トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

要約

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

要約

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

概要

胚性幹細胞のような多能性幹細胞（iPS細胞）へのヒト体細胞を再プログラムする能力は、最初高橋らによって発見された2007年¹に4つの転写因子を発現するレトロウイルスで形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（いわゆるダビング山中のOct3因子/ 4、Sox2の、c-Mycの、およびKlf4）の形態、増殖、遺伝子発現、およびエピジェネティックな状態に基づいて、ヒト胚性幹細胞（hESC）と非常に類似であることが示された。決定的に、iPS細胞はまた、3つの胚葉全て¹の細胞に分化することができる。性IPSCの増殖能と分化能力は、彼らに非常に魅力的なツールになります。特定の疾患に罹患している患者からの細胞を再プログラミングすることによって、iPS細胞は、in vitro疾患モデル系としての潜在的治療薬としての両方に使用することができる。

後者の目的のために、いくつかの問題がiPS細胞の可能性を最大限前に対処する必要があります臨床設定で実現することができる。 in vitroで培養したhESCおよびiPSCの再プログラミングおよび細胞メンテナンス時異種誘導体の使用の腫瘍形成能、およびin vivoで移植された細胞を追跡する必要性は 、Hentze らによるレビュー、多能性幹細胞の臨床応用（のすべての重要なハードルである。 ^2）。移植後に関係なく、アプリケーションのサイレンと斑入り抵抗し、視覚的に検出可能なマーカーを伴うだろう分化した細胞を追跡する必要性に理想的なソリューション。外来DNAが安全ハーバー遺伝子座に導入されたときに統合された導入遺伝子の堅牢かつ持続的な表現は、最も容易に達成可能である。つまり、統合されたベクターの十分な転写を可能にするゲノム部位の隣接遺伝子³における発現の摂動を緩和し、同時に一方で。非常によく、その発見以来、特徴付けられているそのようなサイトには、アデノ随伴ウイルスINTEGRですタンパク質ホスファターゼ1調節サブユニット12C（PPP1R12C）遺伝子の第1イントロンにおけるATIONサイト1（AAVS1）、。この遺伝子座は、培養およびインビトロ分化³ に伸長時を統合導入遺伝子の持続的かつ強固な発現を可能にするだけでなく、転写摂動⁴から周囲の遺伝子を保護するだけでなく、示されている。両方の機能に起因AAVS1部位^5に隣接する内因性のクロマチンインスレーターエレメントの存在のためであると考えられている。

単に過去10年間のゲノムエンジニアリングツールの進歩は著しく、任意の細胞型で遺伝子操作を達成することができる容易さと効率性を促進した。初期の成功した実験では、ESCは^6,7に遺伝子ターゲッティングを達成するために導入された供与体と内因性相同組換え（HR）の非常に低レベルの依拠が、このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）、有意と、部位特異的ヌクレアーゼの使用ficantlyような実験^8,9の効率を大幅に増加している二本鎖DNA切断の生成を介して相同組換えを誘導する。効率的なサイト固有のデザイナーヌクレアーゼに植物病原性キサントモナス属の転写活性化因子のようなエフェクター（テイルズ）および原核クラスタ化され、定期的にinterspaced短い回文反復（CRISPR）/ Cas9システムの両方の再利用は、多能性幹細胞でアクセス可能な遺伝子ターゲティングを行っていると実用的な方法論^10-13。

最近の論文は、TALEヌクレアーゼ^{（TALENs）14を}用いてヒトiPS細胞でAAVS1セーフハーバー座への緑色蛍光レポーターカセットの安定した組み込みのための効率的な方法を説明した。これらの標的性IPSCは、このような有用性のための強力な証拠を提供しても、心筋梗塞（MI）のマウスモデルへの心筋細胞移植に向け分化後に蛍光を維持安定した蛍光多能性幹細胞^14。標的コロニーを得るために、遺伝子トラップ法は、スプライシングアクセプター（SA）は、図2（a）の自己切断ペプチド配列は、内因性PPP1R12Cプロモーターの制御下のピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ（PAC）の遺伝子を配置し、前記使用された。したがって、AAVS1遺伝子座にDNA供与体を取り込んだだけiPS細胞は、彼らがピューロマイシン耐性に基づいて選択可能なレンダリング、PACを表現。 （ 図^1、15）。このプロトコルは、AAVS1-GFP iPS細胞を生成する手順は、上のベースの性IPSCを選択、AAVS1セーフハーバー座に4.2キロバイトのDNA断片を統合するTALENsでiPS細胞をトランスフェクトするプロセスを含む、最近の論文^14、および9.8キロバイトドナーで報告詳細をピューロマイシン耐性、およびクローン増殖のためにコロニーを選ぶ。本明細書に記載の技術は、多くのゲノム工学実験に適用することができる。

