腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

要約

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。

要約

グリア芽細胞腫（GBM）は、外科手術、化学療法および放射線療法にもかかわらず、極めて不良な予後を続けている。周囲の脳実質への進行性の腫瘍浸潤は、永続的な治療上の課題である。 GBMのための抗遊走療法を開発するためには、制御された実験のために生理学的に関連する背景を提供するモデル系が不可欠である。ここでは、外科的切除の間に得られたヒトGBM組織から切片培養を生成するためのプロトコールを提示する。これらの培養物は、動物異種移植片または単一細胞培養物を通さずにエクスビボ実験を可能にする。さらに、我々は、腫瘍細胞の移動挙動および治療への関連する応答を定量的に研究するために、細胞追跡と併せて経時的レーザー走査共焦点顕微鏡法の使用を記載する。スライスは、手術組織の獲得の90分以内に再現可能に生成される。レトロウイルス媒介性の蛍光細胞1aベーリング、共焦点画像化、および腫瘍細胞移動分析は、培養の2週間以内にその後完了する。私たちは、これらのスライス培養をうまく使用して、ヒトGBMにおける増加した遊走行動に関連する遺伝的要因を明らかにした。さらに、本発明者らは、抗マイグレーション療法に応答して患者特異的変異を検出するモデルの能力を検証した。進行中、ヒトGBMスライス培養は、パーソナル化された神経腫瘍治療を進めるために、治療薬に対する腫瘍感受性の迅速なエクスビボ評価のための魅力的なプラットフォームである。

概要

グリア芽腫（GBM）の実験研究は、ヒト疾患の必要な病理学的特徴、すなわち腫瘍細胞の移動および浸潤を忠実に再現するモデルの欠如によって妨げられている。比較2Dおよび3D インビトロ浸潤アッセイの研究ならびに3Dげっ歯類スライス培養モデルは、潜在的にヒトの疾患^1、2、3に2Dシステムからの所見の翻訳可能を制限する、これら二つのコンテキストに機構的に異なる細胞移動のプログラムを発見しました。本明細書に記載される器官型腫瘍スライス培養およびイメージングパラダイムは、外科的切除から得られたex vivoヒト腫瘍組織の切片内での腫瘍細胞遊走の研究を可能にする。したがって、経時的共焦点顕微鏡法と組み合わせて外科的に切除された腫瘍組織の切片培養は、ネイティブの腫瘍細胞移動を研究するためのプラットフォームを提供する組織溶解または培養継代がない微環境。

腫瘍浸潤^{1、2、3、4、5を}研究するために、ヒト腫瘍異種移植片、レトロウイルス誘導性腫瘍、および細胞オーバーレイから生成されたGBMの齧歯類脳切片培養モデルを用い広範な文献があります。最近、いくつかのグループが直接ヒトGBM組織^{6、7、8、9、10}から器官型スライス培養物の生成を記載しています。しかし、スライス技術および培養培地に関して公開されたプロトコールの間には著しい変化がある。さらに、器官型スライス培養の使用は、細胞シグナルの変化を含む静的実験的エンドポイントに焦点を当てている死、増殖、死亡の原因となる。本明細書に記載のプロトコルは、経時的レーザー走査共焦点顕微鏡法による動的腫瘍細胞挙動の時間分解観察を組み込むことによって、従来のスライス培養パラダイムを拡張する。間¹¹および腫瘍内¹²の最近の発見は^、人間のGBMで¹³遺伝的変異は、腫瘍細胞の挙動および治療に対する腫瘍の応答にその意味で、この異質性を結びつけることの重要性を強調しています。ここでは、ヒト癌組織由来の直接スライス培養物を使用して腫瘍細胞の移動をほぼリアルタイムで視覚化するための合理的で再現性のあるプロトコールを報告する。

プロトコル

患者組織サンプルの採取を開始する前に、認可された機関審査委員会（IRB）のプロトコールのもとで、各患者からインフォームドコンセントを得なければならない。このプロトコルの著者は、コロラド大学病院とイノバフェアファックス病院の承認されたIRBプロトコルに記載されている作業について同意を得ました。これらのスライスカルチャーから収集されたデータは、患者ケアの決定を指示するために使用されなかった。

