Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Resumo

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Resumo

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Introdução

A capacidade de reprogramar células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas semelhantes a células-tronco embrionárias (iPSCs) foi descoberto pela primeira vez por Takahashi et al., Em 2007 ^1. Fibroblastos dérmicos humanos transduzidas com retrovírus expressando quatro fatores de transcrição (The Yamanaka assim apelidado fatores OCT3 / 4, Sox2, foram mostradas c-Myc, e KLF4) ser altamente semelhante às células estaminais embrionárias humanas (hESCs) com base na morfologia, a proliferação, a expressão do gene, e estado epigenética; crucialmente, iPSCs também são capazes de se diferenciarem em células de todas as três camadas germinais ^1. A capacidade potencial e diferenciação proliferativa das iPSCs torna ferramentas muito atraentes; reprogramando as células de pacientes que sofrem de doenças específicas, iPSCs pode ser utilizado tanto como em sistemas modelo in vitro da doença e como potenciais agentes terapêuticos.

Para este último efeito, várias questões devem ser abordadas antes de todo o potencial das iPSCsem um ambiente clínico pode ser realizado; o potencial tumorigénico de hESCs cultivadas in vitro e iPSCs, o uso de derivados de xenogénicas durante reprogramação e manutenção de células, e a necessidade de rastrear células transplantadas in vivo de todos os obstáculos cruciais para a aplicação clínica de células estaminais pluripotentes (Avaliado por Hentze et al. ^2). Uma solução ideal para a necessidade de rastrear células diferenciadas pós-transplante envolveria um marcador visualmente detectável que resiste ao silenciamento e variegação, independentemente da aplicação. Expressão robusta e sustentada de transgenes integrados é o mais prontamente possível quando DNA exógeno é introduzido no porto seguro loci; isto é, locais genómicos que permitem a transcrição de um vector suficiente integrado, enquanto ao mesmo tempo atenuar as perturbações de expressão de genes vizinhos ^3. Um tal local que tem sido muito bem caracterizada, desde a sua descoberta, é a integr vírus adeno-associadoção local 1 (AAVS1), no primeiro intrão 1 do regulador 12C subunidade (PPP1R12C) do gene da proteína fosfatase. Este local foi mostrado não só para permitir sustentada e expressão robusta de transgenes integrados através do tempo estendido na cultura e na diferenciação vitro ^3, mas também para proteger circundante genes de perturbação da transcrição ^4; ambas as características são provavelmente devido à presença de elementos isoladores de cromatina endógenas que flanqueiam o local AAVS1 ^5.

Os avanços na engenharia ferramentas genoma durante apenas a última década, têm muito facilitada a facilidade e eficiência com que as manipulações genéticas em qualquer tipo de célula pode ser conseguido. Embora experiências bem sucedidas iniciais invocado extremamente baixos níveis de recombinação homóloga endógena (RH) com um doador introduzidas para se abordagem selectiva de genes em ^6,7 CES, o uso de nucleases específicas do local, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs), que signivamente induzir a recombinação homóloga através da geração de uma quebra de cadeia dupla de DNA tem aumentado consideravelmente a eficiência de tais experiências ^8,9. O reaproveitamento de ambos os ativadores de transcrição-como efetoras (contos) da planta patogênica xanthomonas gêneros e os procariotas cluster regularmente interspaced repete palindrômicas curtas (CRISPR) system / Cas9 em eficientes nucleases grife específicas do local fez gene alvo em células-tronco pluripotentes uma acessível e metodologia praticável ^10-13.

