Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

Zusammenfassung

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Zusammenfassung

Die genaue Funktion der Mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen, die im Zentralnervensystem Globoidzell Leukodystrophie (GLD) eindeutig reichlich sind, ist unklar. Diese Wissenslücke wurde durch den Mangel eines geeigneten in vitro-Modell zur Untersuchung behindert. Hier beschreiben wir einen primären murinen Gliazellen Kultursystem, in dem die Behandlung mit Psychosin ergibt multinucleation der Mikroglia ähnlich den Kenn Globoidzellen in GLD gefunden. Mit diesem neuartigen System definierten wir die Bedingungen und Formen der Analyse für das Studium der Globoidzellen. Die mögliche Verwendung von diesem Modellsystem wurde in unserer vorherigen Studie, die eine mögliche Rolle für die Matrix-Metalloproteinase (MMP) identifiziert validiert -3 in GLD. Diese neuartige in vitro-System kann ein nützliches Modell, in dem die Bildung und Funktion, sondern auch die potentielle therapeutische Manipulation dieser einzigartigen Zellen zu studieren.

Einleitung

Globoidzell Leukodystrophie (GLD), auch als Morbus Krabbe genannt, ist eine tödliche demyelinisierende Krankheit von Funktionsverlust-Mutationen in der galatocerebrosidase (GALC) Gen ¹ resultieren. Die am weitesten verbreitete Form der GLD ist die Kinder-Variante, die von Beginn in der frühen Kindheit und typisiert wird, gekennzeichnet durch einen aggressiven klinischen Verlauf der motorischen und kognitiven Rückgang führt zu vorzeitigem Tod oft vor Ablauf von fünf Jahren ^2,3. Genetische Tests wird verwendet, um eine Diagnose der GLD ⁴ überprüfen. Neuropathologie der GLD enthüllt weit verbreitete Demyelinisierung, neuronale Atrophie, ....

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Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt durch das Amt für Labortierschutz (NIH), und nur mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Universität dargelegten Connecticut Health Center.

1. Herstellung der Misch Gliakulturen

1. Sterilisieren alle Instrumente vor der Verwendung. 3 ml eiskaltem, sterilen ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS), die keine Kationen (Mg ^{2 +} oder Ca ^{2 +)} zu drei sterile 60 mm Petrischalen auf Eis gehalten kalt zu halten.
2. Isolieren Sie die Rinden von postnatale....

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Ergebnisse

Dieses Protokoll, wie geschrieben, wird erwartet, dass etwa 36 Tage, um von Anfang bis Ende (siehe Abbildung 1: Experimentell Workflow-Schema) zu vervollständigen. Es ist unsere Erfahrung, dass die Entwicklung von "Globoid-like 'Zellen in dieser Primärkultur-System ist zuverlässig und reproduzierbar: die Bildung von vielkernigen Zellen in Reaktion auf Psychosin konsequent mit 7 Tagen der Behandlung beobachtet.

Immunzytochemische Färbung der Mikroglia mit Iba-1 i.......

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Diskussion

Das hierin beschriebene Protokoll sieht ein neues Modellsystem, in dem die Entwicklung und funktionelle Charakterisierung von aktivierter Mikroglia und Globoidzellen studieren. Frühere Arbeiten von Im et al. mit einer HEK293-Zelllinie ein Template für die Entwicklung des vorliegenden Protokolls für das Studium der Globoidzell Bildung ^21. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Globoidzellen im Modell abgeleitet von den nativen Globoidzellen identifizierbar GLD abweichen. Zum Beispiel hab.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).	Life technologies	14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi	130-092-628
40 μm cell-strainer	Fisherbrand	22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).	Gibco	14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-065
fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilin/Streptomycin	Life technologies	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Trypsin-EDTA solution	Life technologies	25299-056
Psychosine	Sigma	P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	19208
Normal Goat Serum (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera	Life Technologies	Various
Mounting Media	Southern Biotech	OB100-01
Phagocytic Assay Kit	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500