Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

Résumé

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Résumé

La fonction précise de la microglie multi-nucléées, appelées cellules globoïdes, qui sont uniquement abondant dans le système nerveux central de la leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD) n'est pas claire. Cette lacune dans les connaissances a été entravée par l'absence d'un modèle in vitro approprié pour l'étude. Nous décrivons ici un système de culture primaire gliale de souris dans lesquelles un traitement avec des résultats psychosine multinucléation de la microglie ressemblant aux cellules globoïdes caractéristiques trouvées dans GLD. L'utilisation de ce nouveau système, nous avons défini les conditions et les modes d'analyse pour l'étude des cellules globoïdes. L'utilisation potentielle de ce système modèle a été validé dans notre précédente étude, qui a identifié le rôle potentiel de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -3 GLD. Ce roman système in vitro peut être un modèle utile pour l'étude de la formation et de la fonction, mais aussi la manipulation thérapeutique potentielle, de ces cellules uniques.

Introduction

Leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD), également connue comme la maladie de Krabbe, est une maladie démyélinisante mortelle résultant de la perte de mutations de fonction dans le galatocerebrosidase (GalC) ^une gène. La forme la plus répandue de GLD est la variante infantile qui est caractérisée par l'apparition de la petite enfance et se caractérise par une évolution clinique agressive de moteur et le déclin cognitif conduisant à la mort prématurée souvent avant cinq ans de ^2,3 ans. Les tests génétiques sont utilisés pour vérifier un diagnostic de GLD ^4. Neuropathologie de GLD révèle démyélinisation répandue, l'atrophie neuronale, astrogliose et la présence de la microglie multi-nucléées engorgés appelé cellules globoïdes ^5-7. L'identification des cellules globoïdes, contenant souvent des inclusions tubuleuses dans leur cytoplasme, a été un élément déterminant de GLD pour les 97 dernières années, bien que la fonction spécifique de ces cellules visibles est resté inaccessible.

La participation des non-MYELnaires gliales (astrocytes) et la microglie dans la pathogenèse de GLD a longtemps été considéré comme une réponse secondaire à la démyélinisation profonde dans cette maladie ^8. Fait intéressant, la première description de cette maladie, faite par Knud Krabbe en 1916 ^5, la formation rapporté des phagocytes multinucléées contenant des débris de lipides qui ont été nommé «cellules globoïdes» et sont l'une des caractéristiques de cette maladie.

Cellules globoïdes sont le symptôme caractéristique de GLD pathologie, bien que leur rôle dans la GLD a longtemps été ignorée. Fait intéressant, ces cellules sont parmi les premiers changements caractéristiques dans les tissus du système nerveux central de GLD. Ce manque de connaissances peut être dû à l'hypothèse que la formation des phagocytes multinucléées, appelées cellules géantes dans d'autres maladies, sont généralement considérée comme une conséquence de la pathologie plutôt qu'une force motrice pathogène initial ^9. Par conséquent, il ya eu peu d'études du mécanisme par whicellules globoïdes ch sont formées à partir des phagocytes, en particulier dans le système nerveux central de GLD. La procédure décrite dans le présent rapport met l'accent sur ​​l'importance de la formation des cellules globoïdes dans le SNC et notre démonstration précédente que de multinucléation induite psychosine-des microglies in vitro et ces cellules ont un sens élevé de l'activité phagocytaire. En accord avec ces observations, les cellules globoïdes dans le cerveau twitcher contiennent souvent des débris de PAS-positif, suggérant des niveaux élevés de l'activité phagocytaire. Cellules globoïdes sont également avérés immunopositif pour la ferritine (un marqueur de la microglie) ^10, KP-1 / CD68 (un marqueur des monocytes), et certains sont également positives pour la vimentine (une protéine intermédiaire du filament et un marqueur des astrocytes et la microglie activée) ^11, HLA-DRA (un récepteur de surface MHCII), le TNF-α et ^7, et Iba-1 (une protéine de liaison de calcium utilisé pour identifier les cellules microgliales) ^12. Sur la base de cette collection de marqueurs, les cellules globoïdes proviennent de la microglie qui se développentun phénotype unique.

