Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l'homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Résumé

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Résumé

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Introduction

La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes souches embryonnaires cellulaires comme induites (CSPi) a été découvert par Takahashi et al. En 2007 ^1. Fibroblastes dermiques humaines transduites avec rétrovirus exprimant quatre facteurs de transcription (Le Yamanaka soi-surnommé facteurs Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, et Klf4) ont été montrés être très similaire à des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) en fonction de la morphologie, la prolifération, l'expression du gène, et l'état épigénétique; surtout, iPSCs sont également capables de se différencier en cellules des trois couches germinales ^1. La capacité potentielle et la différenciation de prolifération des CSPi les rend très attractifs outils; par reprogrammation des cellules provenant de patients souffrant de maladies spécifiques, iPSCs peuvent être utilisés à la fois comme systèmes de modèle in vitro de la maladie et en tant qu'agents thérapeutiques potentiels.

Pour ce dernier objectif, plusieurs questions doivent être réglées avant que le plein potentiel de CSPidans un cadre clinique peut être réalisé; le potentiel tumorigène des CSEh et CSPi, l'utilisation de dérivés xénogéniques lors de la reprogrammation et l'entretien des cellules cultivées in vitro, et la nécessité de suivre les cellules transplantées in vivo sont tous les obstacles cruciaux à l'application clinique des cellules souches pluripotentes (Commenté par Hentze et au. ^2). Une solution idéale pour la nécessité pour le suivi des cellules différenciées post-transplantation impliquerait un marqueur visuellement détectable qui résiste taire et panachées indépendamment de l'application. Expression forte et soutenue de transgènes intégrés est plus facilement réalisable lorsque l'ADN exogène est introduit dans Coffre-port loci; ce est-à emplacements génomiques qui permettent la transcription suffisante d'un vecteur intégré en même temps l'atténuation des perturbations de l'expression dans ^trois gènes voisins. Un tel site qui a été très bien caractérisé depuis sa découverte est le virus intégr adéno-associésite ation 1 (AAVS1), dans le premier intron de la protéine phosphatase une sous-unité régulatrice 12C (PPP1R12C) gène. Ce lieu a été démontré non seulement pour permettre l'expression soutenue et robuste de transgènes intégrés dans le temps étendu dans la culture et dans la différenciation in vitro ^3, mais aussi pour protéger les gènes de la perturbation de la transcription ⁴ entourant; les deux éléments sont considérées comme étant dues à la présence d'éléments d'isolateur chromatine endogènes flanquant le site de AAVS1 ^5.

Les progrès dans les outils d'ingénierie des génomes plus juste de la dernière décennie ont grandement facilité la facilité et l'efficacité avec lesquelles les manipulations génétiques dans ne importe quel type de cellule peuvent être atteints. Bien que les expériences réussies début invoqués excessivement faibles niveaux de recombinaison homologue endogène (HR) avec un donneur présenter à atteindre ciblage de gène dans les CES ^6,7, l'utilisation des nucléases spécifiques au site, tels que les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), qui signitivement induire la recombinaison homologue grâce à la génération d'une rupture d'ADN double brin a considérablement augmenté l'efficacité de ces expériences ^8,9. La réorientation des deux transcription activateur comme effecteurs (contes) de plantes pathogène Xanthomonas genres et les cluster régulièrement espacées répétitions palindromiques courts procaryotes (CRISPR) / système Cas9 dans efficaces nucléases de créateurs propres à chaque site a fait le ciblage de gènes dans les cellules souches pluripotentes un accessible et méthodologie possible ^10-13.