Um artigo recente descreveu um método eficiente para a integração estável de uma cassete repórter fluorescente no AAVS1 porto seguro locus iPSCs humanos utilizando nucleases Tale (TALENS) ^14. Essas iPSCs direcionados mantiveram sua fluorescência mesmo após a diferenciação direcionado para cardiomiócitos e transplante em um modelo de rato de infarto do miocárdio (MI), proporcionando uma forte evidência para a utilidade de talestavelmente células estaminais pluripotentes fluorescente ^14. Para obter colónias específicas, um método gene armadilha foi utilizado em que um aceitador de splicing (SA), 2A sequência do péptido de auto-clivagem coloca a puromicina N-acetil-transferase gene (PAC) sob o controlo do promotor endógeno PPP1R12C; assim, apenas iPSCs que tenham incorporado o ADN dador no locus AAVS1 expressar PAC, tornando-os selecionáveis ​​baseado em puromicina-resistência; (Figura 1, ^15). Este protocolo detalha os procedimentos de geração de AAVS1-GFP iPSCs relatado no recente documento ^14, incluindo o processo de transfecção de iPSCs com TALENS e um doador de 9,8 kb para integrar um fragmento de DNA 4.2kb no locus AAVS1 porto seguro, a seleção de iPSCs com base em picking colônias para a expansão clonal �puromicina-resistência, e. As técnicas aqui descritas podem ser aplicadas a diversos experimentos de engenharia genoma.

Protocolo

1. Preparação da Membrana Basal Matrix e Revestimento de Plasticware

1. Colocar a membrana basal estoque matriz congelada de -20 ° C em gelo e descongelar durante a noite a 4 ° C.
2. Após o descongelamento, pipeta 2 mg alíquotas de matriz da membrana basal em tubos Eppendorf de pré-refrigerados. Armazenar estes a -20 ° C até ser necessário.
3. Para preparar placas revestidas com matriz da membrana basal, descongelar uma alíquota sobre o gelo até o último pedaço de gelo nas desaparece tubo eppendorf (geralmente dentro de ~ 2 horas).
4. Após a descongelação, adicionar matriz da membrana basal para 12 ml de frio (4 ° C) DMEM / F12 para fazer a solução de revestimento de matriz de membrana basal.
5. Adicionar solução de matriz da membrana basal para o recipiente de cultura apropriado. Para uma placa de 6 poços, dispensar 1 ml por poço. Agitar a placa para garantir que a solução de matriz membrana basal cobre completamente cada poço.
6. Parafilm selar a membrana basal revestida de matriz placa / prato, e incubar a room temperatura durante 1 hora antes da utilização. Alternativamente, placas revestidas com matriz da membrana basal store / pratos a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas de revestimento.
   NOTA: Adicionar DMEM adicional / F12 para a membrana basal revestida de matriz placa / recipiente para evitar a secagem. Antes de usar 4 ° C membrana basal armazenado revestido de matriz placa / prato, coloque-o em uma cabine de segurança biológica e deixe-o voltar à temperatura ambiente por pelo menos 30 min.
7. Aspirar matriz da membrana basal completamente antes da adição de meio e células.

2. Preparação de meio E8

1. Prepare E8 meio de cultura por degelo suplemento E8 durante a noite a 4 ° C.
2. Retirar 10 ml de E8 meio basal do estoque de 500 ml e descarte.
3. Pipeta todo o frasco de 10 ml de suplemento E8 diretamente em 490 ml de E8 meio basal. Do meio E8 completa não quente em um banho de água a 37 ° C, como flutuações de temperatura repetidas pode degradar a bFGF no complemédio te E8.
4. Use meio E8 completa dentro de 2 semanas de adição do suplemento.

3. O descongelamento de iPSCs

1. Retire um frasco de iPSCs congelados de nitrogênio líquido e colocar no gelo seco.
2. Descongelar rapidamente o frasco num banho de água a 37 ° C; agite o frasco em banho-maria até que apenas um pequeno fragmento de restos de gelo.
3. Pulverizar o frasco com etanol 70% e transferência para uma cabine de segurança biológica.
4. Adicionar 1 ml da temperatura ambiente, gota a gota E8 forma directamente para o frasco.
5. Usando uma pipeta de 2 ml, gota a gota, transferir a suspensão de células em 9 ml de meio E8 em um tubo de 15 ml. Agitar o tubo de frequência para garantir que as células e o meio de misturar bem rapidamente.
6. Centrifuga-se as células a 200 xg durante 5 min.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de E8 suplementado com 10 uM Y-27632.
8. Adicionar as células a um número apropriado de porão membranpoços e revestido matriz, e coloque em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2 durante a noite. Recomenda-se para a chapa, pelo menos, 0,2 x 10 ⁶ iPSC por poço de uma placa de 6 poços para permitir a recuperação rápida após a descongelação.