En dépit de leur caractère unique, la fonction spécifique et la contribution de GC à GLD pathogenèse a été largement négligé. Cellules globoïdes ont été pensé pour être une conséquence secondaire de démyélinisation chronique. Toutefois, des études antérieures portant sur le lien temporel de cellules globoïdes à la question pathologie blanc de GLD ont identifié la présence de cellules globoïdes à la fin du embryonnaire à la période postnatale précoce; fois précédentes oligodendrocytes apoptose et une démyélinisation manifeste ^13. Ainsi, la séquence temporelle de développement de la neuropathologie dans GLD suggère que les cellules globoïdes sont formés à l'avance de la démyélinisation dans la maladie ^14. Cela a conduit à notre hypothèse que la formation précoce des cellules globoïdes dans GLD peut représenter un événement pathogène plutôt que de définir une réponse réactive secondaire à des lésions des oligodendrocytes ^15. En outre, la dérégulation de l'activité de la microglie dans GLD a été considéré comme un faitr limitant l'efficacité à long terme des thérapies de cellules souches hematopeotic pour le traitement de cette maladie ^16. Ainsi, l'étude des fonctions cellulaires et la régulation de la microglie et les cellules globoïdes, en réponse à psychosine devrait fournir de nouvelles perspectives dans la pathogenèse de GLD.

Jusqu'à récemment, l'absence d'un modèle approprié pour étudier la formation des cellules globoïdes avait limité la compréhension de la fonction précise et la contribution de ces cellules à la pathologie de la GLD. Dans des études récentes, il a été déterminé que les cellules globoïdes analogue peuvent être formées en réponse directe à la psychosine, une toxine pathogène lipidique qui s'accumule dans GLD. Nous avons constaté que la microglie, des macrophages, mais non, sont activés et transformés dans des cellules globoïdes dans les cultures gliales primaires en réponse à psychosine ^15. Cette transformation en cellules globoïdes a été trouvé pour être médiée par la protéase extracellulaire, la matrice métalloprotéinase (MMP) -3 ^15. Plus récemment, nousont étendu ces résultats et déterminé que les cellules de la microglie et globoïdes psychosine activé développés dans ce système in vitro de modèle sont puissamment toxique pour les oligodendrocytes et les cellules progénitrices oligodendrocytes. Par conséquent, lorsqu'il est considéré dans le contexte de GLD, l'accumulation rapide de psychosine et la formation de cellules globoïdes avant démyélinisation appuierait un rôle principal et éventuellement pathogène émergent de la microglie dans cette maladie.

Nous proposons que l'étude de la formation des cellules globoïde va révéler de nouvelles informations sur la pathogenèse de GLD qui contribuera à notre compréhension de cette maladie. En outre, ce nouveau modèle cellulaire de GLD peut fournir un nouveau format à partir de laquelle de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter des changements pathologiques dans cette maladie pourraient être testés. Par conséquent, dans ce rapport, nous proposons un protocole détaillé pour le développement in vitro de cellules globoïdes induite psychosine-de cultures primaires de cellules gliales non-myélinisation.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec la Politique sur la protection des animaux soin et l'utilisation des animaux de laboratoire exposés par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire (NIH) et seulement avec l'approbation du Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Connecticut Health Center.