Un article récent décrit une méthode efficace pour l'intégration stable d'une cassette de rapporteur fluorescent vert dans le AAVS1 Coffre-port locus CSPi humaines à l'aide de nucléases TALE (Talens) ^14. Ces CSPi ciblées ont maintenu leur fluorescence même après la différenciation dirigé vers les cardiomyocytes et la transplantation dans un modèle de souris de l'infarctus du myocarde (IM), fournissant des preuves solides pour l'utilité de cettede manière stable des cellules souches pluripotentes ¹⁴ fluorescent. Pour obtenir des colonies cibles, un procédé de piégeage de gènes a été utilisé dans lequel un épissage accepteur (SA), une séquence de peptide de l'auto-clivage 2A place la puromycine N-acétyl-transférase (PAC) gène sous le contrôle du promoteur PPP1R12C endogène; Ainsi, seules iPSCs qui ont incorporé le donneur d'ADN au locus AAVS1 expriment PAC, les rendant sélectionnable sur la base de la résistance à la puromycine; (Figure 1, ^15). Ce protocole détaille les procédures de générer AAVS1-GFP CSPi signalé dans le récent article ^14, y compris le processus de transfection CSPi avec TALENs et un donneur de 9,8 kb pour intégrer un fragment d'ADN de 4,2 kb dans le locus AAVS1 Coffre-port, la sélection CSPi basé sur puromycine-résistance, et les colonies de cueillette pour l'expansion clonale. Les techniques décrites ici peuvent être appliqués à de nombreuses expériences d'ingénierie du génome.

Protocole

1. Préparation de la membrane basale Matrix et Revêtement de Plasticware

1. Placez le congelé membrane basale matrice stocks de -20 ° C sur de la glace et décongeler une nuit à 4 ° C.
2. Après décongélation, la pipette des parties aliquotes de 2 mg matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-réfrigérés. Stocker ces à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Pour préparer des plaques de matrice revêtu la membrane basale, dégeler une aliquote sur la glace jusqu'à ce que le dernier morceau de glace dans les disparaît tube Eppendorf (généralement dans ~ 2 h).
4. Après décongélation, ajouter matrice de membrane basale de 12 ml de froid (4 ° C) du milieu DMEM / F12 pour faire une solution de revêtement de la matrice de membrane basale.
5. Ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le récipient de culture approprié. Pour une plaque à 6 puits, distribuer 1 ml par puits. Agiter la plaque pour se assurer que la solution de la matrice de la membrane basale couvre complètement chaque puits.
6. Parafilm sceller la membrane basale matrice plaque revêtue / plat, et incuber à room température pendant 1 heure avant utilisation. Alternativement, plaques de matrice revêtu de la membrane basale du magasin / plats à 4 ° C et utiliser dans les 2 semaines de revêtement.
   REMARQUE: Ajout frais de DMEM / F12 pour la membrane basale matrice plaque revêtue / plat pour éviter le dessèchement. Avant d'utiliser 4 ° C membrane basale stockée matrice plaque revêtue / plat, placez-le dans une enceinte de sécurité biologique et de lui permettre de revenir à la température ambiante pendant au moins 30 min.
7. Aspirer matrice de membrane basale complètement avant l'addition de milieu et de cellules.

2. Préparation du milieu E8

1. Préparer un milieu de culture en décongelant E8 E8 supplément pendant une nuit à 4 ° C.
2. Retirer 10 ml de E8 milieu de base de la 500 ml stock et le jeter.
3. Pipeter l'ensemble flacon de 10 ml de supplément E8 directement dans 490 ml de milieu de base E8. Avez moyenne E8 complète pas chaud dans un bain-marie à 37 ° C, que les fluctuations de température répétées peuvent dégrader le bFGF dans l'achèvementmoyenne te E8.
4. Utilisez milieu complet E8 dans les 2 semaines de plus du supplément.

3. Le dégel des CSPi

1. Retirer un flacon de CSPi congelés de l'azote liquide et le placer sur la glace sèche.
2. Décongeler rapidement le flacon dans un bain d'eau à 37 ° C; agiter le flacon dans le bain d'eau jusqu'à ce que seule une infime fragment de restes de glace.
3. Vaporisez le flacon avec 70% d'éthanol et le transfert à une enceinte de sécurité biologique.
4. Ajouter 1 ml de la température ambiante, goutte à goutte E8 milieu directement dans le flacon.
5. Utilisation d'une pipette 2 ml, goutte à goutte de transférer la suspension de cellules dans 9 ml de milieu E8 dans un tube conique de 15 ml. Agiter le tube fréquemment pour se assurer que les cellules et le milieu bien mélanger rapidement.
6. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume approprié de E8 supplémenté avec 10 pM de Y-27632.
8. Ajouter les cellules à un nombre approprié de sous-sol membrane matrice puits revêtus, et placer dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur nuit. Il est recommandé à l'assiette au moins 0,2 x 10 ⁶ iPSC par puits d'une plaque à 6 puits pour permettre la récupération rapide après décongélation.

