеры суждено привести к эктодермы, три суждено привести к мезодермы, а остальные две бластомеры являются предшественниками в энтодермы и зародышевой линии соответственно. Тем не менее, бластомера эксперименты абляции показали, что эмбрионы Parhyale также обладают значительной нормативной capabilitiэс, например, что судьбы бластомеров удалена на стадии восьми клеток может быть передана потомкам некоторые из оставшихся бластомеров. Бластомер абляция была описана ранее одним из двух способов: инъекции и последующей активации фототоксических красителей или ручного удаления. Тем не менее, фотоабляцию убивает бластомеры но не удаляет мертвое тело клеток из эмбриона. Поэтому Полное физическое удаление конкретных бластомеров может быть предпочтительным методом абляции для некоторых приложений. Здесь мы приводим протокол для ручного удаления отдельных бластомеров от стадии восьми клеток эмбрионов Parhyale, иллюстрирующие инструменты и ручные процедуры, необходимые для полного удаления тела клетки, сохраняя при этом оставшиеся бластомеры жив и нетронутыми. Этот протокол может быть применен к любой клетке Parhyale на стадии восьми клеток, или к бластомеров других этапах рано спайности. Кроме того, в принципе этот протокол может быть применимо к ранней CleaВаге этап эмбрионы других holoblastically расщепляющих морских беспозвоночных.

Введение

Амфипода ракообразное Parhyale hawaiensis которая сформировалась в течение последнего десятилетия в качестве перспективного модельного организма с большим потенциалом для использования в эволюционной биологии развития исследований ^1. Среди членистоногих, большинство модельных систем являются насекомые, и наиболее изученным из них является плодовой мухи дрозофилы D.. MELANOGASTER является членом отряда насекомых двукрылых, и как такие дисплеи многих эмбриологических особенностей, которые являются производными по отношению к тем из базально ветвящихся насекомых ^2. Кроме того, насекомые вложены в Подтип Pancrustacea ^3, а это означает, что насекомые имеют своих ближайших родственников в давней «естественной» группы под названием pancrustaceans, и что эта группа парафилетическими. Это говорит о том, что в дополнение к базально ветвления модели насекомых, исследования других ракообразных обязаны получить более широкий взгляд на эволюционной истории черт развитияй молекулярные механизмы, которые были так хорошо изучены в D. MELANOGASTER. Однако, очень немногие ракообразные были хорошо известны для экспериментального лабораторного анализа развития. Амфипода П. hawaiensis является весьма сговорчивым лабораторная модель системы, поддаются диапазоне экспериментальных методик. Амфиподы отображения много уникальных особенностей в их родительской надотряда Peracarida (пляж бункеры, бокоплавы и креветки а), и, следовательно, считается, относительно полученных в рамках этой группы ракообразных. Тем не менее, относительная легкость эмбрионального и функциональной генетической манипуляции, предлагаемых Parhyale сделать это амфипода ценным дополнением к текущей инвентаризации модельных организмов.

В лабораторных животных, P. hawaiensis дает много преимуществ. Животные толерантны в широком диапазоне температур и солености, а также хорошо выживают в больших культур искусственной морской воде ^1. Легко отличить межосевомEEN мужчины и женщины, основанные на четких морфологических различий, в первую очередь, крупных, крючковатый, передних магистральных придатков, что мужчины используют, чтобы понять самок во время спаривания. Для эмбрионального и развития работы, П. hawaiensis имеет несколько очень привлекательных черт. Эмбриогенеза длится примерно 10 дней, а время до половой зрелости примерно через шесть недель на 28 º C (но учтите, что Parhyale хорошо выживает при температуре от примерно 20-30 ° С, и что подробная развития информация постановка доступен для эмбрионов, поднятых на 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, и 26 º C ^5,6). Взрослые спариваться круглый год в лаборатории, так эмбрионы доступны в любое время года. Самки откладывают 2-20 (в зависимости от возраста женщины) оплодотворенных яиц в брюшной выводковой сумке, расположенной между первым нескольких пар ног (1А и 1В), а можно собрать эти эмбрионы очень ранней стадии развития, не убивая самку или повреждения эмбрионов (рис. 1в). Эмбрионы выжить в фильтрованной искусственной морской воде до вылупления, могут быть зафиксированы для последующего экспрессии генов или гистологического анализа ^7, и подробное промежуточная таблица позволяет точно идентифицировать прогресс через развитие ^5. Прочные протоколы были использованы для выполнения анализа экспрессии генов путем в гибридизация ^8-15 или иммунного окрашивания ^4,16,17, функциональный нокдаун РНК-интерференции ^13,15 или ^12, Morpholinos и стабильной зародышевой линии трансгенеза ^18. Использование трансгенеза систему, индуцируемой экспрессии ¹⁴ и энхансерной ловушку ¹⁹ методы также могут быть использованы для изучения функции генов в P. hawaiensis. В то время как в открытом доступе последовательность генома в настоящее время недоступен, транскриптома содержащие стенограммы производится во время оогенеза и эмбриогенеза пчелн заново собран и аннотированный ^20, и хранение в базе данных для поиска ^21, облегчая обнаружение генов. В общем, P. hawaiensis является весьма сговорчивым модель организма подходит для нескольких экспериментальных и генетических подходов к пониманию развития.