1.プレスライスの準備

1. 予定された腫瘍切除および組織収集の前日に（または2週間以内に以前に生成された培地を利用する）「組織処理」培地および「スライス培養維持」培地を調製する。ペニシリン - ストレプトマイシン溶液（10,000U / mL）5mLおよび1M HEPES 5mLを500mLの高グルコースDMEMに添加して、組織処理培地を生成する。
2. ニューロン培地（ 例えば 、Neurobasal）のベースを使用して、250mLのスライス培養維持培地を調製する。houtフェノールレッド。この培地に10mM HEPES、1×B-27補充液、400μML-グルタミン、600μML-アラニル-L-グルタミンジペプチド、60U / mLペニシリン、60μg/ mLストレプトマイシンおよび6U / mLナイスタチンを補充する。
3. すべての培地を4℃で2週間以上保管しないでください。

2.手術の日：組織の獲得

1. 組織採取の日に、オートクレーブガラス器具および層流フード内の無菌技術を用いて、組織処理培地中の低融点温度アガロースの1％および2％（wt / vol％）溶液50〜100mLを調製する。腫瘍組織の一貫性の予測不可能な変動に対応するためには、両方の濃度のアガロースが必要です。
2. 穏やかな沸騰が観察されるまで、マイクロ波を用いてアガロース懸濁液を加熱する。使用するまで液状に維持するためにアガロース溶液を37℃の水浴中に置く。
3. 6ウェルプレートの各ウェルに1mLのスライス培養維持培地を入れる。
4. 滅菌する各ウェルに空のPTFE培養インサートを置くための鉗子。 37℃に保たれた5％CO ₂雰囲気を有する加湿されたウォータージャケット付き組織培養インキュベーターにプレートを置く。
5. 層流フード中の滅菌パスツールピペットを用いて、95％O ₂ /5％CO ₂ガスの混合物を、腫瘍組織を採取する前に約15〜30分間氷冷組織処理培地を入れたフラスコに泡立て​​る。超酸素媒体の使用は、処理中のバルク組織における低酸素症を最小限に抑える。
6. 手術室とスライス施設の間で組織を移送するために、超酸化された氷冷処理媒体の20mLアリコートを含むラベル付き50mLコニカルチューブ（単離されるべき個々の腫瘍領域の所望の数に十分）を準備する。
7. 神経外科医と共に、サンプル獲得のために腫瘍領域を手術前に計画する。患者の臨床像上に示されているように、造影増強を伴う腫瘍領域を選択するg（T1ポストガドリニウム磁気共鳴イメージング（MRI）シーケンス）。以前の経験から、この領域は壊死組織とは対照的に生存可能な腫瘍組織を生じることが示唆される。
   注：周囲（肉腫周囲）の白質からの切片の生成が試みられた;しかし、バックグラウンド自己蛍光および腫瘍細胞密度の減少は、これらの切片の実験的有用性を制限した。
8. 腫瘍切除の開始に向けて腫瘍組織を得る。大規模な双極焼灼に曝された腫瘍組織の収集を避ける。これは、熱傷に続発する組織の生存率を損なう可能性がある。分割腫瘍切除の間に採取された組織試料は、長い一括切除から採取された組織と比較して、生存能力の向上を示す。この所見は、外科的切除および獲得までの時間の延長による血流の異なる腫瘍組織の喪失に関連し得る。
9. 必要に応じて、分離した円錐管に腫瘍組織を標識して保存し、検体を単離します異なる腫瘍領域から得た。 （ すなわち、表在性腫瘍対深部腫瘍組織）。術中外科手術ナビゲーションが利用可能な場合には、正確な組織位置を記録することができる。

3.スライス培養の準備

注記：このプロトコールでは、未固定のヒト組織を使用する必要があります。全てのサンプルは感染性であると推定され、普遍的血液媒介病原体プロトコールに従って取り扱われるべきである。適切な個人用保護具を常に着用すること。鉗子とメスは、使用する前に15分間のUV光に曝すべきです。使用中、70％エタノール（EtOH）を間欠的にスプレーし、使用前に液体が蒸発する時間を確保する。スライス工程は、濾過された空気を有する水平層流フードを利用して半滅菌様式で行われる。

