Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Zusammenfassung

Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.

Zusammenfassung

Glioblastom (GBM) weiterhin eine extrem schlechte klinische Prognose trotz chirurgischen, chemotherapeutischen und Strahlentherapie zu tragen. Progressive Tumorinvasion in das umliegende Hirnparenchym stellt eine dauerhafte therapeutische Herausforderung dar. Um Anti-Migrationstherapien für GBM zu entwickeln, sind Modellsysteme, die einen physiologisch relevanten Hintergrund für kontrolliertes Experimentieren bieten, unerlässlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung von Scheibenkulturen aus humanem GBM-Gewebe, das während der chirurgischen Resektion gewonnen wird. Diese Kulturen erlauben Ex-vivo- Experimente ohne Passage durch tierische Xenotransplantate oder Einzelzellkulturen. Weiterhin beschreiben wir die Verwendung von zeitraffer Laserscanning-konfokalen Mikroskopie in Verbindung mit der Zellverfolgung, um das Migrationsverhalten von Tumorzellen quantitativ zu untersuchen und die Resonanz auf Therapeutika zu beurteilen. Scheiben werden innerhalb von 90 min der chirurgischen Gewebeerfassung reproduzierbar erzeugt. Retrovirally-vermittelte fluoreszierende Zelle laBeling, konfokale Bildgebung und Tumorzellmigrationsanalysen werden anschließend innerhalb von zwei Wochen der Kultur abgeschlossen. Wir haben diese Scheibenkulturen erfolgreich eingesetzt, um genetische Faktoren aufzudecken, die mit einem erhöhten Migrationsverhalten im menschlichen GBM verbunden sind. Weiterhin haben wir die Fähigkeit des Modells validiert, eine patientenspezifische Variation in Reaktion auf Anti-Migrationstherapien zu detektieren. Nach vorne gehen menschliche GBM-Slice-Kulturen eine attraktive Plattform für eine schnelle Ex-vivo- Beurteilung der Tumorsensitivität gegenüber therapeutischen Wirkstoffen, um eine personalisierte neuro-onkologische Therapie voranzutreiben.

Einleitung

Die Laborstudie des Glioblastoms (GBM) wird durch einen Mangel an Modellen behindert, die die notwendigen pathologischen Eigenschaften der menschlichen Erkrankung, nämlich die Tumorzellmigration und die Invasion, treu rezitieren. Vergleichende Untersuchungen von 2D- und 3D- In-vitro- Invasions-Assays sowie 3D-Nagetier-Slice-Kulturmodellen haben in diesen beiden Kontexten mechanistisch disparate zelluläre Migrationsprogramme aufgedeckt, die möglicherweise die Übersetzbarkeit von Befunden von 2D-Systemen auf die menschliche Erkrankung ^{1 , 2 , 3 beschränken} . Das hier beschriebene organotypische Tumorscheiben-Kultur- und Bildgebungsparadigma ermöglicht die Untersuchung der Tumorzellmigration innerhalb von ex vivo menschlichem Tumorgewebe, erhalten aus chirurgischer Resektion. So bieten Scheibenkulturen von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe in Verbindung mit zeitraffer konfokaler Mikroskopie eine Plattform, um die Tumorzellmigration im Eingeborenen zu untersuchenMikroumgebung ohne Gewebeauflösung oder Kulturpassage.

Es gibt umfangreiche Literatur, die Nagetier-Hirn-Slice-Kulturmodelle von GBM aus menschlichen Tumor-Xenotransplantaten, retroviral-induzierten Tumoren und zellulären Overlays zur Untersuchung der Tumorinvasion ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 verwendet} . Kürzlich haben mehrere Gruppen die Erzeugung von organotypischen Scheibenkulturen direkt aus dem menschlichen GBM-Gewebe ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 beschrieben} . Allerdings gibt es eine deutliche Variation zwischen veröffentlichten Protokollen in Bezug auf Schneidtechnik und Kulturmedien. Weiterhin konzentrierte sich die Verwendung von organotypischen Scheibenkulturen auf statische experimentelle Endpunkte, die Änderungen der Zellsignale beinhaltenNg, Proliferation und Tod. Das hier beschriebene Protokoll dehnt sich auf vorherige Scheibenkulturparadigmen aus, indem die zeitaufgelöste Beobachtung von dynamischen Tumorzellverhalten durch zeitkonstante Laserscanning-konfokale Mikroskopie aufgenommen wird. Die jüngste Entdeckung von inter ¹¹ und intratumoraler ^{12 , 13} genetischer Variation in humanem GBM unterstreicht die Bedeutung der Verknüpfung dieser Heterogenität mit Tumorzellverhalten und deren Auswirkungen auf die Reaktion des Tumors auf die Therapie. Hier berichten wir über ein stromlinienförmiges und reproduzierbares Protokoll für die Verwendung von direkten Scheibenkulturen aus einem menschlichen Krebsgewebe, um die Tumorzellmigration in nahezu Echtzeit zu visualisieren.