В отличие от ранних синцитиальных сколах D. MELANOGASTER, П. эмбрионы hawaiensis расщеплять holoblastically следующие оплодотворение (рис. 2а). Анализ трассировки Lineage показал, что по третьему расщепления, каждый из бластомеров третьей расщепления специально суждено привести к одному из трех зародышевых листков или зародышевой линии ⁶ (фиг. 2В). Эти данные вместе с микрочипов данных ^22, клеточной линии анализирует ^6,23 и изоляции бластомеров эксперименты ⁴ предположили, что потенциалы развития сегрегированны по меньшей мере некоторым третьим бластомеров расщеплению асимметричного наследования челл судьба детерминанты. Соответственно, в бластомеров абляции экспериментов, в которых зародышевой линии предшественник (называется "г" в Parhyale клеточных клонов номенклатуре ⁶⁾ удаляли на этапе восемь клеток, эмбрионы не было половых клеток на более поздних стадиях развития ^4, как показано отсутствие клеток выражая белка Vasa, который является маркером зародышевой линии в большинстве многоклеточных ^24. В противоположность этому, соматические бластомера эксперименты абляции показал, что П. эмбрионы hawaiensis также обладают значительными нормативные возможности, такие, что судьбы мезодермы или эктодермы бластомеров предшественников удалена на стадии восьми клеток может быть передана потомкам некоторые из оставшихся бластомеров ^25. Как регулятивный замена судьба клетки может произойти, и степень автономного принятия клеточных судеб соматическими бластомеров, остается неизвестным. Экспериментальные эмбриологические методы, такие как бластомеров абляции может быть полезно в understanдинь относительная автономия и nonautonomy из клеточных судеб решений ^26,27 и поэтому интерес к изучению P. hawaiensis эмбриогенеза.

В экспериментах, которые продемонстрировали регулятивный замену эктодермальных и мезодермальных линий, бластомер абляция была выполнена в виде инъекций ²⁸ и последующего возбуждения фототоксических красителей ^25. Хотя этот метод является эффективным средством уничтожения введенного бластомера (ы), он не полностью удалить труп клеток из эмбриона. Кроме того, различия наблюдались между данными клеточной линии, собранных до гаструляции стадиях эмбриогенеза путем введения бластомеров с люминесцентными клона индикаторов ^28,29 и данных, собранных следуя невозмущенные бластомеры через развитие тех же эмбриональных стадиях ^23. Поэтому Полное физическое удаление конкретных бластомеров может быть предпочтительным методом абляции для некоторых приложений.

Мы ранее были опубликованы результаты клеточной линии анализирует эмбрионов, в которых отдельные клетки вручную удалена ^23. Тем не менее, тонкие операции, необходимые для удаления отдельных бластомеров от ранней стадии эмбрионов расщепления до сих пор не полностью описаны. Здесь мы приводим протокол для сбора P. эмбрионы hawaiensis и руководство абляция одной бластомера от стадии эмбриона восьми клеток. Цель этого метода состоит в достижении полного удаления тела клетки от эмбриона, что позволяет наблюдать сотовых поведения и клеточных судеб компетенции остальных клеток во время эмбриогенеза и постэмбрионального развития. Наш протокол показывает удаление зародышевой линии предшественника г (рис. 2в), но могут быть применены к любой клетке на стадии восьми клеток, или к бластомеры ранних стадиях дробления. В принципе, этот протокол может применяться для удаления отдельных клеток из ранних эмбрионов на стадии дробления на флористикуг holoblastically расщепления морских беспозвоночных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Комментарии, которые могут быть полезными при выполнении определенные шаги выделены курсивом.

