Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

Resumo

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Resumo

A função precisa da microglia multi-nucleadas, chamados de células Globóides, que são excepcionalmente abundantes no sistema nervoso central de leucodistrofia celular globoso (GLD) é incerto. Esta lacuna no conhecimento tem sido dificultada pela falta de um adequado modelo in vitro para o estudo. Relata-se um sistema de cultura glial murino primário em que o tratamento com resultados psicosina em multinucleações de microglia semelhantes às células Globóides características encontradas em GLD. Usando este novo sistema, que definiu as condições e modos de análise para o estudo de células Globóides. O potencial de uso deste sistema modelo foi validado em nosso estudo anterior, que identificou um papel potencial para metaloproteinases da matriz (MMP) -3 em GLD. Este novo sistema in vitro pode ser um modelo útil para estudar a formação e função, mas também a manipulação terapêutica potencial, destas células únicas.

Introdução

Leucodistrofia celular Globóides (GLD), também conhecida como doença de Krabbe, é uma doença desmielinizante fatal, resultante da perda de mutações de função no galatocerebrosidase (GalC) do gene ^1. A forma mais prevalente de GLD é a variante infantil que se caracteriza por início na infância e caracteriza-se por um curso clínico agressivo do motor e do declínio cognitivo, levando à morte prematura, muitas vezes antes dos cinco anos de idade ^2,3. O teste genético é utilizado para verificar o diagnóstico de GLD ^4. Neuropatologia da GLD revela desmielinização generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis e presença de microglia multi-nuc....

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Política de Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório estabelecido pelo Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) e somente com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Centro de Saúde de Connecticut.

1 Preparação de culturas mista glial

1. Esterilizar todos os instrumentos antes de usar. Adicione 3 mL de solução gelada estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo catiões não (Mg2 ⁺ ou Ca2 ⁺⁾ para 60 milímetros estéreis três placas de Petri mantidos em gelo para manter frio.....

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Resultados

Este protocolo, como está escrito, deverá ter cerca de 36 dias para ser concluído do início ao fim (veja a Figura 1: Esquema de Fluxo de Trabalho Experimental). Tem sido nossa experiência que o desenvolvimento de células "Globóides-like 'neste sistema de cultura primária é confiável e reprodutível: a formação de células multinucleadas em resposta a psicosina é observado de forma consistente com 7 dias de tratamento.

Coloração imunocitoquímica de mi.......

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Discussão

O protocolo aqui descrito fornece um novo sistema modelo para estudar o desenvolvimento e caracterização funcional de microglia ativados e células Globóides. Trabalhos anteriores por Im et al. utilizando uma linha celular HEK293 fornecido um modelo para o desenvolvimento do presente protocolo para o estudo da formação de células globoso ^21. É também importante salientar que as células derivadas Globóides no modelo diferem das células nativas Globóides identificáveis ​​em GLD. Por ex.......

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).	Life technologies	14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi	130-092-628
40 μm cell-strainer	Fisherbrand	22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).	Gibco	14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-065
fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA solution	Life technologies	25299-056
Psychosine	Sigma	P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	19208
Normal Goat Serum (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera	Life Technologies	Various
Mounting Media	Southern Biotech	OB100-01
Phagocytic Assay Kit	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500