Трансфекцию, Селекция, и колонии-сбор человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Тален ориентированные с GFP гена в AAVS1 Safe Harbor

Резюме

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Аннотация

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Введение

Возможность перепрограммирования соматических клеток человека в клеточных как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эмбриональных стволовых (ИПСК) был впервые обнаружен Такахаши и др. В 2007 ^1. Фибробласты человека кожные трансдуцированные ретровирусы выражения четыре фактора транскрипции (так окрестили Яманака факторы Oct3 / 4, Sox2, с-Мус и Klf4) было показано, что очень похожи на человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на основе морфологии, пролиферации, экспрессии генов и эпигенетическом статуса; важно, иПСК также способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков ^1. Пролиферативный потенциал и дифференциация мощность ИПСК делает их очень привлекательными инструментами; перепрограммирования клетки от пациентов, страдающих от конкретных заболеваний, иПСК могут быть использованы как в качестве ин витро модели болезни систем и в качестве потенциальных терапевтических.

Для последней цели, некоторые вопросы должны быть решены до полного потенциала ИПСКв клинической практике может быть реализован; онкогенными потенциал в пробирке, культивируемых ЭСК и ИПСК, использование ксеногенным производных во время перепрограммирования и обслуживания клетки, и необходимость отслеживать пересаженных клеток в естественных условиях все важные препятствия для клинического применения плюрипотентных стволовых клеток (обзор Hentze соавторами. ^2). Идеальное решение о необходимости отслеживания дифференцированных клеток после трансплантации будет включать визуально обнаруживаемый маркер, который устойчив к звукоизоляции, а также пестрота, независимо от приложения. Прочная и устойчивая выражение интегрированных генов являются наиболее легко достижимо, когда экзогенная ДНК вводят в безопасной гавани локусов; то есть, геномные сайты, которые позволяют достаточно транскрипцию интегрированного вектора и в то же время, смягчающего возмущения выражения в соседних генов ^3. Один из таких сайтов, который был очень хорошо характеризует с момента его открытия в том, аденоассоциированный вирус Integrвания сайт 1 (AAVS1), в первом интроне белка фосфатазы 1 регуляторная субъединица 12С (PPP1R12C) гена. Этот локус, как было показано не только позволяют поддерживать и надежный выражение комплексных трансгенов с помощью расширенного времени в культуре и в пробирке дифференциации ^3, но также и для защиты окружающей гены транскрипции возмущения ^4; обе функции, как считается, из-за присутствия эндогенных хроматина элементов диэлектрик, фланкирующих AAVS1 сайт ^5.

Достижения в геном технических средств Только за последнее десятилетие значительно облегчило легкость и эффективность, с которой генетические манипуляции в любой тип клеток может быть достигнута. В то время как ранние успешные эксперименты опиралась на чрезвычайно низкие уровни эндогенного гомологичной рекомбинации (HR) с введенной донора для достижения ген ориентации в ESCs ^6,7, использование конкретных участков нуклеаз, таких как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), которые СИГВВПficantly вызвать гомологичной рекомбинации через поколения перерыва двухцепочечной ДНК значительно повысило эффективность таких экспериментов ^8,9. Повторное использование обоих транскрипционных активаторов, как эффекторов (сказок) растительного патогенного Ксанфомонас родов и прокариотических кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторов (CRISPR) / Cas9 система в эффективные дизайнерские нуклеаз сайт-специфических сделал генного таргетинга в плюрипотентных стволовых клеток доступны и практически методология ^10-13.

Недавняя статья описано эффективный способ для стабильной интеграции зеленого флуоресцентного репортера кассеты в AAVS1 безопасной гавани локуса человека ИПСК с помощью Сказка нуклеазы (Таленс) ^14. Эти целевые иПСК сохранили свою флуоресценцию даже после направленной дифференцировки в кардиомиоциты и трансплантации в мышиной модели инфаркта миокарда (ИМ), обеспечивая убедительные доказательства полезности такихстабильно люминесцентные плюрипотентные стволовые клетки ^14. Чтобы получить целевые колонии, метод гена-ловушка была использована в котором сплайсинга-акцептор (SA), 2А саморасщепляющиеся пептидную последовательность помещает пуромицин N-ацетил-трансферазы (PAC), ген под контролем эндогенного промотора PPP1R12C; Таким образом, только иПСК, которые включили донора ДНК в локусе AAVS1 выразить PAC, делая их доступными для на основе пуромицину сопротивления; (Рисунок 1, ^15). Подробнее Этот протокол процедуры генерации AAVS1-GFP иПСК сообщили в недавней работе ^14, в том числе процесс трансфекции ИПСК с Talens и 9,8 кб донора интеграции фрагмент 4.2kb ДНК в AAVS1 безопасной гавани локуса, выбрав ИПСК на основе пуромицину сопротивление, и сбор колонии для клональной экспансии. Методики, описанные в данном документе, могут быть применены ко многим генома инженерных экспериментов.

