肺動脈性肺高血圧症の齧歯類モデルの血行動態特性評価

要約

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.

要約

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease.

Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.

概要

肺動脈高血圧症（PAH）の炎症性細胞浸潤、平滑筋の増殖および内皮細胞のアポトーシスに関連した肺血管系の疾患です。これらの変更は、その後、右心室（RV）機能不全と心不全につながる、肺動脈の閉塞につながります。 PAHにおけるPAHおよびRV障害の根底にある病態生理を理解するために、この病気を研究するための遺伝的および薬理学的モデルを含む異なるモデルの数は、（他の場所で^1,2件）が開発されています。

これらのモデルのうち、最も人気のあるラットにおける低酸素誘導マウスにおける（Hxの）PAHおよびモノクロタリン（MCT）およびSU5416-低酸素症（SuHx）モデルがあります。マウスHxのモデルでは、マウスは内側増殖の結果として開発して、（0.10のFIO2と18000フィートの高度に対応し、normobaricや低気圧のいずれか）、低酸素の4週間にさらされている、RVシステムオフラインを増加オリッチ圧力とRV肥大³の開発。その後、PAH ⁴の開発につながる不明な機構を介して肺の血管内皮細胞への傷害で60ミリグラム/キログラム結果の単回投与でMCT。 SU5416は、類似の病理学的変化と永続的な肺高血圧症における3週間の結果を得るために、慢性低酸素症への暴露に続いて60 10mg / kgの単回皮下注射で、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）1および2ブロッカーの阻害剤、および治療でありますそれに閉塞性血管病変⁵の形成と、ヒトの疾患で見られます。過去数年間では、肺高血圧のためのいくつかのトランスジェニックマウスモデルが開発されてきました。 BMPR2遺伝子変異がPAHの両方家族性および特発性の形態、ヘムオキシゲナーゼ-1ノックアウト及び（他^1,2レビュー）IL-6の過剰発現に見られるように、これらは、ノックアウトおよび骨形成タンパク質受容体2（BMPR2）の突然変異を含みます。

PHのこれらの異なるげっ歯類モデルは、肺高血圧症、右心室肥大および右室不全の異なるレベルを有します。低酸素症および様々なトランスジェニックマウスモデルは、ラットモデル¹のいずれよりもはるかに、より穏やかなPAHになるが、それは別の遺伝子変異の試験およびそれに関連する分子のシグナル伝達経路を可能にします。 MCTは、複数の組織⁴に内皮細胞に毒性があることが表示されますが、MCTのモデルは、重度のPAHにつながるん。 SuHxモデルは、血管によって特徴付けられる薬理学的操作と低酸素暴露の両方を必要とするが、ヒトでの特発性PAHで見られるものと類似変更されます。また、これらのモデルの全てにおいて、PAHの開発に関連した組織病理学的変化、肺動脈圧およびRV機能との間に断線があるかもしれません。これは、組織病理学的変化の間の比例関係が通常存在するヒト疾患、とは対照的にpulmonの重症度であり​​ます進高血圧とRVの障害の程度。このように、PHのこれらの齧歯類モデルの総合的な特性評価が必要であり、（心臓カテーテルによって）（典型的には、心エコー検査によって）RV機能の評価、血行動態および心臓の組織病理学および（組織採取）から肺を伴います。

このプロトコルでは、我々はラットとマウスにおけるPAHモデルの血行動態の特徴付けのために使用される基本的なテクニックについて説明します。これらの一般的な技術は、右心室と肺血管系のいずれの研究にも適用することができ、PAHのモデルに限定されるものではありません。心エコー検査によってRVの可視化ラットでは比較的簡単であるが、それらの大きさとRVの複雑な形状にマウスではより困難です。また、このようなTAPSE、肺動脈（PA）加速時間とPAドプラ波形のノッチとしてRV機能を定量化するために使用されるいくつかのサロゲートは、ヒトにおいて十分に検証されていないとPUの評価を弱くしか相関します侵襲的血行動態によるlmonary高血圧およびRV機能。インピーダンスカテーテルと開胸カテーテル法は、圧力 - 容積（PV）の決意を可能にするループし、より詳細な血行動態の特徴付けが、RVの血行動態の決意は最高のインスピレーションと負の胸腔内圧の効果を維持するために、クローズド胸で行われています。任意の手順と同様に、手続きの経験を開発することが実験的な成功に不可欠です。

プロトコル

記載されているすべての手順は、医学のデューク大学の動物のケアのガイドラインに従ってください。

1.前に手順を開始します

注：任意の動物の手続きの前に、適切な機関の許可が得られていることを確認してください。すべての手順と同じように、何の動物の苦痛がないことを保証するために、適切な鎮痛薬を使用します。