1 Préparation de cultures gliales mixtes

1. Stériliser tous les instruments avant de les utiliser. Ajouter 3 ml de solution glacée stérile de sel équilibrée de Hank (HBSS) ne contenant pas de cations (Mg2 ⁺ ou Ca2 ⁺⁾ à 60 mm de trois boîtes de Pétri stériles maintenus sur de la glace pour conserver au froid.
2. Isoler les cortex de souriceaux P0-P2 postnatales, comme décrit précédemment ^17,18.
   REMARQUE: les structures sous-corticales, comme les hippocampes, ne sont pas inclus dans ces cultures.
3. Retirez délicatement les méninges et ensuite transférer les cortex isolés de HBSS frais et dissocier les tissus par voie enzymatique, en utilisant une amendeKit de dissection tissulaire ural selon le protocole du fabricant.
4. Plaque de cellules stériles dans des flacons T-175 et incuber pendant une nuit dans un milieu [milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) contenant 1 x pénicilline / streptomycine].
5. Remplacer tous les médias le lendemain avec des milieux frais. Continuer à incuber les cultures, avec les changements de supports réguliers, pendant environ 3 semaines ou jusqu'à une monocouche cellulaire est établie.
   NOTE: Cette monocouche sera composé des astrocytes et la microglie avec une participation d'environ 10: 1 ^19.

2. Globoid induction de cellules dans les cultures gliales mixtes

1. Préparer les lamelles ECM-enduit.
   1. Tremper les lamelles circulaires avec 1 acide stérile N chlorhydrique (HCl) dans une boîte de Pétri stérile pendant 30 min. Laver lamelles avec 3x d'eau stérile, puis tremper dans EtOH à 95% pendant au moins 20 min. puis laisser sécher à l'air.
   2. La place des gouttelettes de matr extracellulaire diluéix matériaux (ECM) de la protéine de revêtement sur ​​une feuille de Parafilm (par exemple, 150 à 250 pl / gouttelette de la laminine de 10 pg / ml dissous dans une solution tampon de phosphate stérile [PBS]). Distribuez les gouttelettes de telle sorte que les lamelles ne toucheront pas lorsqu'il est placé sur ces gouttelettes. Placez délicatement chaque lamelle séché sur une gouttelette en utilisant une pince.
   3. Laissez les lamelles sur les gouttelettes pendant env. 4-6 h dans la hotte de culture avec la ceinture fermée.
   4. Placer les lamelles de l'ECM (ECM revêtu revêtu vers le haut) dans chacun des puits d'une plaque à 24 puits. Laver chaque puits avec du PBS stérile 3x et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
2. Préparation des cellules gliales pour placage sur des lamelles.
   1. Aspirer les médias des cultures gliales et laver délicatement les 3x monocouches gliales avec 10 ml de PBS stérile. Ensuite, ajoutez 8-10 ml de solution de trypsine-EDTA à la T-175, et incuber pendant 5-10 min à 37 ° C.
   2. Lorsque la plupart de la monocouche a été détaché, ajouter 20 ml de milieu completà arrêter le ballon à la trypsine. Recueillir les médias contenant les cellules individuelles dans un tube conique de 50 ml et tourner pendant 10 min à 300 g à la température ambiante.
   3. Aspirer le surnageant sans déranger le culot, puis remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu complet frais à la pipette doucement la solution à l'aide d'une pipette P1000.
   4. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et ensuite remettre en suspension les cellules dans du milieu complet à la densité souhaitée (par exemple 10 ⁵ cellules / ml). Plate cellules sur les lamelles de l'ECM enduit (par exemple 500 pi dans chaque puits de la plaque de 24 puits). Ajouter des milieux complets frais supplémentaires à chaque puits pour 3-5 jours d'incubation à 37 ° C, ou jusqu'à ce que les cellules se développent à la confluence visuel désiré.
3. Le traitement par psychosine.
   1. Reconstituer le psychosine à une concentration de stock (108,3 mM) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer ce stock dans EtOH à 100% pour faire un bouillon de travail qui peut l'n est ajoutée dans chaque puits d'une plaque à 24 puits pour obtenir une concentration finale de 10 uM.
   2. Au moment de l'addition du psychosine, agiter doucement la plaque de culture de mélanger le psychosine dans le milieu de culture. Compléter la psychosine en ajoutant l'équivalent de 10 uM tous les deux jours pendant une semaine.
4. Après 7 jours de traitement psychosine, recueillir les médias et pipette 500 ul de paraformaldéhyde 4% froid (PFA) dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 20 min pour fixer les cellules. Ensuite, lavez chaque puits 3 fois avec du PBS, puis conserver leurs plaques à 4 ° C jusqu'à sa transformation pour immunocytochimie (voir ci-dessous).
   REMARQUE: milieux de culture cellulaire peuvent être collectées pour enzymatique ou test ELISA à ce point, si désiré.