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Protokoll

Vor der Einnahme von Patientengewebeproben ist eine Einverständniserklärung von jedem Patienten im Rahmen eines genehmigten Instituts für das Exemplar (IRB) zu erhalten. Die Autoren dieses Protokolls erhielten Zustimmung für die Arbeit, die unter genehmigten IRB-Protokollen an der Universität von Colorado Krankenhaus und Inova Fairfax Krankenhaus beschrieben wurde. Daten, die aus diesen Scheibenkulturen gesammelt wurden, wurden nicht verwendet, um Patientenbetreuungsentscheidungen zu lenken.

1. Vorschneiden Vorbereitung

1. Bereiten Sie "Gewebeverarbeitung" Medien und "Slice Kultur Wartung" Medien am Tag vor geplanten Tumor Resektion und Gewebe Sammlung (oder verwenden Sie zuvor generierte Medien innerhalb von 2 Wochen). Füge 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U / ml) und 5 ml 1 M HEPES zu 500 ml eines High-Glucose-DMEM hinzu, um das Gewebeverarbeitungsmedium zu erzeugen.
2. Vorbereiten von 250 ml Schichtkultur-Wartungsmedien unter Verwendung einer Basis von neuronalem Medium ( zB Neurobasal) WitzHülle Phenol rot. Ergänzen Sie dieses Medium mit 10 mM HEPES, 1x B-27 Ergänzung, 400 μM L-Glutamin, 600 μM L-Alanyl-L-glutamin-Dipeptid, 60 U / mL Penicillin, 60 μg / mL Streptomycin und 6 U / mL Nystatin.
3. Alle Medien bei 4 ° C für nicht länger als 2 Wochen aufbewahren.