4. Manutenção e Passaging Rotina de iPSCs

1. Refresque médio E8 diária.
2. Monitorar a morfologia e de confluência de células com um microscópio invertido. iPSCs de alta qualidade crescer em colónias planas com aréolas distintas; colónias individuais possuem uma aparência de "paralelepípedos-like".
3. Passagem as células IPSCs quando atingem ~ 70% de confluência.
4. Prepara-se uma solução de EDTA passaging adicionando 0,9 g de NaCl e 500 ul de EDTA 0,5 M a 500 ml de DPBS. Misture bem para dissolver de NaCl, e filtra-se sob vácuo para esterilizar. Aquecer-se uma alíquota da solução em uma passagem em 37 ° C num banho de água, antes da passagem em.
5. Para passagem, aspirado de meio de cultura gasto e lave as células uma vez com um volume igual de pas quentessolução Saging. Aspirar, e pipeta de EDTA suficiente de solução para revestir as passagens em células (1 ml por poço de uma placa de 6 poços).
6. Coloque as células em um microscópio invertido e observar as colônias da IPSC. O aparecimento de buracos dentro de colônias e bordas elevadas devem se manifestar dentro de 2 a 5 min.
7. Aspirar cuidadosamente a solução EDTA passaging.
8. Utilizando uma pipeta de 10 ml, dispensar 4 ml de meio E8 (se usar uma placa de 6 poços), sob alta pressão directamente em cada cavidade a ser passadas.
9. Recolher os aglomerados IPSC, e dividida em um número adequado de poços, dependendo da razão de divisão de 1: 8 a 1:12. Não excesso de pipeta, como a desagregação de aglomerados de células resultará na viabilidade pobres.
10. Coloque a placa em uma incubadora, e balance a placa de volta-e-vem e lado-a-lado várias vezes para dispersar as células.

5. Preparação de MEFs e iPSCs para Tansfection

1. 48 horas antes da transfection, iPSCs passagem em ~ 1: 6 em quatro ou mais poços de uma membrana basal revestida de matriz placa de 6 poços, de modo que será de 70% confluentes, portanto, dois dias.
2. No dia seguinte, descongelar DR4 MEFs em meio MEF consistindo de DMEM (alto teor de glucose) suplementado com 10% de FBS e 1x MEM-NEAA.
3. Placa DR4 MEFs em duas placas de 10 cm a 2 x 10 ~ ⁴ células / ^cm2 e incubar durante a noite a 37 ° C.
4. No dia da transfecção, alterar forma MEF a E8 suplementado com 10 uM Y-27632 30 min antes de efectuar a transfecção em iPSCs.
5. Opcional: Se a análise de citometria de fluxo de iPSCs pós-transfecção é desejado, remover uma placa revestida com matriz de membrana basal a partir de 4 ° C e coloca à temperatura ambiente.
6. Opcional: 4 horas antes da transfecção, complementar pré-cultura iPSC transfecção com Y-27632 na concentração final de 10 uM.