1. 氷冷処理培地を含むペトリ皿に腫瘍組織片を入れる。腫瘍組織を洗浄し、付着赤血球を最小化するために、我々は穏やかにペトリ皿の培地を3回交換して廃棄するピペット。
2. メスを使用して、腫瘍片を長方形の箱形に切断する。組織片を約3mm×3mm×10mmに裁断する。細かい鉗子で摘出または穏やかな牽引を通して、付着した血管を慎重に除去する。
3. ピペット5 - 37℃のアガロース7 mLを小さな立方体（〜2 cm ³ ）のプラスチック包埋型に入れる。使用前にアガロース溶液の温度が滅菌温度計で37℃以下であることを確認する。
4. アガロースを氷上で約1分間放置する。
5. 長軸を垂直に向けたアガロースに2〜4個の腫瘍組織「ストリップ」を置きます。
   注：凝固前に組織片がアガロース中に「沈む」傾向があります。この合併症を避けるために、アガロースがさらに凝固するまで組織片を一時的に垂直方向に保持する。
6. アガロースを含む組織を氷の床に2〜5ミル凝固を促進する。
7. 金型を氷から取り出し、メスでフォームの側面を切断してアガロースブロックを静かに取り除きます。ブロックに過大な力をかけると、アガロースが破損する恐れがあります。
8. ビオラトーム試料プレートにアガロースブロックを固定するには、シアノアクリレート接着剤を十分に滴下してください。接着剤を約1〜2分間セットします。
9. ビブラトームリザーバーを氷冷処理培地で満たして、標本プレートに添付されたアガロースブロックを沈めます。
10. スライス中、トリミングされた滅菌プラスチックピペットを介してビブラトームリザーバに95％O ₂ /5％CO ₂ガス混合気を泡立てる。
11. ビブラトームスライスの厚さを300〜350μmに設定します。
12. 組織の一貫性に応じて、ブレードの前進速度とブレードの振幅を調整します。 「より硬い」GBM組織は、より遅いブレード前進速度とより高い振幅を必要とする。正確なブレードの速度と振幅の設定は、ビブラトームの仕様によって異なります。
    注：一般的に、スライス中にいくつかの問題が発生します。組織片がアガロースブロックから外れる場合は、組織をより高濃度のアガロースに包埋してください。腫瘍切片が所望よりも厚い（機械セット）、または非対称である場合、ビブラトームブレードの振幅および速度を増加させる。腫瘍組織がブレードホルダに張り付かないか、またはブレードホルダによって「引きずられ」ないようにするために、スライスが行われるとき、ブレードが移動するときに、ブレードホルダとスライスとの間に微小スパチュラを注意深く配置する。
13. ステンレス鋼のマイクロスパチュラを使用して氷冷処理メディアでペトリ皿に組織スライスを移す。
14. インキュベーターからPTFEインサートと平衡スライス培地を含む6ウェルプレートを得る（セクション2、ステップ4で調製した通り）。
15. ステンレス鋼マイクロスパーターを用いたプレート組織切片。スムーズにスパチュラからスライスを押し出すための「流体波」を生成するために小さな細い毛の絵筆を使って組織の直接接触と操作を最小限に抑えます培養インサート上に置く。
    注：組織培養インサートの上に導入される処理培地の量を最小限に抑えます。スライスが浮遊するように過剰量の培地が移された場合、滅菌パスツールピペットを使用して培地を除去します。
16. 腫瘍切片を含む6ウェルプレートを、5％CO ₂雰囲気で37℃に維持したインキュベーターに戻す。
    注：埋め込みおよびスライスのプロトコル全体は、手術室から腫瘍組織を取得して90分以内に完了する必要があります。

4.スライスの文化維持

1. 12〜24時間後、滅菌鉗子で各インサートリムをつかんでスライス培養物を移し、新鮮なスライス培養維持培地を含むプレートに移す。インサートを移す前に、少なくとも15分間インキュベーター内で各ウェルに等分したスライス培養メンテナンス培地を平衡化させてください。
2. 新鮮な平衡スライスカウルを用いて新しい6穴プレートにインサートを移動する48時間ごとに培地を試験する。
3. 必要に応じて、生化学的アッセイ（ すなわち ELISA）で直ちに使用するためにピペットで古い培地をスライスし、または将来の使用のために-80℃で凍結する。

レトロウイルスを表現5.腫瘍細胞のラベリング経由緑色蛍光タンパク質

注：腫瘍細胞移動の分析のための経時顕微鏡法は、スライス培養内の細胞の安定した長期蛍光標識を必要とする。レトロウイルスの使用は、分裂細胞に選択的に感染し、それにより、スライス内に存在するミクログリアまたは他の細胞型とは対照的に、腫瘍細胞集団内の蛍光標識を濃縮するために示唆される。感染の標準化は、10 ⁴ CFU /μLのウイルス力価が、細胞移動の追跡および分析に十分な緑色蛍光タンパク質発現をもたらすことを示唆している。ウイルス力価の増加、非選択的ウイルス（ すなわち、アデノウイルス、レンチウイルス）の使用、または、すべての細胞を標識する手段は、移動中の明確な細胞境界の同定を妨げ、分析を複雑にする可能性がある。代替の蛍光マーカーの使用は、必要に応じて利用および最適化することができる。