プロトコル

1.基底膜マトリックスの調製とプラスチック製品の塗装

1. 氷の上に-20℃から凍結された基底膜マトリックスの株式を置き、4℃で一晩解凍。
2. 解凍後、予め冷却したエッペンドルフチュー​​ブに基底膜マトリックスのピペット2mgのアリコート。必要になるまで-20℃でこれらを保管してください。
3. 基底膜マトリックスでコーティングされたプレートを製造するために、（通常〜2時間以内）エッペンドルフチュー​​ブ消える氷の最後の一片まで氷上に1アリコートを解凍。
4. 解凍後、基底膜マトリックスコーティング溶液を作製し、冷（4℃）DMEM / F12を12mlに基底膜マトリックスを追加する。
5. 適切な培養容器に基底膜マトリックス溶液を加える。 6ウェルプレートについて、ウェル当たり1mlを分配する。基底膜マトリックス溶液が完全に、各ウェルを確実に覆うようにするにプレートを渦巻。
6. パラフィルムは、基底膜マトリックスでコーティングされたプレート/皿をシールし、カンガルーインキュベート使用前に1時間メートル温度。 4℃での代わりに、店の基底膜マトリックス被覆プレート/ディッシュとコーティングの2週間以内に使用します。
   注：乾燥を防ぐために基底膜マトリックスでコーティングされたプレート/皿に余分なDMEM / F12を追加します。 4℃で保存し基底膜マトリックスでコーティングされたプレート/皿を使用する前に、生物学的安全キャビネットに入れて、少なくとも30分間室温に来ることができます。
7. 完全培地と細胞の添加の前に吸引基底膜マトリックス。

E8媒体の調製

1. 4℃で一晩E8サプリメントを解凍しE8培地を準備します。
2. 500ミリリットルのストックからE8基本培地の10ミリリットルを取り外し、廃棄します。
3. 直接E8基礎培地の490ミリリットルにE8サプリメントの全体10ミリリットルバイアルをピペット。繰り返し温度変動が攻殻でのbFGFを分解することができるように、37℃の水浴中で完全E8媒体を暖めるしないTE E8媒体。
4. サプリメントの添加2週間以内に完全なE8媒体を使用してください。

性IPSCの3.解凍

1. ドライアイス上で液体窒素や場所から凍結したiPS細胞のバイアルを取り外します。
2. 急速に37℃の水浴中でバイアルを解凍する。氷の遺跡の唯一の小さなフラグメントまで水浴中でバイアルを旋回。
3. 生物学的安全キャビネットに70％エタノールおよび転送バイアルスプレー。
4. バイアルに直接室温E8メディア​​滴下の1ミリリットルを追加します。
5. の2mlピペットを用いて15mlのコニカルチューブにE8培地9ml中に細胞懸濁液を滴下移す。細胞および培地はすぐによく混ぜていることを確認するために頻繁にチューブを旋回。
6. 5分間200×gで細胞を遠心します。
7. 上清を吸引し、10μMのY-27632を補足したE8の適切な容量の細胞ペレットを再懸濁します。
8. 地下室の適切な数にセルを追加membran一晩37℃、5％CO ₂インキュベーター内の電子マトリックスで被覆したウェル、および場所。それは、解凍後迅速な復旧を可能にするために、6ウェルプレートのウェルあたり少なくとも0.2×10 ⁶ IPSCをメッキすることをお勧めします。

4.メンテナンスとiPS細胞のルーチン継代

1. 毎日のE8媒体をリフレッシュします。
2. 倒立顕微鏡で細胞の形態および集密度を監視します。高品質のiPS細胞は、明確な境界線を持つフラットコロニーに成長。個々のコロニーを「丸石様」の外観を有する。
3. 継代性IPSC細胞を、それらが〜70％コンフルエントに達する。
4. 500ミリリットルのDPBSに0.9グラムのNaClと500μlの0.5 M EDTAを加えることによって、EDTA継代溶液を調製する。滅菌するためにNaCl、および真空フィルターを溶解するために十分に混合する。継代の前に37℃の水浴中で継代溶液のアリコートを温める。
5. 通路に、吸引は、培地を費やし、暖かいのパ等量の細胞を1回洗浄ソリューションをsaging。コー​​トに吸引し、ピペット十分なEDTA継代液細胞（6ウェルプレートのウェルあたり1ml）。
6. 倒立顕微鏡下で細胞を置き、IPSCのコロニーを観察します。コロニー育ち境界内の穴の外観は、2から5分以内に明らかとなるはずです。
7. 慎重にEDTA継代ソリューションを吸引。
8. を10mlピペットを用いて、十分に継代する各直接高圧下（6ウェルプレートを使用する場合）E8培地4mlを分注する。
9. IPSCの塊を収集し、1から分割比に応じて、井戸の適切な数に分割さ：1:12 8。細胞塊の解離が悪い可能性になりますように、オーバーピペットはありません。
10. インキュベーター内でプレートを置き、細胞を分散させるために、前後および左右に数回プレートを揺する。