1. 開通性を確保するためにヘパリン化無菌食塩水（100 U / ml）でフラッシュカテーテル。マーク心臓から首の中間までの長さ（ラットとマウス用の2センチメートルのため約4センチ）に対するカテーテル同等の先端から点。
2. マウスまたはラットを麻酔。麻酔薬の選択肢はイソフルラン（誘導3から4パーセント、メンテナンス、100％の酸素と混合した1.5％）、ケタミン/キシラジン（80から120 / 10mg / kgの）およびペントバルビタール（40から80ミリグラム/キログラム）が挙げられる^6。
   1. 例えば、ケタミン：キシラジン（80から120ミリグラム/キログラム：マウスおよび80-100ミリグラム/キログラムのための10から16ミリグラム/キログラムIP：5〜10メートルラット用/ kgのIPグラム）、単回投与は、麻酔の20-50分間持続します。心エコー検査のために、イソフルラン（誘導3-4％、および保守のための1.5％）で、マウスやラットを麻酔。撤退の反射が存在しないことを確認するために、手術領域にげっ歯類をつまんで麻酔深度を評価します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を使用してください。
      注：異なる麻酔剤は、（他の場所⁶レビュー）適切な使用と最適化と信頼性の高い結果を得るために使用することができます。キシラジン：カテーテル挿入のための私達の好みは、ケタミンを使用することです。ケタミン/キシラジンとの過剰摂取は深く、心拍数および心機能を低下させることができるので、適切な温度と呼吸制御を維持することが重要です。マウスでの心拍数（> 400 /分）を維持するために、我々は日常的に二国間の迷走神経切断を行います。十分なものである、ここでケタミン/キシラジンの量は、通常、最後の20〜30分は、オープンまたはクローズド胸部心臓カテーテル法のいずれかが続いて実行します動物を安楽死させます。
3. 外科手術手順（ 図1）のために、ラット/マウスを準備します。
   1. 右の首に、胸（心エコー検査を可能にする）から、手術領域から毛を剃ります。
   2. 外側にベタジンを使用して、中心から円形の掃引で剃毛の外科領域をスクラブ、70％アルコール綿棒でクレンジングが続きます。
   3. 下に加温パッドを用いて外科的なプ​​ラットフォーム上で動物を置きます。 37から37.5℃の体温を維持するための加熱レベルを設定します。直腸プローブで体温を監視します。低体温症は、重要な頻脈の大幅な徐脈や温熱療法結果になることができます。

2.心エコー

注：げっ歯類の心エコー検査の完全な説明は、他の場所⁷に記載されています。マウスは、麻酔の前に、画像が目を覚まし、手動抑制動物に得ることができます。ラットについては、心エコー検査の前に、ラットとして好ましい麻酔が手動で）目を覚ましながら抑制することには大きすぎます。

1. 傍胸骨長軸（PLAX）を表示。
   1. プラットフォーム上で仰臥位で動物を配置するか、手動で拘束します。
   2. 2Dライブ画像を投影するためにBモードを選択します。