протокол

1. Подготовка базальной мембраны Матрицы и покрытие Пластик

1. Поместите замороженные базальной мембраны матрицу запас от -20 & deg; С на лед и оттаивают в течение ночи при 4 ° С.
2. После оттаивания, пипетки 2 мг аликвоты базальной мембраны матрицы в предварительно охлажденные пробирки Эппендорфа. Храните их на -20 ° C до необходимости.
3. Чтобы подготовить матричные покрытием пластин базальной мембраны, не таять одну аликвоту на льду до последнего куска льда в пробирку Эппендорф исчезает (обычно в течение ~ 2 ч).
4. После оттаивания, добавить базальной мембраны матрицу 12 мл холодного (4 ° С) DMEM / F12, чтобы базальной мембраны раствора матрицы покрытия.
5. Добавить матричного раствора, базальной мембраны в соответствующей культуральной судна. Для 6-луночный планшет с, обойтись 1 мл на лунку. Вихревой пластину, чтобы убедиться, матрица решений базальная мембрана полностью покрывает каждую лунку.
6. Парафильмом запечатать базальной мембраны матрицы покрытием пластин / блюдо, и инкубировать при Роом температуре в течение 1 часа перед использованием. Кроме того, матричные пластинок, покрытых магазин базальной мембраны / блюда в 4 ° С и использовать в течение 2 недель покрытием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте экстра DMEM / F12 с базальной мембраной матрицы покрытием пластины / блюдо, чтобы предотвратить высыхание. Перед использованием 4 ° C хранить базальной мембраны матрицы покрытием пластин / блюдо, поместите его в кабинете биологической безопасности и дать ему нагреться до комнатной температуры в течение по крайней мере 30 мин.
7. Аспирируйте базальной мембраны матрица полностью перед добавлением среды и клеток.

2. Подготовка E8 среды

1. Подготовка E8 культуральной среды путем оттаивания E8 добавки в течение ночи при 4 ° С.
2. Удалить 10 мл E8 базальной среде со склада 500 мл и выбросить.
3. Внесите всю 10 мл флакон E8 дополнения непосредственно в 490 мл E8 базальной среде. Не теплый полный E8 среду на водяной бане 37 ° C, а повторные колебания температуры могут ухудшить bFGF в КомплексыTE E8 средой.
4. Используйте полный E8 среды в течение 2 недель добавлением добавки.

3. Таяние ИПСК

1. Снимите флакон замороженных ИПСК из жидкого азота и место на сухом льду.
2. Быстро разморозить флакона в водяную баню при 37 ° С; не взболтать флакон в водяной бане, пока только небольшой фрагмент льда останков.
3. Спрей флакон с 70% этанола и трансфер в кабинете биологической безопасности.
4. Добавить 1 мл каплям при комнатной температуре E8 среднего непосредственно в ампулу.
5. Использование 2 мл пипетки, передавать по каплям клеточной суспензии в 9 мл среды E8 в 15 мл коническую трубку. Вихревой трубки часто, чтобы гарантировать, что клетки и среду хорошо перемешать быстро.
6. Центрифуга клетки при 200 х г в течение 5 мин.
7. Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632.
8. Добавить клеток с соответствующим числом подвале MEMBRANе матрица-лунок, и место в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение ночи. Рекомендуется к пластине по меньшей мере 0,2 х 10 ⁶ IPSC на лунку 6-луночный планшет для того, чтобы в быстром восстановлении после оттаивания.

4. Техническое обслуживание и текущий пассажи из ИПСК

1. Обновить E8 среды ежедневно.
2. Следить за морфологию и слияния клеток с помощью инвертированного микроскопа. иПСК высокого качества растут в плоских колоний с различными границ; отдельные колонии обладают "булыжника" вида.
3. Прохождение клетки ИПСК когда они достигают ~ 70% слияния.
4. Подготовка решения ЭДТА пассажи, добавив 0,9 г NaCl и 500 мкл 0,5 М ЭДТА до 500 мл DPBS. Все хорошо перемешать, чтобы растворить NaCl, и вакуумный фильтр для стерилизации. Теплый аликвоту пассирования раствора в 37 ° С водяной бане до пассажей.
5. Для прохода, аспирации провел культуральной среды и промыть клетки один раз равным объемом теплой парованных решение. Аспирируйте и пипетки достаточно ЭДТА пассирования раствор для покрытия ячейки (1 мл на лунку 6-луночного планшета).
6. Поместите клетки под инвертированным микроскопом и наблюдать колонии IPSC. Появление отверстия в колониях и привлеченных границ должно стать очевидным, в 2 до 5 мин.
7. Тщательно аспирата ЭДТА пассажи решение.
8. Использование 10 мл пипетки, обойтись 4 мл среды E8 (при использовании 6-луночный планшет) под высоким давлением непосредственно в каждую лунку, чтобы быть пассировать.
9. Соберите сгустки IPSC, и группа распалась на соответствующее число скважин в зависимости от соотношения отколовшихся от 1: 8 до 1:12. Не слишком пипетки, а разбивка скопления клеток может привести к ухудшению жизнеспособности.
10. Поместите пластину в инкубаторе, и рок пластину обратно и вперед и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки.

