Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Riepilogo

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Abstract

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall'embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.

Introduzione

Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l'uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca ^1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell'ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione ^2. Inoltre, gli insetti sono annidati all'interno del subphylum Pancrustacea ^3, il che significa che gli insetti hanno i loro parenti più stretti all'interno del gruppo di lunga data "naturale" chiamato pancrustaceans, e che questo gruppo è parafiletico. Ciò suggerisce che oltre alla ramificazione basally modelli insetti, studi di altri crostacei sono necessari per ottenere una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti di sviluppo unmeccanismi molecolari nd che sono stati così ben studiate in D. melanogaster. Tuttavia, poche crostacei sono stati ben stabiliti per analisi di laboratorio sperimentale di sviluppo. Il anfipode P. hawaiensis è altamente trattabile sistema modello di laboratorio, suscettibili di una serie di tecniche sperimentali. Anfipodi mostrano molte caratteristiche uniche nel loro superorder genitori Peracarida (tramogge spiaggia, scudi, e gamberetti così), e sono quindi pensati per essere relativamente derivato all'interno di questo gruppo di crostacei. Tuttavia, la relativa facilità di manipolazione genetica embrionale e funzionale offerto da Parhyale rendono questo anfipode una preziosa aggiunta alla corrente inventario di organismi modello.

Come un animale da laboratorio, P. hawaiensis offre molti vantaggi. Gli animali sono tolleranti ad una vasta gamma di temperature e salinità, e sopravvivono bene in grandi culture di acqua di mare artificiale ^1. E 'facile distinguere between maschi e femmine sulla base di differenze morfologiche evidenti, più in particolare, i grandi, uncinate, appendici tronco anteriori che i maschi usano per afferrare le femmine durante l'accoppiamento. Per il lavoro embrionale e dello sviluppo, P. hawaiensis ha diverse caratteristiche molto interessanti. Embriogenesi dura circa 10 giorni e il tempo per la maturità sessuale è di circa sei settimane a 28 ° C (ma si noti che Parhyale sopravvive bene a temperature che variano da circa il 20-30 º C, e che informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C ⁴ , 25 ° C ^4, e 26 ° C ^5,6). Adulti si accoppiano tutto l'anno in laboratorio, in modo da embrioni sono disponibili in qualsiasi periodo dell'anno. Le femmine depongono 2-20 (a seconda dell'età delle donne) uova fecondate in un sacchetto covata ventrale che si trova tra le prime paia di zampe (Figure 1A e 1B), ed è possibile raccogliere questi embrionis molto presto nello sviluppo senza uccidere la femmina o danneggiare gli embrioni (Figura 1C). Gli embrioni sopravvivono in acqua di mare artificiale filtrata fino alla schiusa, possono essere fissati per l'espressione genica o successiva analisi istologica ^7, e una tabella dettagliata di gestione temporanea permette l'identificazione precisa dei progressi attraverso lo sviluppo ^5. Protocolli robusti sono stati utilizzati per effettuare analisi di espressione genica mediante ibridazione in situ ^8-15 o immunoistochimica ^4,16,17, knockdown funzionale mediante RNA interference ^13,15 o Morpholinos ^12, e la linea germinale stabile transgenesi ^18. Utilizzando il sistema di transgenesi, espressione inducibile ¹⁴ e trappola enhancer ¹⁹ metodi possono anche essere usati per studiare la funzione del gene in P. hawaiensis. Mentre una sequenza del genoma a disposizione del pubblico non è al momento disponibile, un trascrittoma contenente le trascrizioni prodotta durante oogenesi e embriogenesi ha apen de novo assemblati e annotati ^20, e depositati in un database consultabile ^21, facilitando la scoperta del gene. In sintesi, P. hawaiensis è un organismo modello molto maneggevole adatto per molteplici approcci sperimentali e genetici per comprendere lo sviluppo.

A differenza delle prime fratture sinciziale di D. melanogaster, P. embrioni hawaiensis fendere holoblastically segue fecondazione (Figura 2A). Lineage tracing analisi ha mostrato che dal terzo clivaggio, ciascuno dei terzi blastomeri scissione è specificamente destinata a dare origine ad uno dei tre strati germinali o la linea germinale ⁶ (Figura 2B). Questi dati, insieme ai dati di microarray ^22, linea cellulare analisi ^6,23, e gli esperimenti di isolamento blastomere ⁴ hanno suggerito che le potenzialità di sviluppo sono separate da almeno alcuni terzi blastomeri scissione di eredità asimmetrica del cell determinanti destino. Pertanto, in esperimenti blastomere ablazione in cui il precursore linea germinale (chiamato "g" nella linea cellulare nomenclatura Parhyale ⁶⁾ è stato rimosso nella fase otto cellule, embrioni mancavano cellule germinali in successivi stadi di sviluppo ^4, come indicato dall'assenza di cellule esprimendo la proteina Vasa, che è un marker germinale nella maggior metazoi ^24. Al contrario, somatiche esperimenti ablazione blastomeri hanno mostrato che P. embrioni hawaiensis possiedono anche notevoli capacità di regolamentazione, in modo tale che le sorti del mesoderma o ectoderma blastomeri precursori ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti ²⁵ blastomeri. Come regolativo sostituzione destino delle cellule può verificarsi, e il grado di autonomia adozione destino delle cellule somatiche da blastomeri, rimane sconosciuto. Sperimentali tecniche embriologiche come blastomere ablazione può essere utile a comprending l'autonomia relativa e nonautonomy delle decisioni destino delle cellule ^26,27 e sono quindi di interesse per lo studio di P. hawaiensis embriogenesi.