6. delicado de células dissociação Reagente um tratamentond transfecção de iPSCs usando um sistema de electroporação

1. Remoção da solução primária P3 transfecção de células a partir de 4 ° C e deixar que esta atinja a temperatura ambiente durante ~ 30 min. Adicionar todo o suplemento de 100 ul para a solução de transfecção antes da utilização.
2. Reagente dissociação Warm-célula suave em um banho de água a 37 ° C.
3. Obter AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) e AAVS1-CAG-EGFP doador de -20 ° C.
4. Remover iPSCs da incubadora e lavar uma vez com DPBS.
5. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células por poço suave, e incubar iPSCs a 37 ° C durante 5 minutos, ou até maior do que 50% das células foram dissociadas a partir do vaso de cultura.
6. Pipeta as células para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta P1000 dissociar as células restantes a partir do vaso de cultura, e para quebrar aglomerados da IPSC.
7. Adicionar 2 ml de meio a cada poço E8, e pipeta cima e para baixo várias vezes, utilizando uma pipeta de 10 ml de Further desagregar aglomerados de células em células individuais
   NOTA: A eficiência de transfecção declina significativamente se aglomerados de células não são suficientemente desagregada.
8. Recolhe iPSCs em um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 100 xg durante 3 min.
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em uma quantidade mínima de meio E8.
10. Contar as células utilizando um hemocitómetro, após aplicação de um corante vital, tal como 0,4% de azul de Tripano. Certifique-se de que as células são suficientemente dissociado durante a contagem (1-3 células por "moita").
11. Dispensar 3 x 10 ⁶ células em cada um de dois tubos de 15 mL cónico, e girar para baixo outra vez a 100 xg durante 3 min.
    NOTA: centrifugação a baixa velocidade reduz o estresse celular e permite fácil re-suspensão de iPSCs antes eletroporação.
12. Ajuste o sistema de eletroporação para o programa específico para o tipo de célula para a linha de células-tronco embrionárias humanas H9 (Programa CB-150).
13. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante do cell peletes. Para uma pastilha, adicionam-se 10 ug do doador RH como amostra de controlo. Para o outro sedimento adicionar 10 ug do doador HR, juntamente com 5 ug de cada TALEN (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) como amostra experimental.
14. Ressuspender cada pelete de células em 100 ul de solução de transfecção de células primárias P3, e transferir para uma cuvete.
15. Realize a transfecção e imediatamente adicionar 500 mL de meio E8 temperatura ambiente em cada cubeta.
16. Transfira o iPSCs gota a gota a uma transf 10 cm prato contendo MEFs DR4 preparados no passo 5.4.
17. Opcional: Adicionar várias gotas de cada experiência para um poço de uma membrana basal revestida de matriz placa de 6 poços se citometria de fluxo anaylsis de eficiência de transfecção é desejado.
18. Repita os passos de 6,15-6,17 para terminar ambas as amostras. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com DPBS e alternar o meio de cultura para NutriStem, que parece apoiar cultura iPSC em alimentadores melhor do que E8.
19. Trpicos de expressão EGFP Ansient em 48-72 horas pós-transfecção; avaliar a eficiência de transfecção quanto desejado.

7. A puromicina Selecção de iPSCs alvejados

1. Comece a selecção de puromicina 72 h após a transfecção, quando as iPSCs alcançar 70% de confluência.
2. Para NCRM5 iPSCs, começam selecção puromicina a 0,5 ug / ml de puromicina (1/2 da dose completa) diluída em meio de cultura NutriStem. A concentração óptima pode variar puromicina 0,25-1 ug / MLL para algumas linhas de IPSC.
3. IPSCs Cultura em NutriStem + 0,5 ug / ml �puromicina durante 3 dias, refrescando o meio dia.
4. Após 3 dias, aumentar a concentração de puromicina a 1 ug / ml.
5. IPSCs Cultura nos termos de 1 mg / ml seleção �puromicina por mais 7-8 dias, ou até colônias distintas aparecem grande o suficiente para colônia de picking.