3. immunocytochimie (ICC) pour visualiser les cellules Globoid

1. Remplacer PBS avec du tampon de blocage [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de sérum normal de chèvre (NGS)], et on incube les cellules pendant 1 heure à température ambiante.
2. Danscubate les cellules fixées à des antiserums primaires contre Iba-1 [(1: 1000) dilué dans du PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] pendant au moins 1 heure à température ambiante, puis laver chaque puits avec du PBS 3 x 5 min / laver.
3. Ajouter l'anticorps secondaire conjugué à fluorescence approprié pour identifier le marquage de l'anticorps et de la contre-colorant primaire avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1: 1000) pour identifier les noyaux. Incuber dans une solution d'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante et laver avec du PBS 3 x 5 min.
4. Montez chaque lamelle lames de microscope en utilisant un support de montage. Voir glisse sur un microscope à fluorescence pour des analyses visuelles et quantitatives.

4 Analyse et caractérisation des cellules en culture primaire Globoid

1. Utilisez les trois critères morphologiques suivants pour identifier une cellule globoïde dans la culture:
   1. Identifier les cellules globoïdes utilisant la microscopie à fluorescence par étiquetage immunopositif pour le marqueur de la microglie, Iba-1 +.
   2. Identifiercellules globoïdes que polynucléaires (c. contenant deux ou plusieurs noyaux positifs DAPI).
   3. Identifier les cellules globoïdes par une morphologie arrondie distincte de l'aspect très ramifié de cellules au repos microgliales.
      REMARQUE: Les cellules peuvent également être collectés pour l'analyse et la quantification des marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux à partir de ces cultures.
2. Mesure de l'activation de la microglie et de phagocytose des cellules globoïdes
   1. Pour évaluer l'activité phagocytaire des cellules microgliales traitées de psychosine, ajouter des perles de latex marqués au FITC dans les puits selon les instructions du fabricant. Ajouter des billes de latex fluorescentes conjuguées 48 heures avant la fixation de PFA. Fixer les cellules traitées avec des perles (comme indiqué à la section 2.4), et le processus d'immunocytochimie (comme décrit dans la section 3).
   2. Sélectionner des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore de sorte qu'ils ne se chevauchent pas les spectres d'émission de fluorescence des perles de fluorophores marqué.
   3. Analyze les profils de phagocytose des Iba-1 + microglie par l'identification des cellules qui co-localisent avec les billes marquées par fluorescence.
      REMARQUE: psychosine va activer la microglie. Perles phagocytés seront identifiés dans Iba-1 + les cellules mononucléées et multinucléées dans ce cadre de la culture.

5. induction de cellules Globoid de cultures purifiée microgliales

REMARQUE: Une autre approche de déchiffrer la signalisation intercellulaire entre les astrocytes et la microglie est un autre avantage de cette vitro globoïde modèle cellulaire. Purification des cellules microgliales primaires pour réensemencement ou la co-culture peut être réalisé par leur propriété d'adhérence plus faible dans la culture, comme décrit dans les étapes suivantes (voir la section 5.2).