1. День 1: Получение материалов

1. Подготовьте следующие материалы (см. таблицу материалов и оборудования):
   • 15 см и 22 см Пипетки Пастера
   • Алмазный писец
   • фильтруют искусственной морской воде (соленость между 0.0018-0.0020), содержащий 1 мг / мл амфотерицина В (1:100 из 100 мг / мл маточного раствора), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (1:50 исходного раствора содержащий 5000 единиц / мл пенициллина и 5000 мг / мл стрептомицина)
   • фильтруют искусственный морской воды (соленость между 0.0018-0.0020) без добавок
   • большой пластиковый контейнер для жилищных пары (не менее 15 см х 15 см х 5 см)
   • маленькие (3 см или 5 см) чашки Петри выложены Sylgard
   • маленькие (3 см или 5 см) чашки Петри
   • часовое стекло или стекло мульти-луночный планшет
   • щипцы (мы используем тупые щипцы получены сюдам старый Дюмон # 5 щипцы, которые были случайно повреждены в других лабораторных процедур, которые мы многократно использовать с помощью щипцов точильный камень для того, чтобы концы щипцами гладкие, что оба зубья имеют одинаковую длину, и что они больше не имеют острые моменты. Чрезвычайно тонкий пинцет, такие как новые Дюмон # 5 щипцами, нежелательны, поскольку они могут повредить эмбрионов и / или женщины.)
   • пипетки Пастера с конца расширились (см. шаг 1.2 ниже)
   • эмбрион инструмент поиска, состоящий из тонкой проволоки, изогнутой вольфрама, введенного в тонком конце пипетки Пастера (можно заменить альтернативы реализации, см. ниже 1,3)
   • рот пипеткой с небольшим отверстием (см. шаг 1.4 ниже)
   • стакан игла сделана из вытащил стеклянный капилляр (см. шаг 1.5 ниже)
   Ни один из материалов токсичные для человека не используются в данном протоколе. Тем не менее, исследователи должны гарантировать, что они носить перчатки или другую защитную одежду в соответствии с требованиями Guidel управления рискамиИнес их учреждения.
2. Чтобы расширенной пипетки Пастера, первый счет примерно в 15 см пипетки Пастера в точке, где начинается пипетки, чтобы сузить с алмазным надрезе, обернуть набрал область пипетки в Kimwipe или бумажным полотенцем, чтобы защитить пальцы, а затем тщательно прекращаться чаевые в счет линии. Держите сломанный конец пипетки над пламенем горелки Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы сгладить края. Открытие должна быть немного уже, чем максимальная ширина пипетки.
3. Чтобы проволочную инструмент рассекает вольфрама, вставить вольфрамовой проволоки в конце 15 см стекло пипетки Пастера и кратко держать над пламенем горелки Бунзена, чтобы расплавить стекло, фиксации провода на месте. Используйте пинцет, чтобы аккуратно кривая конец провода в крючковатым форме. См. Рисунок 3 для примера соответствующего форме для этого инструмента.
4. Чтобы сделать небольшое отверстие для рта пипетки, потяните тонкий конец 22 см пипетки Пастера на две части О.В.э пламя, и разорвать кончик маленьком конце. Вставка в конце держателя пипетки рта.
5. Сделать стеклянную иглу, которая будет использоваться для прокола бластомеров интересов во время процедуры абляции с помощью иглы съемник. Соответствующей формы игла показано на рисунке 4. Эта игла была разобрана на Саттер P97 иглы съемник с помощью программы с параметрами 2x (тепло = 566, потяните = 100, скорость = 20, время = 250) + 1X (тепло = 566, потяните = 100, скорость = 100, время = 250). Конкретная программа и инструмент, используемый, чтобы сделать иглу может варьироваться, но игла должны быть тонкий момент, но также может быть достаточно крепким, чтобы не сломать, когда толкнул хориона зародыша.