4. Maintenance et repiquage systématique des CSPi

1. Actualiser moyenne quotidienne E8.
2. Surveiller la morphologie et la confluence de cellules avec un microscope inversé. CSPi de haute qualité dans les colonies grandissent plats avec des aréoles distinctes; colonies individuelles possèdent une apparence "pavée-like".
3. Passage des cellules CISP quand ils atteignent ~ 70% de confluence.
4. Préparer une solution EDTA de passages en ajoutant 0,9 g de NaCl et 500 pi d'EDTA 0,5 M à 500 ml DPBS. Mélangez bien pour dissoudre NaCl, et le filtre à vide à stériliser. Chauffer une partie aliquote de la solution de passages dans un bain d'eau à 37 ° avant le repiquage.
5. Au passage, aspirer passé milieu de culture et laver les cellules une fois avec un volume égal de pas chaudssaging solution. Aspirer et pipette assez EDTA solution de passages pour enrober les cellules (1 ml par puits d'une plaque à 6 puits).
6. Placez les cellules sous un microscope inversé et observer les colonies iPSC. L'apparition de trous dans les colonies et des frontières soulevées devrait devenir apparente dans les 2-5 min.
7. Aspirer soigneusement la solution EDTA de passages.
8. En utilisant une pipette de 10 ml, passer 4 ml de milieu E8 (si vous utilisez une plaque de 6 puits) sous haute pression directement dans chaque puits pour être repiquées.
9. Recueillir les touffes iPSC, et divisée en un nombre approprié de puits selon le rapport de division de 1: 8 à 1:12. Ne pas trop-pipette, que la désagrégation des amas de cellules entraînera faible viabilité.
10. Placer la plaque dans un incubateur, et basculer la plaque de va-et-vient et côte à côte plusieurs fois pour disperser les cellules.

5. Préparation du MEF et CSPi pour Tansfection

1. 48 heures avant la transfection, CSPi de passage à ~ 1: 6 en quatre ou plusieurs puits d'une matrice revêtu plaque de 6 puits membrane basale, de sorte qu'ils seront 70% de confluence dans deux jours.
2. Le lendemain, décongeler DR4 MEF MEF dans le milieu constitué de DMEM (glucose élevé) complété avec 10% de FBS et 1x MEM-NEAA.
3. Plate DR4 MEF en deux plats de 10 cm à 2 x 10 ~ ⁴ cellules / cm ² et incuber une nuit à 37 ° C.
4. Le jour de la transfection, changer MEF à E8 milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 30 min avant d'effectuer la transfection sur iPSCs.
5. Facultatif: Si l'analyse de cytométrie en flux de post-transfection CSPi est désiré, retirer une matrice-plaque revêtue de la membrane basale de 4 ° C et le lieu à la température ambiante.
6. Facultatif: 4 h avant la transfection, compléter pré-transfection de la culture avec COPSi Y-27632 à la concentration finale de 10 uM.

6. brise-cellule de dissociation de traitement réactif Ae transfection de CSPi l'aide d'un système d'électroporation