Negli esperimenti che hanno dimostrato la sostituzione regolatore del ectodermici e mesodermici lignaggi, ablazione blastomeri è stata eseguita mediante iniezione ²⁸ e la successiva eccitazione coloranti fototossiche ^25. Mentre questa tecnica è efficace a uccidere il blastomeri (s) iniettato, non rimuove completamente il corpo cellula morta dall'embrione. Inoltre, sono state osservate differenze tra i dati raccolti attraverso il lignaggio delle cellule agli stadi gastrulazione dell'embriogenesi iniettando blastomeri con traccianti fluorescenti lignaggio ^28,29, ei dati raccolti seguendo blastomeri imperturbati attraverso lo sviluppo degli stessi stadi embrionali ^23. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni.

Abbiamo già pubblicato i risultati della linea cellulare analisi degli embrioni in cui singole cellule sono state asportato manualmente ^23. Tuttavia, le delicate operazioni necessarie per rimuovere i singoli blastomeri dai primi scissione embrioni fase non sono ancora state pienamente descritte. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di P. embrioni hawaiensis e ablazione manuale di un singolo blastomero da un embrione di otto cellule. L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere la rimozione completa del corpo cellulare dall'embrione, che permette l'osservazione dei comportamenti cellulari e competenze destino cellulare delle restanti cellule durante l'embriogenesi e sviluppo post-embrionale. Il nostro protocollo mostra rimozione del precursore g germinale (Figura 2C), ma può essere applicato a qualsiasi cella nella fase di otto cellule, o di blastomeri di scissione fasi precedenti. In linea di principio, questo protocollo potrebbe essere applicato a rimuovere le singole cellule da embrioni precoci fase scissione di Other holoblastically cleaving invertebrati marini.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo.

1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali

1. Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature):
   • 15 cm e 22 cm pipette Pasteur
   • Diamante scriba
   • acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (1:50 di una soluzione madre contenente 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina)
   • filtrata acqua di mare artificiale (salinità tra 0,0018-0,0020) senza additivi
   • un grande contenitore di plastica per le coppie abitative (di almeno 15 cm x 15 cm x 5 cm)
   • di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre Petri rivestite con Sylgard
   • di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre di Petri
   • un vetro d'orologio o lastra di vetro multi-bene
   • Pinza (usiamo una pinza smussato derivati ​​from vecchio Dumont # 5 pinze accidentalmente danneggiati in altre procedure di laboratorio, che abbiamo riproposto utilizzando una pinza pietra per affilare ad assicurare che le estremità della pinza sono lisce, che entrambi i denti sono della stessa lunghezza, e che non hanno più punti taglienti. Pinza estremamente sottili, come i nuovi Dumont # 5 pinze, sono indesiderabili in quanto possono danneggiare gli embrioni e / o femmine).
   • una pipetta Pasteur con l'estremità allargata (vedi punto 1.2)
   • uno strumento di recupero embrione costituito da un sottile filo di tungsteno curvo incorporato nella estremità sottile di una pipetta Pasteur (potrebbe essere sostituito da un'alternativa attuare; vedere 1.3)
   • una pipetta bocca con una piccola apertura (vedi punto 1.4)
   • un ago di vetro fatto da un capillare di vetro tirato (vedi punto 1.5 che segue)
   Non ci sono materiali tossici per gli esseri umani sono utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero assicurare che indossano guanti o altri indumenti protettivi, come richiesto dal guidel gestione del rischioines della loro istituzione.
2. Per rendere la pipetta Pasteur allargato, primo punteggio intorno una pipetta Pasteur 15 centimetri nel punto in cui la pipetta comincia a ridursi con un scribe diamante, avvolgere la regione segnato della pipetta in un asciugamano Kimwipe o carta per proteggere le dita, e poi accuratamente rompere la punta alla linea di frattura. Tenere l'estremità rotto della pipetta su una fiamma del bruciatore Bunsen per alcuni secondi per smussare i bordi. L'apertura dovrebbe essere leggermente più stretta della larghezza massima della pipetta.
3. Per rendere lo strumento di dissezione filo di tungsteno, inserire un filo di tungsteno nell'estremità di un 15 centimetri pipetta Pasteur di vetro, premuto brevemente su un becco Bunsen per fondere il vetro, che fissa il filo in posizione. Usare pinze per curva dolcemente alla fine del filo a forma di uncino. Vedi Figura 3 per un esempio di una forma appropriata per questo strumento.
4. Per fare una piccola apertura per la pipetta bocca, tirare l'estremità sottile di un 22 centimetri pipetta Pasteur in due parti over una fiamma, e rompere la punta del piede di biella. Inserire nell'estremità del titolare pipetta bocca.
5. Effettuare l'ago di vetro che verrà utilizzato per perforare i blastomeri di interesse durante la procedura di ablazione mediante estrattore ago. Un ago opportunamente sagomato è mostrato in Figura 4. Questo ago è stato tirato su un estrattore Sutter P97 ago utilizzando un programma con i parametri 2x (calore = 566, tirare = 100, velocità = 20 time = 250) + 1X (calore = 566, tirare = 100, velocità = 100, tempo = 250). Il programma e specifico strumento usato per fare l'ago può variare, ma l'ago deve avere un punto di fine, ma anche essere abbastanza robusto da non rompersi quando spinto contro il corion dell'embrione.