2. Tag der Chirurgie: Tissue Acquisition

1. Am Tag der Gewebeerfassung werden 50 - 100 ml 1% und 2% (Gew./Vol.%) Lösungen von Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in Gewebeverarbeitungsmedien unter Verwendung von autoklavierter Glaswaren und steriler Technik in einer laminaren Strömungshaube hergestellt. Beide Konzentrationen von Agarose sind erforderlich, um eine unvorhersehbare Veränderung der Tumorgewebskonsistenz zu berücksichtigen.
2. Die Agarose-Suspension mit einer Mikrowelle erhitzen, bis ein sanftes Kochen beobachtet wird. Legen Sie die Agarose-Lösung in ein 37 ° C Wasserbad, um in einem flüssigen Zustand bis zur Verwendung zu halten.
3. Lege 1 ml Schichtkultur-Wartungsmedium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte auf.
4. Verwenden Sie eine sterilePinzette, um leere PTFE-Kultureinsätze in jede Vertiefung zu legen. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten, mit Wasser ummantelten Gewebekultur-Inkubator mit einer 5% CO ₂ -Atmosphäre, die bei 37 ° C gehalten wird.
5. Mit einer sterilen Pasteurpipette in einer laminaren Strömungshaube eine Mischung aus 95% O ₂ /5% CO ₂ -Gas in einen Kolben mit eiskaltem Gewebeverarbeitungsmedium für etwa 15 bis 30 min vor der Tumorgewebeerfassung einblasen. Die Verwendung von supra-sauerstoffhaltigen Medien minimiert die Hypoxie im Bulk-Gewebe während der Verarbeitung.
6. Bereiten Sie markierte 50 ml konische Röhrchen vor (ausreichend für die gewünschte Anzahl einzelner zu lokalisierender Tumorbereiche), die 20 ml Aliquote von supra-oxygenierten eiskalten Verarbeitungsmedien enthält, um Gewebe zwischen dem Operationssaal und der Schneidanlage zu transportieren.
7. In Verbindung mit einem Neurochirurgen präoperativ die Tumorregion zur Probenerfassung planen. Wählen Sie eine Tumorregion mit Kontrastverstärkung, wie auf der klinischen Vorstellung des Patienten gezeigtG (T1-post-Gadolinium-Magnetresonanztomographie (MRI) -Sequenzen). Die bisherige Erfahrung legt nahe, dass dieser Bereich ein lebensfähiges Tumorgewebe im Gegensatz zu nekrotischem Gewebe liefert.
   HINWEIS: Die Erzeugung von Scheiben aus der umgebenden (peritumoralen) weißen Materie wurde versucht; Allerdings begrenzten die Hintergrund-Autofluoreszenz und die verminderte Tumorzelldichte den experimentellen Nutzen dieser Scheiben.
8. Erhalten Sie Tumorgewebe bis zum Beginn der Tumorresektion. Vermeiden Sie die Sammlung von Tumorgewebe, die einem ausgedehnten bipolaren Kauterium ausgesetzt sind, was die Lebensfähigkeit des Gewebes aufgrund von thermischen Verletzungen beeinträchtigen kann. Gewebeproben während stückchenweise Tumorresektion erworben demons Lebensfähigkeit erhöht , wenn auf dem Gewebe aus langen en bloc - Resektionen erworben verglichen. Diese Beobachtung kann sich auf das differenzielle Tumorgewebe-Deprivation des Blutflusses als Folge der chirurgischen Resektion und der verlängerten Zeit zum Erwerb beziehen.
9. Falls gewünscht, markieren und lagern Tumorgewebe in getrennten konischen Rohren, um Proben zu isolierenAus verschiedenen Tumorregionen. ( Dh oberflächliches vs. tiefes Tumorgewebe). Präzise Gewebestellen können aufgezeichnet werden, wenn / wenn intraoperative chirurgische Navigation verfügbar ist.

3. Schneidekultur Vorbereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von frischem unfixiertem menschlichem Gewebe. Alle Proben werden als infektiös angenommen und sollten nach universellen Blut übertragenen Pathogenprotokollen behandelt werden. Geeignete persönliche Schutzausrüstung sollte jederzeit angezogen werden. Zangen und Skalpelle sollten vor dem Gebrauch 15 min UV-Licht ausgesetzt werden. Während des Gebrauchs sprühen die Werkzeuge mit 70% Ethanol (EtOH) intermittierend, so dass die Flüssigkeit vor dem Gebrauch verdampfen kann. Der Schneidvorgang wird halbsteril unter Verwendung einer horizontalen laminaren Strömungshaube mit gefilterter Luft durchgeführt.