2. День 1: сбор Parhyale Спаривание Пары

1. Используйте расширенную пипетки Пастера (шаг 1.2 выше), чтобы собрать спаривания P. hawaiensis пары от большого культуры контейнере, и передавать их на отдельном контейнере, содержащий сопираться искусственный морской воды. Это не обязательно, что эта морская вода фильтруется. Лучше всего собирать спаривания пар в поздним днем ​​и оставить пары при комнатной температуре (20-23 º C) в течение ночи, таким образом, чтобы на следующее утро, большинство эмбрионов будет были недавно оплодотворенная и хранение, и, таким образом на ранней стадии расщепления подходит для абляции. Соберите по крайней мере 20 спаривания пар для того, чтобы некоторые женщины будут нести ранней стадии эмбрионы расщепления к следующему утру.

3. День 2: Сбор Parhyale Эмбрионы

• На следующее утро, настоять отфильтрованный искусственный морской воды (FASW) с CO _2. Некоторые из женщин будет плавал свободный от своих мужчин в течение ночи; собирать эти разделенные самок и обезболить их в FASW / CO _2. Остальные непарные самцы могут быть удалены из спаривания пары контейнера и возвращается в большой культуры. Остальные пары спаривания могут быть сохранены для получения эмбрионов спустяв тот же день или на следующий день.
• Переместить единичный анестезированы женщина, перевозящих эмбрионов часовым стеклом в FASW / CO _2. Все самки, разделенных скорее всего сдали на хранение яйца, которые будут видны невооруженным глазом в виде бледно-розовый или фиолетовый сфероидов через прозрачные коксальных пластинок самок (рис. 1А). Чтобы определить, эмбрионы на ранних стадиях дробления и таким образом подходит для бластомеров абляции, исследователь придется удалить эмбрионов от выводковой сумке и изучить их под микроскопом.
• Просмотр процедуру при вскрытии микроскопом, понять коксальные пластины, а одной стороне тела щипцами. Эмбрионы будет виден в вентральной выводковой сумке между этими коксальных пластинок (рис. 1б).
• Вставьте тонкий, изогнутый провод инструмента (фиг.3; шаг 1,3 см. выше) в заднем конце выводковой сумке, и осторожно поднимите провод к переднему концу выводковой камеры, чтобы отделить выводоксумка покрытия (они изменяются брюшной придатков называемые оостегитами ^30), открывая сумку и ослабив эмбрионов. Эмбрионы, которые в течение первого часа или около того, чтобы быть заложены все заключены в очень тонкой, прозрачной мембраны, которая будет легко нарушается инструментом проволоки; эта мембрана исчезает примерно на 2-3 часа после откладки яиц, и эмбрионы не связаны друг к другу или к самке в любом случае, с этой точки и далее во всем эмбриогенеза. Если исследователи находят его неудобным или трудно маневрировать изогнутый инструмент проволоки, чтобы удалить эмбрионов от выводковой сумке, альтернатива реализации могут быть использованы, пока движения нежны и никаких жестких давление не применяется к эмбрионов или выводковой сумке. Другие инструменты, подходящие для удаления эмбрионов от выводковой сумке включают притупилось щипцов или стеклянного капилляра с герметичной и сглаженной конца.
• Используйте неизмененный 15 см пипетки Пастера, чтобы смыть воду через открытый выводковой сумке, выталкивая тон эмбрионов, которые должны располагаться в нижней части часовым стеклом. Трансфер самку к чистой FASW (без СО _2), чтобы позволить восстановлению до повторного ее основной культуры. Несколько самок могут быть размещены в том же самом блюде восстановления, но позволяют самки полностью восстановить перед их возвращением в основной культуры, поскольку они могут быть съеден с помощью других животных, если они все еще частично под наркозом.
• Использование неизмененный 15 см пипетки Пастера перенести эмбрионы в чашку Петри с чистой FASW и просматривать под микроскопом, чтобы определить их эмбриональной стадии. Отдельные эмбрионы, которые на третьем расщепления (стадия 4 ^5), которые подходят для этой процедуры. Она также должна быть возможность применять этот протокол для любой стадии расщепления до формирования зародышей диска (стадии 7-8 ^5).