1. ^14、5標準プロトコルを介して 、または商業的に入手可能な供給源のいずれかからの腫瘍切片の感染のためにレトロウイルスを得ます。補充されていないニューロン培地に適切な容量を加えてウイルスの上清を希釈し、10 ⁴ CFU /μLのウイルス力価を達成する。
2. 培養の7〜10日の間に、5〜10μLのウイルス（10 ⁴ CFU /μL）で目的の腫瘍切片培養物を感染させる。ウイルスを各組織切片の表面上に静かに滴下する。スライスがインサートの表面上に浮く場合に加えられる上清の体積を減少させる。培養プレートをインキュベーターに戻します。
3. 24時間後に開始する標識腫瘍細胞のスライスを評価するウイルス感染（セクション6を参照）。この時間遅延は、ウイルス組み込みおよび蛍光遺伝子発現動態に依存して変化する。ここで用いたウイルス構築物については、標準的な落射蛍光顕微鏡で強い蛍光シグナルを観察するために72時間が必要であった。
   注：まれに、スライスは、共焦点イメージングを複雑にする可能性のあるウイルス標識細胞の主な周辺分布を示す。この複雑さを避けるには、スライス全体のスライス厚さと厚さのばらつきを減らそうとします。スライスカルチャーが中心近くのより厚い領域を有する場合、これは十分な栄養分の浸透を妨げ、したがって活発に分裂する腫瘍細胞の集団を制限する。この合併症をスクリーニングするための定性アッセイは、スライス培養培地にテトラゾリウム色素試薬（ すなわち、 MTT）を添加することである。試薬添加後に青色に変わらないスライスの領域は、代謝活性の欠如およびスライスの健康状態の低下を示す。

"" 6.腫瘍細胞移動の共焦点イメージングを走査する経時的な単一光子レーザー

注：成功した形質導入および培養の健康が確認された後、細胞は、制御条件下で画像化され、続いて、処理条件下で等しい期間の画像が形成され得る。このプロトコルを使用して、各条件で細胞を正常に画像化し、12時間追跡した。しかし、画像化および環境操作の期間をより短くまたはより長くすることも有益であり得る。

1. 顕微鏡の読み込み
   1. イメージングする前に、新鮮なスライスメディア1 mLをガラス底の皿に入れます。
   2. ガラスボトムディッシュの培地をインキュベーターで15分間平衡化させます。
      注：この時点で、蛍光共役レクチン（ すなわち 、ミクログリア標識のためのイソレクチンIB ₄ ）またはリガンド共役量子ドットのような可溶性標識剤を、細胞の同定のためにスライス培養培地に添加することができるイメージング中のular subpopulations。
   3. 層流フード内の無菌鉗子を使用して、画像化されるインサートをガラスボトムディッシュに移す。皿を顕微鏡ステージに運ぶ。
   4. 37℃および5％CO ₂雰囲気で、密閉顕微鏡ステージトップインキュベーター中でスライス培養物を維持する。余分な培地の蒸発を防ぐために利用可能であればインキュベーションチャンバーの無菌H ₂ O加湿を利用してください（特に長いイメージング実験では重要です）。
   5. 単一光子および/または多光子のための長い作動距離10X空気対物レンズおよびレーザー励起を有する共焦点顕微鏡を利用する。
      注：顕微鏡の対物レンズが十分な作動距離を確保していることを確認してください。ステージトップインキュベーター、ガラスボトムディッシュ、および組織培養インサートからの高さの結果として、長い作動距離の目標が重要です。
   6. ガラスの底板を固定し、プラスチックペトリ皿カバーを取り外し、透過性膜。
2. 画像取得
   1. 顕微鏡を使用してスライスを視覚的に検査し、スライスエッジと中心との間に蛍光標識された腫瘍細胞の適切な密度の適切な視野を配置する。イメージング中の組織のシフトの感受性が高まるため、スライスの端にフィールドをイメージングしないでください。このシフトを制限するために、組織スライスハープを用いることができる。
   2. 多次元解析モードでイメージングソフトウェアを使用して、イメージングされるすべての位置に可視の蛍光細胞シグナルが含まれるように、最初（下）および最後（上）のZスタック境界を設定します。スライス150〜200μmをイメージングし、10μmの一定のZステップで、細胞経路を追跡するための適切な解像度を提供した（これは、個々のイメージングニーズに合わせて調整することができる）。
   3. 顕微鏡に電動ステージがある場合は、各Zスタックの収集に十分な時間を確保してください。集録間の時間間隔を等しく設定する位置毎の走査時間x画像の位置の数（ すなわち、画像化された腫瘍領域）。
      注：緑と赤の蛍光体を同時に励起するには、同時に488 nmと633 nmの励起で、デュアルラインレーザーラインスキャンプログラムを使用します。選択されるレーザー励起の波長は、発現される個々の蛍光タンパク質に応じて変化する。
   4. 画像化された腫瘍領域間の均一なレーザー出力および共焦点ピンホール設定を維持する。光毒性を制限するために、腫瘍細胞の体とプロセスをはっきりと区別するために必要な最も低いレーザー出力設定を利用してください。特定のイメージングパラメータユニット（ すなわち、パワーおよび共焦点ピンホール設定）は、顕微鏡およびレーザ源の仕様によって異なる。
   5. 目的に向かって進むフォーカルプレーンに2〜3 "バッファ" Zスタックステップを追加することにより、潜在的なメディアの蒸発を補う。これは、組織がZスタック獲得の範囲を離れることを効果的に防止するイオンを垂直面内に放出する。