1. Platzieren Sie Tumorgewebestücke in einer Petrischale mit eiskalten Verarbeitungsmedien. Um das Tumorgewebe zu waschen und adhärente rote Blutkörperchen zu minimieren, unsEine Pipette, um das Medium in der Petrischale vorsichtig zu tauschen und zu verwerfen.
2. Mit einem Skalpell, schneiden Tumorstücke in rechteckige Box Formen. Trimmgewebe Stücke bis ca. 3 mm x 3 mm x 10 mm. Entfernen Sie vorsichtig alle angebrachten Schiffe durch Exzision oder sanfte Traktion mit feiner Pinzette.
3. 5 - 7 ml 37 ° C Agarose in eine kleine würfelförmige (~ 2 cm ³ ) Kunststoff-Einbettungsform pipettieren. Bestätigen Sie die Temperatur der Agarose-Lösung ist nicht größer als 37 ° C mit einem sterilen Thermometer vor Gebrauch.
4. Lassen Sie Agarose für ca. 1 min auf einem Eisbett sitzen.
5. Legen Sie 2 - 4 Tumorgewebe "Streifen" in Agarose mit langer Achse vertikal vertikal.
   HINWEIS: Gewebestreifen neigen dazu, in der Agarose vor der Erstarrung "zu sinken". Um diese Komplikation zu vermeiden, halten Sie den Gewebestreifen vorübergehend in vertikaler Orientierung, bis Agarose weiter verfestigt wird.
6. Halten Sie das Gewebe mit Agarose-Schimmel auf einem Eisbett für 2 - 5 MeilenUm die Erstarrung zu erleichtern.
7. Schimmel aus Eis entfernen und vorsichtig den Agaroseblock entfernen, indem man die Seiten des Formulars mit einem Skalpell schneidet. Vermeiden Sie eine übermäßige Kraft auf den Block, der die Agarose brechen kann.
8. Verwenden Sie einen großzügigen Tropfen Cyanacrylat-Kleber, um den Agarose-Block an der Vibratom-Probenplatte zu befestigen. Leim für ca. 1 - 2 min einstellen lassen.
9. Füllen Sie das Vibratom-Reservoir mit eiskalten Verarbeitungsmedien, um den an der Probenplatte befestigten Agarose-Block zu tauchen.
10. Während des Schneidens blasen Sie 95% O ₂ /5% CO ₂ -Gasmischung in den Vibratom-Reservoir durch eine getrimmte sterile Plastikpipette.
11. Die Vibrationsdicke auf 300 - 350 μm einstellen.
12. Stellen Sie die Blattvorschubgeschwindigkeit und die Blattamplitude entsprechend der Gewebekonsistenz ein. "Steifer" GBM-Gewebe erfordert langsame Blättervorschubgeschwindigkeiten und höhere Amplitude. Die exakte Klinge Geschwindigkeit und Amplitude Einstellungen variieren je nach Vibratome Spezifikationen.
    HINWEIS: Beim Aufschneiden ergeben sich häufig mehrere Probleme. Wenn der Gewebestreifen aus dem Agaroseblock austritt, versuchen Sie, das Gewebe in eine Agarose höherer Konzentration einzubetten. Wenn die Tumorscheiben dicker als gewünscht sind (Maschinensatz) oder asymmetrisch sind, erhöhen Sie die Amplitude und verringern die Geschwindigkeit der Vibrationsklinge. Um sicherzustellen, dass das Tumorgewebe nicht durch den Klingenhalter geklebt oder "gezogen" wird, während das Aufschneiden auftritt, positionieren Sie den Mikrospatel vorsichtig zwischen den Klingenhalter und die Scheibe, wenn sich die Klinge bewegt.
13. Übertragen Sie Gewebeschnitte auf Petrischale mit eiskalten Verarbeitungsmedien mit einem Edelstahl-Mikrospatel.
14. Erhalten Sie 6-Well-Platten, die PTFE-Inserts und äquilibrierte Scheibenkulturmedien vom Inkubator enthalten (wie in Abschnitt 2, Schritt 4 hergestellt).
15. Tellergewebe Scheiben mit einem Edelstahl Mikrospatel. Minimieren Sie den direkten Kontakt und die Manipulation des Gewebes, indem Sie einen kleinen, feinen Borstenpinsel verwenden, um eine "flüssige Welle" zu erzeugen, um die Scheibe vorsichtig aus dem Spatel zu drückenAuf den Kultureinsatz.
    HINWEIS: Minimieren Sie die Menge an Verarbeitungsmedien, die auf die Oberseite des Gewebekultureinsatzes eingeführt werden. Wenn übermäßige Mengen an Medien übertragen werden, wodurch die Scheiben schweben, verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um das Medium zu entfernen.
16. Die 6-Well-Platten, die Tumorscheiben enthalten, in einen Inkubator geben, der bei 37 ° C mit einer 5% CO ₂ -Atmosphäre gehalten wird.
    HINWEIS: Das gesamte Einbettungs- und Schneidprotokoll sollte innerhalb von 90 min der Tumorgewebeerfassung aus dem Operationssaal abgeschlossen sein.