   3. 左胸骨傍のラインにラット用のマウスのための40 MHzまたは25 MHzの周波数で超音波トランスデューサを合わせ、トランスデューサは、プローブインジケータが尾側方向に向いて反時計回りに30度回転（5〜11時ライン位置） 。角度がわずかに（同じ断層面でのトランスデューサの短軸に沿って揺動）変換器は、画面中央の完全なLV室のビューを取得します。
   4. 見つけて、これらの解剖学的構造（ 図2A）を表示：左心室（LV）の内腔を。心室中隔（IVS）。右心室（RV）の内腔;上行大動脈（AO）。そして、左心房（LA）。
   <李> Mモードへの切り替えは、一度これらの上記の構造が明確に可視化されます。基準点としてAOを使用して、LV内腔の最も広い部分を介して指示線を配置し、また、LV商工会議所（ 図2B）の中心で焦点深度嘘を作ります。トランスデューサの角度を変更し、Mモードの測定値を得ることにより、RVの同様の測定を行います。
   5. オフライン測定（LV室の寸法、FSおよびLV壁の厚さ）のデータを記録するためにビデオループを作成するために、シネ・ストアを使用します。
   6. 大動脈でPWのカーソルを置いて（ 図2C）を記録することにより、PWドプラモードでの大動脈流出のドップラートレースを取得します。
2. 大動脈レベルで傍胸骨短軸ビュー（PSAX）。
   1. Bモードに切り替えます。
   2. 胸骨傍短軸ビュー（ 図3）を得るために、傍胸骨長軸ビューからトランスデューサ90°時 ​​計回りに回転させます。 IDに頭蓋に向けてトランスデューサを移動し、角度大動脈弁の断面図をentify。
   3. 大動脈への右上に局在三日月状の構造体として右心室流出路（RVOT）を特定、肺動脈弁のリーフレットと肺動脈を継続しました。
   4. 手動で同じ位置に安定したホールド。 PWドプラモードに切り替えます。
      注：齧歯類およびプローブを保持するためのステーションプラットフォームは、トランスデューサ位置における運動変動を最小化するために使用することができます。
   5. 右心室流出路の中心に肺動脈弁のレベルにサンプルボリュームの近位に配置し、容器（ 図3B）を介して血液の流れの方向にカーソルを平行に配置します。
      注：血流の方向にサンプリング角度を調整したり、角度の変化を補正するために超音波ソフトウェアを使用することが重要です。補正なし、容器の最大角度は、速度の〜15％の過小評価に対応し、30°です。
   6. ADJスケール（血流速度）UST層血流（ 図3C）を示す白色境界線と暗い中空の内部を有する"良い"ドップラー包絡線を得るために必要に応じ。ドップラートレースを記録します。
      注：エンベロープは、十分な白の境界線と暗い中空に対応していない「悪い」ドップラー。
   7. カテーテルはこの時点で行われていない場合、麻酔を使用した場合、齧歯類が回復することを可能にします。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻しており、それが完全に回復するまで、他の動物の会社にそれを返さないまで、齧歯類無人のまま放置しないでください。カテーテル法が実施されている場合は、セクション3に進んでください。