画像後処理および腫瘍細胞追跡

注記：多くの共焦点画像システムには、独自の画像処理ソフトウェアが装備されています。以下に説明する処理ステップは、ソフトウェアプラットフォーム間で実行可能な一般的なプロトコルを含む。具体的な手順は、オープンソースのプラットフォーム、NIH ImageJとMTrackJ ^15に与えられます。

1. Zスタックファイルを開きます。 ImageJで、「画像→スタック→Zプロジェクト」をクリックします。最初と最後のZスタックを含めて選択し、投影タイプとして "Max Intensity"を選択しました。結果は最大輝度投影（MIP）と呼ばれるレンダリングです。画像化された各領域でキャプチャされたZスタック画像の各セットからMIPを作成します。
2. 各地域のMIPを連結して時系列を作成します。 「イメージ→スタック→イメージをスタック」をクリックします。
3. 場所を手動で特定する腫瘍細胞体の視覚的に近似された中心点を選択することによって、細胞体の「重心」を決定する。これは、MTrackJ（NIH ImageJ用のオープンソースプラグイン）の "add"トラック機能を使用してセル本体をクリックすることによって実現されます。
4. クリックすると、一連の画像の各フレームにあるセルのボディの位置を区切ります。これにより、各セルに固有の「トラック」が作成されます。続いて、次のセルのセルのボディの位置をマークします。すべてのセルの移行パスが追跡されるまで、このプロセスを繰り返します。
5. 所与の腫瘍微小領域で細胞集団が追跡されると、MTrackJの「測定」機能を使用してすべての細胞追跡座標をエクスポートする。スプレッドシートまたはユーザー生成ソフトウェアを使用して生データを分析できるように、ファイルを.xls形式で保存します。
6. セルの移動軌跡に沿って各点に記録された座標を使用して、移動速度、方向性、および他の移動の導出を含む定量分析を実行しますメトリクス、パーカーら ¹⁶に記載されているように。
   注：計算されたすべての距離と速度は、実際の値の過小評価です。これは、最大強度投影の生成を通じた3次元画像（および移動経路）の2次元データへの変換に固有のものである。

結果

私たちのグループは、最初のGBM切除を受けた50人以上の患者からスライスカルチャーを成功裏に生成しました。このスライス生成、培養、レトロウイルス - ラベリング、イメージング、およびマイグレーション解析プロトコルは、再現可能なワークフローに合理化されています（ 図1 ）。重要なことに、これらの器官型GBMスライスは、病理学的特徴お...

ディスカッション

ヒト癌組織由来の器官型スライス培養は、前臨床翻訳実験のための魅力的で十分に活用されていないプラットフォームを提供する。天然の腫瘍微小環境における移動、増殖、および細胞死に関する腫瘍細胞の集団レベルの挙動の理解は欠けている。重要なことに、細胞挙動のレベルで動的で時間分解された様式で治療に対する腫瘍応答を研究することは、治療抵抗性の新規メカニズムに光を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Supplement	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas	Fisher Scientific	S50823	Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors)	Fisher Scientific	17-989-001	Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm
LSM 510 Confocal Micoscope	Zeiss	LSM 510	10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON Germany	(Discontinued)	Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.