TansfectionのためのMEFとiPS細胞の5準備

1. transfectioする48時間前基底膜マトリックスコートした6ウェルプレートの4つ以上のウェルに6、それらは従って二日間70％コンフルエントになるように：〜1でnは、通過性IPSC。
2. 翌日、10％FBSおよび1×MEM-NEAAを補充したDMEM（高グルコース）からなるMEF培地にDR4 MEFを解凍。
3. 〜2×10 ⁴細胞/ cm ²の二つの10cmディッシュにプレートDR4 MEFを、37℃で一晩インキュベートする。
4. トランスフェクションの日に、iPS細胞にトランスフェクションを行う前に、10μMのY-27632の30分を補ったE8にMEF培地を変更します。
5. オプション：iPS細胞のフローサイトメトリー分析の後、トランスフェクションが所望される場合、室温で4℃、場所から基底膜マトリックスでコーティングされたプレートを取り外す。
6. オプション：トランスフェクションの前に4時間、10μMの最終濃度で、Y-27632で事前にトランスフェクションIPSC文化を補う。

6.ジェントル細胞解離試薬トリートメントND性IPSCのトランスフェクションは、エレクトロポレーションシステムを使用して

1. 4℃からP3一次細胞トランスフェクション溶液を除去し、それは〜30分間室温に来ることができます。使用前にトランスフェクション溶液に全体を100μlのサプリメントを追加します。
2. 37℃の水浴中で穏やかな暖かい細胞解離試薬。
3. AAVS1 TALENs（PZT-AAVS1-L1とPZT-AAVS1-R1）-20℃からとAAVS1-CAG-EGFPドナーを取得します。
4. インキュベーターからiPS細胞を取り出し、DPBSで一度洗う。
5. ウェル当たり穏やかな細胞解離試薬1 mLを加え、5分間37℃でiPS細胞をインキュベート、または50％を超える細胞が培養容器から解離するまで。
6. アップおよび培養容器から残りの細胞を解離するために、とIPSC塊を分割するP1000ピペットを用いて数回上下細胞をピペットで。
7. フュルトする10ミリリットルピペットを用いて各ウェルにE8培地2mlを追加し、ピペットを上下に数回ER単一細胞に細胞塊を分解
   注：細胞塊が十分に細分化されていない場合のトランスフェクション効率が著しく低下する。
8. 15ミリリットルコニカルチューブでiPS細胞を収集し、3分間100×gで遠心。
9. E8媒体の最小限の量で、上清を吸引し、そして細胞を再懸濁する。
10. 生体染色などの0.4％トリパンブルーを適用した後の血球計数器を用いて細胞を数える。 （「塊」あたり1-3細胞）をカウントしながら、細胞が十分に解離していることを確認します。
11. 2 15ミリリットルコニカルチューブのそれぞれに3×10 ^6個の細胞を分配し、3分間100×gで再びスピンダウン。
    注：低速遠心分離細胞ストレスを軽減し、エレクトロポレーションの前にiPS細胞の容易な再懸濁することができます。
12. ヒト胚性幹細胞株H9（プログラムCB-150）のための細胞型特異的プログラムへのエレクトロポレーションシステムを設定します。
13. 遠心分離した後、CELから上清を吸引Lペレット。 1ペレットに、対照試料としてのHRドナー10μgのを追加します。他のペレットに実験試料として各TALEN5μgの（PZT-AAVS1-L1とPZT-AAVS1-R1）と一緒に、HRドナー10μgのを追加します。
14. P3一次細胞のトランスフェクション溶液100μlの各細胞ペレットを再懸濁し、キュベットに移す。
15. トランスフェクションを行い、すぐにそれぞれのキュベットに室温E8培地500μlを添加する。
16. ステップ5.4で作成DR4のMEFのを含む1つの10 cmディッシュにトランスiPS細胞の滴下を転送します。
17. オプション：トランスフェクション効率のanaylsisフローサイトメトリーが所望される場合は基底膜マトリックスコートした6ウェルプレートの1ウェルに、各実験からの数滴を加える。
18. 繰り返して両方のサンプルを完了するために6.15から6.17までを繰り返します。次の日は、二回DPBSで細胞を洗浄し、E8よりも良いフィーダー上IPSC文化をサポートするために表示されNutriStemに培養液を切り替える。
19. Trは48時間トランスフェクション後72時ansient EGFP発現のピーク。必要に応じて、トランスフェクション効率を評価する。