8. Colony Picking e Expansão das iPSCs Targeted

1. Membrana basal Usematriz para revestir uma placa de 96 poços por dispensar 50 ul de solução de revestimento de matriz de membrana basal (2 mg de matriz de membrana basal diluídos em 12 ml de DMEM / F12) para cada poço. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite antes da utilização.
2. Depois de se deixar a placa revestida com matriz de membrana basal para voltar à temperatura ambiente, aspirar a matriz da membrana basal e dispensar 100 ul E8 suplementado com 10 uM Y-27632 para cada poço.
3. Coloque um microscópio invertido em uma cabine de segurança biológica, e pulverizar levemente com etanol 70% para esterilizar.
4. Retire uma pipeta de Pasteur de vidro ao longo de um bico de Bunsen para obter uma ferramenta ideal colónia-colheita que tem um pequeno "gancho" na ponta. Esterilizar com etanol 70%, e coloque na capa para secar.
5. Remova a placa contendo as colónias IPSC orientadas a partir do incubador, e colocar dentro do capuz sob o microscópio.
6. Escolha iPSCs traçando um círculo em torno da fronteira colônia com a ferramenta de colheita colônia.
7. Usar o "gancho" da ferramenta colónia-colheita para raspar suavemente e remover a colónia iPSC da superfície da placa. Para grandes colônias, desenhando um X com a ferramenta de colheita colônia de trimestre a colônia irá facilitar o crescimento das células após a re-regulamentação.
8. Uma vez que aglomerados de células são separadas e livremente flutuante, use uma pipeta p200 definido para ~ 30 ul para recolher as iPSCs. Células directamente para a placa de 96 poços de placa.
9. Opcional: utilizar uma pipeta de p20 definida como ~ 5 mL para recolher as iPSCs para um tubo eppendorf, em seguida, adicionar 50 ul de reagente de dissociação de células suave para digerir durante 5 min a 37 ° C. Após a digestão, adicionar 500 ul meio E8 para dentro do tubo eppendorf para diluir o reagente de dissociação de célula suave e girar para baixo as células a 200 xg numa microcentrífuga de bancada padrão durante 5 min. Em seguida, aspirar a maior parte do meio e deixar ~ 30 ul para ressuspender as células e transferir para a placa de 96 poços.
   NOTA: Esteabordagem facilitará a dissociação do aglomerado de células e rápida expansão da colônia colhidos.
10. Continuar colónia colheita até que um número suficiente de colónias IPSC foram recolhidos (aproximadamente 20-30 colónias por experimento é recomendado).
11. Após a colheita de colónias, colocar a placa de 96 poços numa incubadora durante a noite. Refresque-se com meio completo E8 no dia seguinte, e da cultura até ~ 70% confluentes.
12. Células de passagem de 96 poços em um de 24 poços, em seguida, em um de 6 poços, como descrito nos passos 4,5-4,10.
    NOTA: os volumes de solução de EDTA e meio E8 deve ser proporcionalmente reduzida ao utilizar poços mais pequenos do que uma placa de 6 poços.
13. Avaliar segmentação sucesso por junção PCR e Southern blot para confirmar a integração cassete alvejado e ausência de vetores inseridas aleatoriamente ^16.

Resultados

A visualização do protocolo é fornecido na Figura 2, com períodos em que iPSCs são cultivados em meio diferente destaque por qualquer verde para E8 ou azul para NutriStem. É importante para transfectar apenas iPSCs de alta qualidade; examinar placas de cultura em toda a manutenção de rotina e verificar que as culturas IPSC conter colônias principalmente distintos portadores de uma morfologia de paralelepípedos-like (Figura 3A); células diferenciadas não deve ocupar mais do q...

Discussão

Os passos mais críticos para a geração bem sucedida de AAVS1 porto seguro alvejado iPSCs humanos são: (1) a entrega eficiente TALEN e doadores plasmídeos em iPSCs por transfecção; (2) optimização de dissociação iPSCs em células individuais antes da transfecção e chapeamento densidade após transfecção; (3) a optimização da dose e do tempo de selecção de droga com base no crescimento da linha iPSC; (4) cuidadosamente dissecar e escolhendo colônias direcionados e transferindo a nova placa / poço. Em ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Store at -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061