3.右心カテーテル法

1. RV圧測定用のクローズド胸アプローチ
   1. セットアップ：
      1. 、ソフトウェアでは、入力チャンネル1に圧力変換器を接続し、圧力のために、チャネル1を設定し、chann心拍数のためのエル2。
      2. （血圧トランスデューサとPEチューブを使用している場合）mmHgのに単位を変換するには、圧力計を使用して手動で圧力校正を実行し、ベースライントレースを記録します。そして、チャンネル1の下の単位の変換を行います。
      3. 心拍数を設定するには、チャンネル2の下で巡回測定を選択して、ソースと測定のための速度のためのチャンネル1を選ぶ2.チャンネルの入力をオフにします。
   2. 深さの焦点と5倍の倍率で解剖顕微鏡下にマウス/ラットを置きます。
   3. 胸骨（ 図1）に下顎骨から皮膚を切開。完全に子宮頸部領域を露出するために切開部の両側に開創のペアを配置します。
   4. ぶっきらぼうに微細な鈍い先端の鉗子（ 図4A、B）を用いて、静脈右外頸静脈を露出させるために唾液腺を分離するために解剖。
   5. 慎重に周囲の結合組織から右外頸静脈を分離します。
   <（、右外頸静脈の下に（できるだけ下顎の近くに）遠位静脈を結紮し、その後近位に緩い結び目を作る;李>は絹縫合糸の2枚（マウス用6-0ラットのための4-0）を配置します図4C）。
   6. 遠位結ば結び目に小さな「ニック」（カット）近位を作るために、虹彩のはさみを使用してください。
   7. ピンセットでカテーテルを持ち、静脈のカットにカテーテルを挿入し、近位の結び目を締めます。
      注：我々は通常31 Gまたは21 G針を通して定期的な圧力変換器に接続されているラットのためのマウスおよびPE-50（〜3 Frのサイズ）のために、ポリエチレン（PE）-10チューブ（〜2 Frのサイズ）を使用し、較正されました。マークおおよそ右心室における先端部の配置に対応した長さにマーカーを有するカテーテル。 PEチューブの代替として、マイクロマノメーターカテーテルを使用することができます。ゆっくり遠位結び目を引っ張ると、カテーテルを導入することができます。
   8. ゆっくり右心とモニターへのカテーテルをプッシュマークによると進歩の深さ。カテーテルの位置を確認し、RV圧力（ 図5）を識別するために、ソフトウェア内の圧力トレースを監視します。
   9. 2分間（次の[スタート]ボタンに記録データをトグル）不動カテーテルを維持し、データを収集します。
   10. サンプル回収（第4節）に進みます。
2. RV PVループ分析のための開胸アプローチ。
   注：右心室のPVループ解析が原因で、RAにSVCから通過しないコンダクタンスカテーテルの剛性を閉じた胸のアプローチを行うことができません。市販のコンダクタンスカテーテルはLVのPVループ分析のために設計されています。
   1. コンダクタンスのためのチャンネル1を設定したソフトウェアで、圧力のためのチャンネル2。心拍数およびチャンネル3。
   2. 16 Gテフロンチューブでラットを挿管し、人工呼吸器にチューブを接続します。計算および追跡を使用して、マウスまたはラットのための換気パラメータを設定しまする式^6：一回換気量（V _tの 、ミリリットル）= 6.2のx M ^1.01（M =動物の質量、キロ）。呼吸数（RR、分^-1）= 53.5のx M ^-0.26（ 図6A）。
   3. 手術野の上に毛皮の広がりを減らすために毛皮の上に70％アルコールを広げます。
   4. 剣状突起下の切開を行い、左右脇腹に向かってハサミで皮膚を解剖。
   5. 腹壁を通してカットし、振動板に沿って二国間の切開によって腹腔を開きます。
   6. 心尖を露出させ、両側性胸郭（ 図6A）をカットするダイヤフラムを開きます。注射器を用いて胸部と腹腔内に生理食塩水を噴霧することによって蒸発し、組織の乾燥を防ぎます。
      注：私たちは通常、腹腔と胸郭を開くために解剖ハサミを使用しています。出血は通常重要ではないが、出血がある場合には、電気メスを使用することができます。
   7. 慎重に分離株番目周囲の結合組織から電子下大静脈（IVC）。
   8. IVCの周り;（マウス用6-0ラットで4-0）、その後、緩い結び目を作る（または16 Gテフロンチューブを通して縫合糸をスレッド）（ 図6B）を絹縫合糸の一部を置きます。
   9. RV自由壁に27-30ゲージの針を平行にして頂端RV自由壁を穿刺し、針を取り除きます。以上4ミリメートルに針をプッシュしないように注意してください。
      注意：代替的に、PE-60チューブの小片は、RV尖にコンダクタンスカテーテルの穿刺を誘導するために使用することができます。
   10. 全ての電極は、心室（ 図6C）の内側にあるまで、頂端RV自由壁に刺し傷を介してコンダクタンスカテーテル先端を挿入します。
   11. ソフトウェア内の圧力容積ループを監視し、重要な呼吸変動（ 図7B、C）を示すものではありません一貫形のループを得るために、カテーテルの位置を調整します。
   12. 記録PVループの数を取得するために、少なくとも10秒のベースラインPVループ（トグルデータは次の[スタート]ボタンに録音）。
   13. プリロードを変更するとPVループを記録するためにIVCの周囲に配置された縫合糸を引き出します。オフラインデータを分析し、RVの収縮機能（ 図7D）の様々なパラメータを導き出します。この分析は^、8、以前に記載されています。
       注：IVCは、代替的に鉗子によって閉塞することができます。プリロードの減少を確認するために、RV圧力トレースを監視します。
   14. 以前体積単位⁶にコンダクタンス単位からの変換を可能にするために説明したように、生理食塩水およびキュベットキャリブレーションを実行します。
   15. データを記録した後、静かに出てカテーテルを引き出し、すぐに生理食塩水で水浴中にカテーテルの先端を配置します。終了すると、製造者の指示に従って、カテーテルをきれいに。