1. Retirer P3 solution de transfection de cellules primaires de 4 ° C et lui permettre de revenir à la température ambiante pendant ~ 30 min. Ajouter la totalité du supplément de 100 ul de la solution de transfection avant utilisation.
2. Douce et chaude cellules réactif de dissociation dans un bain d'eau à 37 C °.
3. Obtenir AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 et PZT-AAVS1-R1) et AAVS1-CAG-EGFP donateurs de -20 ° C.
4. Retirer CSPi de l'incubateur et laver une fois avec du DPBS.
5. Ajouter 1 ml de douce-cellulaire réactif de dissociation par puits, et incuber CSPi à 37 ° C pendant 5 minutes, ou jusqu'à ce que plus de 50% des cellules ont dissocié du récipient de culture.
6. Introduire à la pipette les cellules de haut en bas à quelques reprises à l'aide d'une pipette de p1000 de dissocier toutes les cellules restantes de la cuve de culture, et de briser les mottes iPSC.
7. Ajouter 2 ml de milieu E8 à chaque puits, et pipette de haut en bas plusieurs fois en utilisant une pipette de 10 ml à Fürther désagréger amas de cellules en cellules individuelles
   NOTE: L'efficacité de transfection diminue significativement si des agrégats cellulaires ne sont pas suffisamment désagrégées.
8. Recueillir iPSCs dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 100 g pendant 3 min.
9. Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans une quantité minimale de milieu E8.
10. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre après application d'un colorant vital tel que 0,4% de bleu trypan. Veiller à ce que les cellules sont suffisamment dissociées en comptant (1-3 cellules par "bouquet").
11. Distribuer 3 x 10 ⁶ cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 ml, et centrifuger à nouveau à 100 g pendant 3 min.
    NOTE: centrifugation à basse vitesse réduit le stress cellulaire et permet facilement remise en suspension des CSPi avant électroporation.
12. Réglez le système d'électroporation au programme spécifique de type cellulaire pour la embryonnaires lignée de cellules souches humaines H9 (Programme CB-150).
13. Après centrifugation, aspirer le surnageant de la cell pellets. Pour une pastille, ajouter 10 ug du donneur de RH comme échantillon témoin. Pour ajouter l'autre pastille 10 pg du donneur d'HR, avec 5 pg de chaque TALEN (PZT-AAVS1 et PZT-L1-R1-AAVS1) comme échantillon expérimental.
14. Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 100 pi de solution de transfection de cellules primaires P3, et la transfère dans une cuvette.
15. Effectuer la transfection et ajouter immédiatement 500 ul de milieu de E8 de la température ambiante à chaque cuvette.
16. Transférer le CSPi goutte à goutte transfectées à une boîte de 10 cm contenant MEF DR4 préparés à l'étape 5.4.
17. Facultatif: ajouter quelques gouttes de chaque expérience dans un puits d'une matrice revêtue plaque à 6 puits membrane basale si ANALYSES cytométrie de flux de l'efficacité de transfection est souhaitée.
18. Répétez les étapes 6.15 à 6.17 pour finir les deux échantillons. Le lendemain, laver les cellules avec du DPBS deux fois et basculer milieu de culture pour NutriStem, qui semble soutenir la culture iPSC sur les départs mieux que E8.
19. Transient pics d'expression de EGFP dans les 48 à 72 heures après la transfection; évaluer l'efficacité de transfection comme vous le souhaitez.

7. puromycine Sélection des CSPi ciblés

1. Début sélection puromycine 72 heures après transfection lorsque les CSPi atteignent 70% de confluence.
2. Pour NCRM5 CSPi, commencer la sélection de la puromycine à 0,5 pg / ml de puromycine (1/2 de la dose complète) dilué dans un milieu de culture NutriStem. La concentration optimale de la puromycine peut varier de 0,25 à 1 ug / mIL pour certaines lignes iPSC.
3. CSPi de la culture dans NutriStem + 0,5 pg / ml de puromycine pendant 3 jours, le milieu rafraîchissantes quotidienne.
4. Après 3 jours, augmenter la concentration de la puromycine à 1 ug / ml.
5. CSPi de Culture de moins de 1 ug / ml de sélection puromycine pendant 7-8 jours, ou jusqu'à colonies distinctes apparaissent assez grand pour la cueillette colonie.