4. Scheibe Kultur Wartung

1. Nach 12 - 24 h, transportieren Sie die Scheibenkulturen, indem Sie jeden Einsatzrand mit einer sterilen Pinzette ergreifen und auf Platten mit frischen Scheibenkultur-Wartungsmedien übertragen. Vergewissern Sie sich, dass die in jeder Vertiefung aliquotierten Scheibenkultur-Wartungsmedien mindestens 15 Minuten vor dem Übertragen von Einsätzen im Inkubator ausgleichen.
2. Bewegen Sie die Einsätze in neue 6-Well-Platten mit frischen, äquilibrierten Slice CulTure media alle 48 h.
3. Wenn gewünscht, aliquot altes Scheiben Kulturmedium mit einer Pipette zur sofortigen Verwendung in biochemischen Assays ( dh ELISA) oder einfrieren bei -80 ° C für zukünftige Verwendung.

5. Tumorzellmarkierung über grünes Fluoreszenzprotein, das Retrovirus ausdrückt

ANMERKUNG: Zeitraffer-Mikroskopie zur Analyse der Tumorzellmigration erfordert eine stabile, langfristige fluoreszierende Markierung von Zellen innerhalb der Schichtkultur. Die Verwendung von Retrovirus wird vorgeschlagen, da es selektiv die Trennung von Zellen infiziert, wodurch die fluoreszierende Markierung innerhalb der Tumorzellpopulation im Gegensatz zu Mikroglia oder anderen Zelltypen, die in der Scheibe vorhanden sind, angereichert wird. Standardisierung der Infektion läßt vermuten , dass ein viraler Titer von 10 ⁴ KBE / & mgr; l zu einer ausreichenden grün fluoreszierender Protein - Expression für die Verfolgung und Analyse der Zellmigration. Erhöhter Virustiter, Verwendung von nicht-selektivem Virus ( dh Adenovirus, Lentivirus) oder otIhre Mittel zur Etikettierung aller Zellen können die Identifizierung klarer Zellgrenzen während der Migration ausschließen und damit die Analyse komplizieren. Die Verwendung von alternativen Leuchtstoffmarkern kann nach Bedarf genutzt und optimiert werden.

1. Erhalten Sie Retrovirus zur Infektion von Tumorscheiben entweder über Standardprotokolle ^{5 , 14} oder aus einer handelsüblichen Quelle. Verdünne den viralen Überstand durch das entsprechende Volumen in nicht - ergänztes Medium neuronal Zugabe einen Virustiter von 10 ⁴ KBE / & mgr; l zu erreichen.
2. Zwischen 7 - 10 Tagen Kultur infizieren die interessierenden Tumor-Slice-Kulturen mit 5 - 10 μl Virus (10 ⁴ CFUs / μL). Legen Sie das Virus vorsichtig tropfenweise auf die Oberfläche jeder Gewebescheibe. Verringern Sie das überstehende Volumen, wenn die Scheibe auf der Oberfläche des Einsatzes schwimmt. Rücklaufplatten mit Scheibenkulturen zum Inkubator.
3. Beurteilen Sie die Scheiben für markierte Tumorzellen ab 24 h nach Virusinfektion (siehe Abschnitt 6). Diese Zeitverzögerung variiert in Abhängigkeit von der viralen Einarbeitung und der Fluoreszenzgenexpressionskinetik. Für die hier verwendeten viralen Konstrukte war 72 h erforderlich, um ein robustes Fluoreszenzsignal mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop zu beobachten.
   HINWEIS: Selten zeigt Slices eine überwiegend periphere Verteilung von viral markierten Zellen, die die konfokale Bildgebung komplizieren können. Um diese Komplikation zu vermeiden, versuchen Sie, die Schichtdicke und die Dickenvariation über die Scheibe zu reduzieren. Wenn die Scheibenkultur eine dickere Region nahe dem Zentrum hat, kann dies eine ausreichende Nährstoffpenetration verhindern, wodurch die Population der aktiv teilenden Tumorzellen begrenzt wird. Ein qualitativer Assay zum Screening auf diese Komplikation ist die Zugabe eines Tetrazoliumfarbstoffreagens ( dh MTT) zu dem Schichtkulturmedium. Bereiche der Scheibe, die nicht blau nach dem Hinzufügen der Reagenz zeigen, zeigen einen Mangel an metabolischen Aktivität und kompromittiert Scheibe Gesundheit.