5. Подготовка MEFs и ИПСК для Tansfection

1. 48 ч до transfectioN, прохождение иПСК при ~ 1: 6 в четырех или более лунки базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночного планшета, так, что они будут 70% сливной два дня, следовательно.
2. На следующий день, оттаивают DR4 MEFs в MEF среды, состоящей из DMEM с высоким содержанием глюкозы () с добавлением 10% FBS и 1x-MEM NEAA.
3. Пластина DR4 MEFs на две 10-см чашки при ~ 2 х 10 ⁴ клеток / см ² и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
4. В день трансфекции MEF изменить среду Е8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 30 минут, прежде чем выполнять трансфекцию на ИПСК.
5. Необязательно: Если проточной цитометрии анализ ИПСК после трансфекции желательно, удалить базальной мембраны матрицы покрытием плиту от 4 ° C и место при комнатной температуре.
6. Дополнительно: 4 ч до трансфекции, в дополнение предварительно трансфекции Ipsc культуру с Y-27632 в конечной концентрации 10 мкМ.

6. нежно-клеточной диссоциации реагента Леченией Трансфекцию ИПСК с помощью электропорации системы

1. Удалить P3 первичной решение трансфекции клеток от 4 ° C и дайте ему нагреться до комнатной температуре в течение ~ 30 мин. Добавить весь 100 мкл дополнение к трансфекции раствора перед применением.
2. Теплый нежно-диссоциации клеток реагент в C на водяной бане 37 °.
3. Получить AAVS1 Talens (ЦТС-AAVS1-L1 и ЦТС-AAVS1-R1) и AAVS1-CAG-EGFP донора от -20 ° C.
4. Удалить ИПСК из инкубатора и промыть один раз DPBS.
5. Добавить 1 мл нежно-клеточной диссоциации реагента в каждую лунку, и инкубировали ИПСК при 37 ° С в течение 5 мин, или до более чем 50% клеток не отделены от культурального сосуда.
6. Пипетки клетки вверх и вниз несколько раз с использованием пипетки P1000, чтобы отделить все оставшиеся клетки из культурального сосуда, и чтобы разбить комки Ipsc.
7. Добавить 2 мл E8 среды в каждую лунку, и пипеток вверх и вниз несколько раз с помощью 10 мл пипетки Фюртэ разбить скопления клеток в одиночных камерах
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансфекции значительно снижается, если скопления клеток не являются достаточно разбивки.
8. Сбор ИПСК в 15 мл коническую трубку, и центрифуге при 100 мкг в течение 3 мин.
9. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в минимальном количестве E8 среды.
10. Граф клеток с использованием гемоцитометра после применения витальной окраски, например, 0,4% трипановым синим. Убедитесь, что клетки достаточно диссоциируют при подсчете (1-3 клеток в "комок").
11. Не включать 3 × 10 ⁶ клеток в каждую из двух 15 мл конические пробирки и снова вращаться при 100 х г в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая скорость центрифугирования уменьшает стресс клеток и позволяет легко ресуспензию ИПСК до электропорации.
12. Установите систему электропорации в конкретной программе камерного типа для эмбриона человека линии стволовых клеток H9 (Программа CB-150).
13. После центрифугирования супернатант аспирата из CELл гранулы. С одной таблеткой, добавить 10 мкг HR донора в контрольном образце. Для другой гранулы добавляют 10 мкг HR донора, а также 5 мкг каждого Тален (PZT-AAVS1-L1 и PZT-AAVS1-R1) в экспериментальном образце.
14. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 100 мкл Р3 первичной трансфекции клеток раствором и передачи в кювету.
15. Выполните трансфекции и сразу же добавить 500 мкл комнатной температуры E8 среды в каждую кювету.
16. Передача по каплям трансфицированную ИПСК к одному 10-см блюдо с DR4 MEFs, полученного на стадии 5.4.
17. Дополнительно: Добавить несколько капель из каждого эксперимента в одну лунку в базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночный планшет, если проточной цитометрии Анализ на эффективность трансфекции желательно.
18. Повторите шаги 6.15-6.17 закончить как образцы. На следующий день, мыть клетки с DPBS в два раза и перейти культуральной среды NutriStem, который, кажется, поддерживает IPSC культуру на фидерах лучше, чем E8.
19. Трansient пики экспрессии EGFP в 48 до 72 ч после трансфекции; оценить эффективность трансфекции по желанию.

