アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

要約

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

要約

球様細胞白質萎縮症（GLD）の中枢神経系においてユニークに豊富に存在する球様細胞と呼ばれる多核ミクログリアの正確な機能は、不明である。知識のこのギャップは、研究のためのin vitroモデルで適切なの欠如によって妨げられてきた。ここで、私たちは初代マウスグリア培養系を記述するGLDで見られる特徴的な球様細胞に似たミクログリアの多核化におけるサイコシン結果による治療中。この新規なシステムを用いて、グロボイド細胞の研究のための条件および分析のモードを定義した。このモデル系の使用の可能性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のための潜在的な役割を同定し、当社の以前の研究で検証された-3 GLDに。 インビトロ系でのこの小説はこれらのユニークな細胞の形成と機能だけでなく、潜在的な治療操作を、研究するのに有用なモデルかもしれません。

概要

また、クラッベ病として知られている球様細胞白質萎縮症（GLD）は、galatocerebrosidase（GALC）遺伝子¹における機能変異の喪失に起因する致命的な脱髄性疾患である。 GLDの最も一般的な形態は、幼児期に発症に代表される、多くの場合、年齢^2,3、5年前にモーターと早死につながる認知機能低下の積極的な臨床経過することを特徴とする乳児変種です。遺伝子検査は、GLD ⁴の診断を確認するために使用される。 GLDの神経病理は、球様細胞^5-7と呼ばれる広範な脱髄、神経細胞の萎縮、アストログリオーシスおよび充血多核ミクログリアの存在が明らかになる。これらの目立つ細胞の特定の機能は、とらえどころのない推移しているものの、多くの場合、それらの細胞質内に管のある介在物を含む球様細胞の同定は、過去97年間のGLDの決定的な特徴となっている。

非myelの関与GLDの病因におけるinatingグリア（ミクログリアおよびアストロサイト）は、長いこの病気⁸における深遠な脱髄に二次応答と考えられてきた。興味深いことに、1916年⁵クヌードクラッベによるこの病気の最初の説明は、「球様細胞」と命名し、この病気の決定的な特徴であるされた脂質の破片を含む多核食細胞の形成を報告した。

GLDでの役割は長い間無視....

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プロトコル

動物に関わるすべての手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する方針に従って行った実験動物福祉（NIH）の事務所が定めるだけの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）から承認を得てコネチカット保健センター。

混合グリア培養物の調製

1. 使用前にすべての楽器を滅菌する。冷たい保つために氷の上で維持さ3の滅菌60ミリメートルペトリ皿にマグネシウム（Mg ^{2 +}またはCa ^{2 +}を）全くの陽イオンを含まない氷冷滅菌ハンクス液（HBSS）の3ミリリットルを追加します。
2. 以前に^17,18に記載され^ているように、出生後のP0〜P2の仔マウスからの皮質を分離します。
   注：このような海馬などの皮質下構造は、これらの培養物に含まれていません。
3. ねを使って、慎重に髄膜を除去した後、新鮮なHBSSに隔離皮質を転送し、酵素的に組織を解離製造業者のプロトコルに従ってウラル組織切開キット。
4. プレート細胞無菌T-175フラスコに及び[1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含む10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）]を培地中で一晩インキュベートする。
5. 新鮮な培地と次の日、すべてのメディアを交換してください。約3週間または携帯単層が確立されるまで、通常のメディアの変化と、文化をインキュベート....

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結果

このプロトコルは、書かれたように、（：実験ワークフロースキーム図1を参照してください）最初から最後まで完了するのに約36日かかると予想される。サイコシンに応答した多核細胞の形成は、一貫して7日間の処理で観察されている：それは、この初代培養系における「球様様」細胞の開発は信頼性と再現性の両方であることを私たちの経験をされています。

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ディスカッション

ここに記載されているプロトコルは、活性化したミクログリアと球様細胞の発達および機能的特徴を研究するための新しいモデルシステムを提供します。イムらによる以前の研究。 HEK293細胞株を使用する球様細胞形成の研究のための²¹本のプロトコルの開発のためのテンプレートを提供した。それは、モデルで導出球様細胞がGLDにおける識別可能なネイティブ球様細胞とは異?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).	Life technologies	14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi	130-092-628
40 μm cell-strainer	Fisherbrand	22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).	Gibco	14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-065
fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA solution	Life technologies	25299-056
Psychosine	Sigma	P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	19208
Normal Goat Serum (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera	Life Technologies	Various
Mounting Media	Southern Biotech	OB100-01
Phagocytic Assay Kit	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500