目標とされたiPS細胞の7マイシン選択

1. 性IPSCは、70％の集密度に達したときにピューロマイシン選択をトランスフェクション後72時間を開始します。
2. NCRM5性IPSCは、0.5 / mlのピ​​ューロ（1/2フル用量）NutriStem培養培地中に希釈された時にピューロマイシン選択を開始する。最適ピューロ濃度は0.25からいくつかのIPSCライン用の1μg/ MLLに異なる場合があります。
3. NutriStem文化性IPSC毎日の中をリフレッシュする3日間+ 0.5 / mlのピ​​ューロ、。
4. 3日後、1μg/ mlのピ​​ューロマイシンへの濃度を増加させる。
5. 別の7から8日間/ mlピューロマイシン選択1μgの下に、または個別のコロニーがコロニーピッキングのための十分な大き表示されるまで、文化性IPSC。

8.コロニーをピッキングし、ターゲットiPS細胞の拡大

1. 基底膜を使用して、コー​​ティングするマトリックスを各ウェルに（12ミリリットルDMEM / F12に希釈し2mgの基底膜マトリックス）基底膜マトリックスコーティング溶液50μlを分配することにより、96ウェルプレート。使用前に4℃で一晩プレートを保管してください。
2. 基底膜マトリックスでコーティングされたプレートを室温にさせた後、基底膜マトリックスを吸引し、10μMのY-27632各ウェルに補充した100μlのE8を分配する。
3. 生物学的安全キャビネットに倒立顕微鏡を置き、滅菌するために70％のエタノールで軽くスプレー。
4. 先端に小さな「フック」があり、理想的なコロニーピッキングツールを入手するためにブンゼンバーナー上のガラスパスツールピペットを引き出します。 70％のEtOHで滅菌し、乾燥するフード内に置く。
5. インキュベーターから目標とIPSCのコロニーを含むシャーレを取り出し、顕微鏡下でフード内に配置します。
6. コロニーピッキングツールを使用してコロニーの境界線の周りに円をトレースすることによりiPS細胞を選択してください。
7. 優しくこすり、プレートの表面からIPSCコロニーを削除するには、コロニーピッキングツールの「フック」を使用してください。大きなコロニーについて、コロニーを再メッキ後の細胞の成長を促進する四半期にコロニーピッキングツールを使用してXを描く。
8. 細胞塊が切り離され、自由に浮遊していると、〜にiPS細胞を収集するために30μlの設定P200ピペットを使用しています。直接96ウェルプレートに細胞をプレート。
9. オプション：その後、37℃で5分間消化するために、50μlの穏やかな細胞解離試薬を追加し、エッペンドルフチューブにiPS細胞を収集するために〜5μlに設定P20ピペットを使用しています。消化後、穏やかな細胞解離試薬を希釈し、5分間標準テーブルトップ微量200×gで細胞をスピンダウンするエッペンドルフチュー​​ブに500μlのE8媒体を追加します。次に、培地のほとんどを吸引し、96ウェルプレートに細胞を再懸濁し、転送するために〜30μlのままにしておきます。
   注：このアプローチは、細胞塊と取り出しコロニーの迅速な拡大の解離を促進する。
10. IPSCコロニーの十分な数が収集されるまで、コロニーピッキングを継続（約実験あたり20〜30個のコロニーを推奨します）。
11. コロニーピッキングした後、一晩インキュベーター内で96ウェルプレートを配置。 〜70％コンフルエントになるまで完全E8媒体翌日、そして文化にリフレッシュします。
12. への96ウェルから継代細胞を24ウェル、その後に6ウェル、ステップ4.5から4.10に記載されているように。
    注：6ウェルプレートよりも小さいウェルを使用した場合EDTA溶液およびE8媒体の体積は比例して減少されるべきである。
13. ランダムに挿入されたベクターの¹⁶の標的カセットの統合と存在しないことを確認するために、接合PCRおよびサザンブロット分析によって成功を目標と評価する。

結果

プロトコルの可視化は、iPS細胞がNutriStemのいずれかのためE8緑色または青色で強調異なる培地で培養している期間に、 図2に設けられている。それは、高品質のiPS細胞をトランスフェクトすることが重要である。定期的なメンテナンスを通じて培養皿を調べ、IPSC培養は玉石様の形態（ 図3A）を有する、主に個別のコロニーが含まれていることを確認します。分化した?...

ディスカッション

（1）効率的にトランスフェクションにより性IPSCにTALENとドナープラスミドを提供する：AAVS1セーフハーバーの成功の世代のための最も重要なステップは、人間のiPS細胞であるターゲット（2）トランスフェクション後、トランスフェクションとメッキ密度の前に単一細胞にiPS細胞の解離を最適化する。 （3）用量およびIPSCラインの成長に基づく薬剤選択の時間を最適化する。 （4）を慎重に解...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS/DESCRIPTION
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL	Corning	354230	Store at -20°C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4°C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4°C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061