1. Recueillir les médias dans les cultures mixtes gliales confluentes dans 50 ml tube conique et la maintenir à 37 ° C dans l'incubateur.
2. Isolation de la microglie de cultures mixtes gliales primaires.
   1. Après avoir enlevé le support à partir d'une culture gliale ballon T175 confluent mixte, ajouter supports serrant chauds [constitués de milieu complet 25 mM + 4 (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 mM de bicarbonate de sodium (Sigma)]. Agiter les flacons pour 3-4 heures dans un agitateur orbital à 100 tours par minute (37 ° C). Recueillir les médias de ces flacons secoués dans 50 ml tubes coniques.
      NOTE: Ce support inclura la microglie moins adhérente des flacons.
   2. Spin médias à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml du milieu conditionné d'astrocytes (collectées à l'étape 5.1).
   3. Établir le nombre de cellules acquises à l'aide d'un hémocytomètre et plaque les cellules microgliales sur des lamelles de substrat enduit (voir section 2.1) pour immunocytochimie, ou la plaque sur UltraLow ​​plaques respect de puits pour la collecte future des cellules globoïdes de co-culture avec d'autres types de cellules, telles que les oligodendrocytes (comme described dans la section suivante).
      REMARQUE: Une fois plaqué la microglie peut être traitée avec psychosine (10 M) tel que décrit ci-dessus (voir section 2.3).
3. Co-culture avec des oligodendrocytes primaires pour l'analyse de cytotoxicité.
   REMARQUE: Collection de microglie de psychosine traitée à partir des plaques de faible adhérence pour la co-culture subséquente sur des cultures primaires d'oligodendrocytes ou des cellules oligodendrocytes progénitrices, peut être utilisé pour étudier la fonction de potentiel cytotoxique de ces cellules globoïdes, comme in vitro.
   1. Développer des cultures d'oligodendrocytes primaires en utilisant des méthodes établies ^18,20. Pour recueillir les cellules microgliales traitées de psychosine, pipeter doucement pour détacher les cellules faiblement adhérentes à partir du fond des puits. Recueillir les cellules, centrifuger à 300 g pendant 10 min, puis remettre en suspension attentivement dans les médias de la différenciation des oligodendrocytes [composé de Neurobasal médias, L-glutamine (1x), B-27 supplément (1x) et triiodothyronine (T3, 10 ng / ml )].
   2. Compter le nombre de cellules en utilisant un hématimètre puis ensemencer les microglies sur la culture d'oligodendrocytes à 1 x 10 ⁵ cellules / ml, ce qui entraîne un approximatif de 1: 2 microglie / rapport des oligodendrocytes. Incuber à titre de co-culture pendant 3 jours.
   3. Fixer les cellules pour immunocytochimie (voir section 2.4). Recueillir les milieux de culture cellulaire pour ELISA ou analyse chimique selon les besoins.

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Résultats

Ce protocole, tel qu'il est rédigé, devrait prendre environ 36 jours pour terminer du début à la fin (Voir Figure 1: Schéma expérimental de workflow). Il a été notre expérience que le développement des cellules «globoïde-comme» dans ce système de culture primaire est à la fois fiable et reproductible: la formation de cellules multinucléées en réponse à psychosine est toujours observé avec 7 jours de traitement.

Coloration immunocytochimique de la micr...

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Discussion

Le protocole décrit ici fournit un nouveau système modèle pour étudier le développement et la caractérisation fonctionnelle de la microglie et les cellules activées globoïdes. Des travaux antérieurs par Im et al. en utilisant une lignée cellulaire HEK293 a fourni un modèle pour le développement du présent Protocole pour l'étude de la formation des cellules globoïde ^21. Il est également important de souligner que les cellules globoïdes dérivés dans le modèle diffèrent des cell...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).	Life technologies	14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi	130-092-628
40 μm cell-strainer	Fisherbrand	22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).	Gibco	14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-065
fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA solution	Life technologies	25299-056
Psychosine	Sigma	P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	19208
Normal Goat Serum (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera	Life Technologies	Various
Mounting Media	Southern Biotech	OB100-01
Phagocytic Assay Kit	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500