2. 1 ° giorno: Coppie Gathering Parhyale affini

1. Utilizzare la pipetta Pasteur ampliato (fase 1.2 di cui sopra) per raccogliere accoppiamento P. coppie hawaiensis dal grande contenitore di coltura, e trasferirli in un contenitore contenente separato cmagra acqua di mare artificiale. Non è necessario che questa acqua di mare filtrata. E 'meglio raccogliere le coppie di accoppiamento nel tardo pomeriggio e lasciare le coppie a temperatura ambiente (20-23 ° C) durante la notte, in modo che la mattina dopo, la maggior parte degli embrioni sono stati recentemente fecondato e depositato, e quindi a presto scissione fasi adatto per ablazione. Raccogliere almeno 20 coppie di accoppiamento per garantire che alcune femmine saranno portando primi scissione embrioni stadio la mattina seguente.

3. 2 ° giorno: Raduno Parhyale embrioni

• La mattina successiva, infondere acqua di mare artificiale filtrata (FASW) con CO _2. Alcune delle femmine avranno nuotato liberi dai loro maschi durante la notte; raccogliere queste femmine separati e anestetizzare in FASW / CO _2. I restanti maschi spaiati possono essere rimossi dal contenitore coppia di accoppiamento e restituito al grande cultura. Coppie di accoppiamento rimanenti possono essere salvati per la raccolta di embrioni tardinel corso della giornata o il giorno successivo.
• Trasferire una singola femmina anestetizzato portando embrioni per un vetro da orologio in FASW / CO _2. Tutte le femmine separate probabilmente hanno depositato le uova, che sarà visibile ad occhio il rosa pallido o sferoidi viola attraverso le piastre coxal trasparenti delle femmine (Figura 1A). Per determinare se gli embrioni sono nelle fasi iniziali scissione e quindi adatto per blastomeri ablazione, il ricercatore dovrà rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata ed esaminarli al microscopio.
• Visualizzazione della procedura sotto un microscopio da dissezione, afferrare i piatti coxal lungo un lato del corpo con una pinza. Gli embrioni saranno visibili nel sacchetto covata ventrale tra questi piatti coxal (Figura 1B).
• Inserire il sottile, strumento filo curvo (figura 3; precedente punto 1.3) nell'estremità posteriore del sacchetto covata, e sollevare delicatamente il filo verso l'estremità anteriore del sacchetto covata per separare la covatarivestimenti sacchetto (questi sono modificati appendici ventrali chiamati oostegites ^30), aprendo il sacchetto ed allentando gli embrioni. Gli embrioni che si trovano entro la prima ora o così di essere licenziati sono tutti racchiusi all'interno di una sottile membrana trasparente che sarà facilmente interrotto dallo strumento a filo; questa membrana scompare di circa 2-3 ore dopo la deposizione delle uova e gli embrioni non sono vincolati tra loro o alla femmina in alcun modo da questo punto in poi tutta l'embriogenesi. Se i ricercatori trovano scomodo o difficile da manovrare l'utensile filo curvo per rimuovere embrioni dal sacchetto covata, un'alternativa implementare può essere utilizzato, purché i movimenti sono delicati e nessuna pressione duro viene applicato al embrioni o il sacchetto covata. Altri strumenti adeguati per rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata includono pinze smussate o un capillare di vetro con un'estremità sigillata e levigato.
• Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per svuotare l'acqua attraverso il sacchetto covata aperta, spingendo fuori tegli embrioni, che dovrebbe depositarsi sul fondo del vetro da orologio. Trasferire la femmina per pulire FASW (senza CO ₂₎ per permettere il recupero prima di reintrodurre lei alla cultura principale. Più femmine possono essere collocati nello stesso piatto di recupero, ma le femmine permettono di recuperare completamente prima di restituirli alla cultura principale, in quanto possono essere mangiati da altri animali se sono ancora parzialmente anestetizzati.
• Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con FASW pulito, e visualizzare al microscopio per determinare la loro fase embrionale. Embrioni distinti che sono alla terza fenditura (fase 4 ^5), che sono adatti per questa procedura. Dovrebbe inoltre essere possibile applicare questo protocollo per ogni fase scissione prima della formazione del disco di germi (stadi ^7-8 MAGGIO).