7. Пуромицин Выбор целевых ИПСК

1. Начните выделение на Пуромицин 72 ч после трансфекции, когда иПСК до 70% слияния.
2. Для NCRM5 ИПСК, начинают отбор пуромицин на 0,5 мкг / мл пуромицин (1/2 полной дозы) разведенной в NutriStem культуральной среде. Оптимальная концентрация пуромицин может варьироваться от 0,25 до 1 мкг / MLL для некоторых линий ИПСК.
3. Культура иПСК в NutriStem + 0,5 мкг / мл пуромицин в течение 3 дней, ежедневно прохладительные среды.
4. После 3-х дней, увеличивают концентрацию пуромицин до 1 мкг / мл.
5. Культура иПСК до 1 мкг / мл пуромицин отбора еще 7 до 8 дней, или до тех пор, отдельные колонии не оказаться достаточно большой для колонии сбора.

8. колонии Выбор и расширение целевых ИПСК

1. Использование базальной мембраныМатрица, чтобы покрыть 96-луночный планшет с дозирования 50 мкл раствора базальной мембраны матрицы покрытия (2 мг базальной мембраны разбавляют в матрице 12 мл DMEM / F12) в каждую лунку. Хранить пластины при 4 ° С в течение ночи перед использованием.
2. После того матрица покрытием пластины базальной мембраны до комнатной температуры, аспирация базальной мембраны матрицу и внесите 100 мкл E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 в каждую лунку.
3. Разместить инвертированного микроскопа в кабинете биологической безопасности, и брызги слегка с 70% этанола для стерилизации.
4. Вытяните стекло пипетки Пастера над горелкой Бунзена, чтобы получить идеальный инструмент колонии-сбор, который имеет крошечный "крюк" на кончике. Стерилизовать 70% этанола, и поместите в капюшоне, чтобы высохнуть.
5. Снимите блюдо, содержащее целевые колонии IPSC из инкубатора, и поместите в капот под микроскопом.
6. Выберите ИПСК, прослеживая круг вокруг колонии границы с колонии-сбор инструмента.
7. Используйте "крюк" инструмента колонии-сбор мягко очистить и удалить колонию IPSC от поверхности пластины. Для больших колоний, проводя X с колонии-сбор инструмента в квартале колония будет способствовать росту клеток после повторного посева.
8. После того, как скопления клеток отделяются и свободно плавающий, использовать P200 пипеткой установить на ~ 30 мкл для сбора ИПСК. Пластина клеток непосредственно в 96-луночного планшета.
9. Дополнительно: использовать P20 пипетки установлен на ~ 5 мкл для сбора ИПСК в пробирку Эппендорфа, затем добавить 50 мкл нежно-клеточной диссоциации реагента усваивается в течение 5 мин при 37 ° С. После расщепления, добавить 500 мкл E8 среды в пробирку Эппендорфа, чтобы разбавить диссоциации реагента нежно-клеток и замедления вращения клеток при 200 мкг в стандартной настольной микроцентрифуге в течение 5 мин. Тогда аспирации большую часть среды и оставить ~ 30 мкл для ресуспендирования и передачи клеток в 96-луночный планшет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ЭтоПодход будет способствовать диссоциацию клеток скопления и быстрого расширения подобрали колонии.
10. Продолжить колонии комплектование до достаточное количество колоний ИПСК не были собраны (примерно 20-30 колоний на эксперимента рекомендуется).
11. После колонии сбора, поместите 96-луночного планшета в инкубаторе в течение ночи. Обновить с полной E8 среде следующий день, и культуры до ~ 70% сливной.
12. Прохождение клетки от 96-луночного в 24-и, а затем в 6-ну, как описано в шагах 4.5-4.10.
    Примечание: объемы раствора ЭДТА и E8 среды должна быть пропорционально уменьшена при использовании скважин меньше, чем 6-луночный планшет с.
13. Оценка адресности слиянием ПЦР и Южной блот-анализа для подтверждения направленной интеграции кассету и отсутствию случайно вставленными векторов ^16.

Результаты

Визуализация протокола, представленный на рис 2, с периодами, в течение которого иПСК культивируют в другую среду, выделенную либо зеленый E8 или синий для NutriStem. Важно трансфекции только высококачественные ИПСК; изучить культуру кухни в течение планового технического обслужив...

Обсуждение

Наиболее важные шаги для успешного поколения AAVS1 безопасной гавани нацелены человека иПСК являются: (1) эффективной доставки Тален и донорские плазмиды в ИПСК с помощью трансфекции; (2) оптимизация диссоциации ИПСК в одиночные клетки до трансфекции и покрытия плотностью после трансфекц...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS/DESCRIPTION
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL	Corning	354230	Store at -20°C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4°C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4°C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061