4. День 2: абляции отдельных клеток

1. Заполните Sylgard-выстроились чашки Петри с тонким слоем FASW. Используйте неизмененный 15 см Пастера пиPette для передачи одного эмбриона к пластине.
2. Использование тупых щипцы, осторожно сверните эмбрион, чтобы определить ячейку быть удалена (фиг.2А и 2В). Зародышевой линии предшественника г могут быть определены как самый маленький микромеров, который сидит на вершине маленького macromere Mav. Кроме того, г не напрямую связаться ячейку ан, который является микромеров прямо через дорогу от него, как микромеров мезодерма предшественники мл и г-н акцию клетка границы в середине зародыша. Господин является бластомер справа от г, и мл является микромеров слева от г. Сестра макромеров г, мл, и еп эктодермы предшественники Er, Эл, и Ep соответственно.
3. С щипцов в ЛЕФт рука, если исследователь правша (или в правой руке, если исследователь левша), ориентироваться эмбрион с клеткой, представляющей интерес для правой (или влево, если исследователь левша), и мягко понять эмбрион между щипцами, чтобы стабилизировать его.
4. Использование вытащил стеклянную иглу (шаг 1.5 выше, рисунок 4), мягко проколоть ячейку интересов. Не вставляйте иглу слишком далеко, чтобы не толкать иглу в клетки соседних или ниже ячейки интерес. Игла имеет только проколоть хориона и основной клеточной мембраны, и не нужно продлить глубоко в клетки, которые будут абляции.
5. Обменять игла используется для прокола зародыш для стеклянной конце рот пипеткой со штрафом вытащил пипетки Пастера (шаг 1.4 выше). Держите кончик пипетки близко к дыре, созданной в ячейке интерес, и применять очень нежный всасывание.
6. Очень аккуратно сожмите эмбрион с пинцетом. Как содержанию blastoпросто выталкивается из хориона через отверстие, созданный на шаге 4.4, сосать его в рот пипеткой, чтобы позволить свободный вид эмбриона. Если отверстие достаточно большой, ядро ​​проколотой клетки можно рассматривать появляться также. Это хорошая проверка, чтобы убедиться, все содержимое ячейки были удалены и не могут быть восстановлены.
7. Тщательно соблюдайте эмбрион как бластомер интерес удаляется. Граница проколотой клетки отступит к отверстию в хориона, делая пересечения основных клеток видимых. Продолжить оказывать давление, пока все бластомера интереса не была удалена. Используйте пинцет, чтобы бросить эмбрион из стороны в сторону и визуально подтвердить, что все бластомера интереса нет.
8. Использование неизмененный 15 см пипетки Пастера, передача эмбриона очистить FASW + (FASW + 1 мг / мл амфотерицина В, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина).
9. Поднимите бластомера-абляции эмбрионов в отдельных скважинахиз чистого 48-луночный планшет в FASW +, изменив 50% антибиотик дополнена FASW + ежедневно. В наших руках эмбрионы выжить и развиваться хорошо, даже следующий абляции, в диапазоне температур от 18-28 º C. Исследователи должны поднять эмбрионов при температуре, для которых они имеют чистую (но не обязательно стерильную) поверхность, на которой поднять эмбрионов с минимальным нарушением. Для того, чтобы сравнить время событий развития в бластомера-абляции эмбрионов с элементами управления, мы отсылаем читателя к подробному развития информации промежуточной, которая доступна для эмбрионов, поднятых на 18 º C ^4, 25 º C ^4, и 26 º C ^5,6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После успешной абляции один третий расщепления P. hawaiensis микромеры как описано в данном протоколе, остальные микромеры постепенно перенести свои позиции немного для того, чтобы частично занимают пространство ранее занимаемую абляцированную бластомера. Например, когда г ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы опишем протокол для ручного абляции и полного физического удаления отдельных бластомеров из ранних стадиях расщепление амфипод P. hawaiensis. Мы демонстрируем использование этого протокола путем удаления одного зародышевой линии клеток предшественник г от стадии эмбрион...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630 VWR	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632 VWR	For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	For creating FASW (See below).
Bunsen burner	VWR	89038-530 VWR	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650 VWR	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000 A-M Systems	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.