心臓と肺のサンプルの4集

注：ここでの手順として、端末として説明した再、動物は、クローズドどちらか開胸右心カテーテル検査後に安楽死させなければなりません。

1. クローズド・胸部のアプローチが使用された場合胸郭（両側性開胸術を）開くことによって、exanguination、または麻酔薬の過剰投与後に人工呼吸器をオフにすることで、マウスを安楽死させます。
   注：頸椎脱臼は推奨されません。
2. 肺のインフレ灌流を実行するには、20 CMH ₂ Oの圧力で肺を膨らませるために（ただし、肺を膨らませるためにまだバルブを開けないようにしてください）設定ringstandにインフレーションチューブを接続します。
3. ぶっきらぼうに筋肉や結合組織を取り巻くから気管を解剖。
4. 絹縫合糸（ラットでは4-0;マウス用6-0）の一片置き気管の周りを、その後、緩い結び目を作ります。
5. 軽く頭を押して、気管を伸ばし、下顎に近いカット（円周の70％）を作ります。
6. 穏やかなストレッチを維持し、気管カニューレ（マウス用20 Gまたはラットでは16 G）を挿入します。縫合糸を使用してカニューレを固定します。インフレーションチューブにカニューレを接続し、固定液の逆流を防止するために、カニューレの周りに縫合糸を結びます。
7. RV自由壁を刺すと肺動脈に向かって噴射するように10ミリリットルの注射器を使用してPBSで肺をフラッシュします。肺が白くに開始するとニックはアトリウムを残しました。
8. 大動脈の根元で切断​​することにより、心臓を収穫。
9. 蚊の止血剤を使用して、肺の右下葉をクランプし、右下葉をカット。マイクロ遠心チューブに作品を配置し、液体窒素中で凍結スナップ。
10. 5分間、10％緩衝-中性ホルマリンで肺を膨らませると気管を連結することにより、その後、気管カニューレを削除します。
11. 胸部から肺を解剖し、10％緩衝-中性ホルマリンで固定します。
    注：と凍結切片の後の調製のために希釈されていない10月にフリーズ：別の方法として、最適な切削メディアと肺膨らませる（PBSで10月1日に、1に希釈）。
12. 慎重に心室から心房を分離し、心室中隔と一緒に解剖することにより、右心室自由壁を隔離します。
13. RV肥大の程度を定量化フルトン指数（RV / LV + ^S）9を 、計算するRVとLV +中隔（LV + S）を秤量します。
    注：TheFulton指数はPHの異なるモデルで変化します。ラット^10：コントロール、0.28±0.01;低酸素誘導、0.57±0.02; MCT処理し、0.51±0.03。 C57BL6 / Jマウス^11：コントロール、0.26±0.01; SuHx（14日）、0.40±0.02; SuHx（21日）、0.43±0.01; SuHx（28日）、0.44±0.03。
14. スナップは、液体窒素中でRVおよびLV + Sを凍結または10％緩衝-中性ホルマリンで固定します。

結果

げっ歯類で右心カテーテル法は、典型的には、縦のフォローアップには適用されませんターミナル手続きであるように、心エコー検査は、スクリーニングのための優れた非侵襲的な代替手段であり、フォローアップ^12。心エコー検査でヒトPAHにおける肺動脈収縮期圧は、通常、頂端図で得ることが通常簡単である三尖弁逆流から誘導されるが、このようなビューを確実ドップラーによ...

ディスカッション

The protocols outlined here describe a comprehensive characterization of hemodynamics and right ventricular function in rodent models of pulmonary hypertension. While right heart catheterization as described here is a terminal procedure, the mortality associated with echocardiography is minimal, which allows for screening and follow-up of disease progression. However, similar to patients with PH having markedly increased mortality with anesthesia¹⁷, in our experience, rats with severe PH do not tolerate anesth...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 Imaging System (120V)	VisualSonics, inc.	VS-11945
Vevo 2100 Imaging Station	VisualSonics, inc.
High-frequency Mechanical Transducers	VisualSonics, inc.	MS250, MS550D, MS400
Ultrasound Gel Parker	Laboratories Inc.	01-08
PowerLab 4/35	ADInstruments	ML765
Labchart 8	ADInstruments
BP transducer with stopcock and cable	ADInstruments	MLT1199
BP transducer calibration kit	ADInstruments	MLA1052
Mikro-Tip Pressure Catheter for mouse	Millar	SPR-1000	Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat)
Mikro-Tip Pressure Catheter for rat	Millar	SPR-513	Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat)
Millar Mikro-Tip ultra-miniature PV loop catheter for mice	Millar	PVR-1035	Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse)
Millar Mikro-Tip ultra miniature PV loop catheter for rats	Millar	SPR-869	Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse)
Millar PV system MPVS-300	Millar	MPVS-300
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical	SUT-15-2
6-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical	SUT-14-1
Iris Scissors, Delicate, Integra Miltex	VWR	21909-248
VWR Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip	VWR	82027-588
VWR Delicate Scissors, 4 1/2"	VWR	82027-582
Two star Hemostats, Excelta	VWR	63042-090
Neutral-buffered formalin	VWR	89370-094
Crotaline	Sigma	C2401
SU5416	Tocris Biosciences	3037
3.5X-45X Boom Stand Trinocular Zoom Stereo Microscope	AmScope	SM-3BX
PE (Polyethylene Tubing)-10	Braintree Scientific Inc	PE10 36 FT
PE (Polyethylene Tubing)-50	Braintree Scientific Inc	PE50 36 FT
PE (Polyethylene Tubing)-60	Braintree Scientific Inc	PE60 36 FT
Tabletop Isoflurane Anesthesia Unit	Kent Scientific	ACV-1205S
Surgisuite multi-functional surgical platform	Kent Scientific	Surgisuite
Retractor set	Kent Scientific	SURGI-5002
Anesthesia induction chamber	VetEquip	941443
Anesthesia Gas filter canister	Kent Scientific	ACV-2001
Rodent nose cone	VetEquip	921431