8. prélèvement de colonie et expansion des CSPi ciblées

1. Utilisez membrane basalematrice pour revêtir une plaque de 96 puits en distribuant 50 ul d'une solution de revêtement de la matrice de membrane basale (2 mg matrice de membrane basale dilué dans 12 ml de DMEM / F12) dans chaque puits. Conservez la plaque à 4 ° C pendant la nuit avant de l'utiliser.
2. Après avoir laissé la plaque de matrice revêtu membrane basale à venir à la température ambiante, aspirer la matrice de la membrane basale et distribuer 100 pi E8 complété avec 10 uM Y-27632 dans chaque puits.
3. Placez un microscope inversé dans une enceinte de sécurité biologique, et vaporiser légèrement avec 70% EtOH à stériliser.
4. Tirez une pipette Pasteur en verre au-dessus d'un bec Bunsen pour obtenir un outil colonie cueillette idéal qui a un «crochet» minuscule à la pointe. Stériliser avec EtOH à 70%, et le placer dans la hotte pour sécher.
5. Retirer le plat contenant colonies iPSC ciblées de l'incubateur, et la placer dans la hotte sous le microscope.
6. Choisissez CSPi en traçant un cercle autour de la frontière de la colonie avec l'outil de la colonie-picking.
7. Utilisez le «crochet» de l'outil colonie-cueillette à gratter délicatement et retirez la colonie iPSC de la surface de la plaque. Pour les grandes colonies, dessinant un X avec l'outil de la colonie-picking à la colonie trimestre facilitera la croissance des cellules après re-placage.
8. Une fois amas de cellules sont détachées et flottant librement, utiliser une pipette de p200 mis à ~ 30 pi de recueillir les CSPi. cellules de la plaque directement dans la plaque à 96 puits.
9. En option: utiliser une pipette de p20 mis à ~ 5 pi de recueillir les CSPi dans un tube Eppendorf, puis ajouter 50 ul douce cellules réactif de dissociation à digérer pendant 5 min à 37 ° C. Après digestion, ajouter 500 pi de milieu E8 dans le tube Eppendorf pour diluer le réactif de dissociation douce cellules et centrifuger les cellules à 200 xg dans une microcentrifugeuse de table standard pour 5 min. Puis aspirer plus du milieu et de laisser ~ 30 pi Pour resuspendre et transférer les cellules dans la plaque 96 puits.
   NOTE: Ceapproche facilitera la dissociation de la touffe de la cellule et l'expansion rapide de colonie ramassé.
10. Continuer colonie cueillette jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de colonies iPSC ont été collectées (environ 20 à 30 colonies par expérience est recommandé).
11. Après prélèvement de colonie, placer la plaque 96 puits dans un incubateur pendant la nuit. Rafraîchir avec un milieu complet de E8 le lendemain, et la culture jusqu'à ~ 70% de confluence.
12. cellules de passage de la 96 puits dans un 24 puits, puis dans un 6 puits, comme décrit dans les étapes 4.5 à 4.10.
    NOTE: les volumes de solution d'EDTA et E8 milieu devraient être proportionnellement réduite lors de l'utilisation de plus petites que les puits d'une plaque à 6 puits.
13. Évaluer ciblage succès en jonction PCR et l'analyse par transfert de Southern pour confirmer l'intégration de la cassette ciblée et l'absence de vecteurs insérées au hasard ^16.

Résultats

Une visualisation du protocole est fourni à la figure 2, avec des périodes au cours de laquelle CSPi sont cultivées dans un milieu différent, mis en évidence par soit vert pour E8 ou bleu pour NutriStem. Il est important pour la transfection seulement CSPi de haute qualité; examiner les boîtes de culture tout au long de l'entretien de routine et de vérifier que les cultures iPSC contiennent des colonies distinctes portant principalement une morphologie pavée comme (figure 3A);

Discussion

Les étapes les plus critiques pour la génération réussie de AAVS1 Coffre-port ciblées CSPi humaines sont: (1) délivrant efficacement Talen et donateurs plasmides dans CSPi par transfection; (2) optimiser la dissociation des CSPi dans des cellules individuelles avant la transfection et le placage densité après transfection; (3) l'optimisation dose et l'heure de la drogue sélection basée sur la croissance de la ligne iPSC; (4) disséquant soigneusement et choisir colonies ciblées et le transfert à la n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Store at -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061