4. 2 ° giorno: ablazione di singole cellule

1. Riempire piastra di Petri Sylgard alberato con uno strato di FASW superficiale. Utilizzare un inalterata 15 centimetri Pasteur pipipetta per trasferire un singolo embrione alla piastra.
2. Utilizzando pinze smussato, inclinarsi leggermente l'embrione per identificare la cella da asportare (Figure 2A e 2B). La linea germinale precursore g può essere identificato come il micromere più piccolo, che si trova sulla cima della più piccola Mav macromere. Inoltre, g non contattare direttamente la cellula en, che è il micromere direttamente di fronte, come le ml micromeri mesoderma precursori e la quota di mr margine di una cella nel centro dell'embrione. Mr è il blastomere a destra di g, e ml è il micromere a fianco di g. Le macromeres sorella di mr, ml, e en sono i precursori ectoderma Er, El, e Ep, rispettivamente.
3. Con una pinza in left mano se il ricercatore è di mano destra (o la mano destra se il ricercatore è mancino), orientare l'embrione con la cella di interesse a destra (oa sinistra se il ricercatore è mancino), e afferrare delicatamente l'embrione tra le pinze per stabilizzarlo.
4. Utilizzando un ago tirato vetro (passo 1.5 sopra; la figura 4), ​​forare delicatamente la cella di interesse. Non inserire l'ago troppo, in modo da non spingere l'ago nelle celle vicine o sotto la cella di interesse. L'ago ha solo per forare la membrana cellulare e corion sottostante, e non deve estendersi profondamente nella cella da asportare.
5. Sostituire l'ago utilizzato per forare l'embrione per la fine del vetro di una pipetta bocca con una bella tirata Pasteur puntale (precedente punto 1.4). Tenere la punta della pipetta vicino al foro creato nella cella di interesse, e applicare molto delicata aspirazione.
6. Molto premere delicatamente l'embrione con le pinze. Dato che il contenuto del blastomera viene spinto fuori dal corion attraverso il foro creato nel passaggio 4.4, succhiare in pipetta bocca per consentire una visuale libera dell'embrione. Se il foro è abbastanza grande, il nucleo della cellula perforato può essere visto emergere pure. Questo è un buon controllo per assicurarsi che tutto il contenuto della cella sono state rimosse e non possono essere rigenerata.
7. Osservare attentamente l'embrione come blastomere di interesse viene rimosso. Il bordo della cella forato retrocederà verso il foro del corion, rendendo l'intersezione delle celle sottostanti visibili. Continuare ad applicare la pressione fino a quando tutti blastomero di interesse è stato rimosso. Utilizzare pinze a rotolare l'embrione da un lato all'altro e confermare visivamente che tutto il blastomero di interesse è andato.
8. Utilizzando un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur, trasferire l'embrione pulire FASW + (FASW + 1 mg / ml di amfotericina B, 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina).
9. Sollevare embrioni blastomeri-ablazione a singoli pozzidi una piastra a 48 pozzetti pulita in FASW +, cambiando il 50% di antibiotico-FASW integrato + giornaliero. Nelle nostre mani embrioni sopravvivere e svilupparsi bene, anche a seguito di ablazione, in una gamma di temperature di 18-28 ° C. I ricercatori dovrebbero aumentare i loro embrioni a una temperatura per la quale hanno una superficie pulita (ma non necessariamente sterile) sul quale generare gli embrioni con il minimo disturbo. Per poter confrontare i tempi degli eventi di sviluppo in embrioni blastomeri-ablazione con controlli, rimandiamo il lettore alle informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo che è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C ^4, 25 º C ^4, e 26 º C ^5,6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Descriviamo un protocollo per l'ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l'uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l'ablazione ha avuto successo, confermando l'assenza di s 'g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630 VWR	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632 VWR	For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	For creating FASW (See below).
Bunsen burner	VWR	89038-530 VWR	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650 VWR	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000 A-M Systems	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.