Le "> 6. Zeitraffer Einzelne Photon Laser Scanning Konfokale Bildgebung der Tumorzellmigration

ANMERKUNG: Nach erfolgreicher Transduktion und Gesundheit der Kultur wird bestätigt, dass Zellen unter Kontrollbedingungen abgebildet werden können, gefolgt von einer gleichzeitigen Bildgebung unter Behandlungsbedingungen. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden die Zellen in jeder Bedingung für 12 Stunden erfolgreich abgebildet und verfolgt. Allerdings können auch kürzere oder längere Bild- und Umweltmanipulationen informativ sein.

1. Laden des Mikroskops
   1. Vor der Bildgebung 1 ml frische Scheibenmedien in eine Glasbodenschale geben.
   2. Lassen Sie das Medium in der Glasbodenschale ein, um sich 15 min in einem Inkubator auszurotten.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können lösliche Markierungsmittel, wie z. B. fluoreszenzkonjugierte Lektine ( dh Isolectin IB ₄ für Mikroglia-Markierung) oder Liganden-konjugierte Quantenpunkte, zu den Schichtkulturmedien zur Identifizierung der Zelle hinzugefügt werdenBei der Bildgebung.
   3. Übertragen Sie den Einsatz auf eine Glasbodenschale mit steriler Pinzette in einer laminaren Strömungshaube. Transportieren Sie die Schale zum Mikroskopstadium.
   4. Pflegen Sie Scheibenkulturen bei 37 ° C und 5% CO ₂ -Atmosphäre in einem versiegelten Mikroskop-Bühnen-Inkubator. Verwenden Sie die sterile H ₂ O-Befeuchtung der Inkubationskammer, falls vorhanden, um eine übermäßige Medienverdampfung zu vermeiden (besonders wichtig für längere Bildgebungsexperimente).
   5. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einem langen Arbeitsabstand 10X Luftziel und Laseranregung für Einzelphotonen und / oder Multiphotonen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Objektiv des Mikroskops einen ausreichenden Arbeitsabstand bietet. Als Ergebnis der zusätzlichen Höhe aus dem Bühnen-Top-Inkubator, Glasbodenschale und Gewebekultureinsatz sind lange Arbeitsentfernungsziele kritisch.
   6. Sichern Sie die Glasbodenplatte, entfernen Sie die Plastik-Petrischalenabdeckung und bedecken Sie sie mit einem Gas-Durchlässige Membran.
2. Bildaufnahme
   1. Verwenden Sie das Mikroskop, um die Scheibe visuell zu untersuchen und ein geeignetes Feld mit einer ausreichenden Dichte von fluoreszenzmarkierten Tumorzellen zwischen der Scheibenkante und dem Zentrum zu lokalisieren. Vermeiden Sie Bildgebungsfelder am Rand der Scheibe, aufgrund der erhöhten Anfälligkeit von Gewebeverschiebungen während der Bildgebung. Zur Verringerung dieser Verschiebung können Gewebe-Scheiben-Harfen eingesetzt werden.
   2. Verwenden Sie Imaging-Software im multidimensionalen Analysemodus, um die ersten (unteren) und letzten (oberen) Z-Stack-Grenzen zu setzen, so dass alle zu erfassenden Positionen sichtbares fluoreszierendes zelluläres Signal enthalten. Die Bildgebung über 150 - 200 μm der Scheibe mit einem konstanten Z-Schritt von 10 μm lieferte eine adäquate Auflösung für die Verfolgung von Zellpfaden (dies kann für individuelle Bildgebungsbedürfnisse angepasst werden).
   3. Wenn das Mikroskop eine motorisierte Bühne hat, ist für jede Z-Stack-Erfassung eine ausreichende Zeit zugänglich. Legen Sie das Zeitintervall zwischen den Akquisitionen gleich einScan-Zeit pro Position x Anzahl der Positionen zum Bild ( dh abgebildete Tumorbereiche).
      HINWEIS: Zur gleichzeitigen Erregung der grünen und roten Fluorophore wird ein zweizeiliges Laserlinien-Scan-Programm mit gleichzeitiger 488 nm und 633 nm Anregung verwendet. Die gewählte Wellenlänge der Laseranregung variiert je nach den ausgeprägten einzelnen fluoreszierenden Proteinen.
   4. Halten Sie einheitliche Laserleistung und konfokale Pinhole-Einstellungen zwischen den abgebildeten Tumorregionen ein. Nutzen Sie die niedrigste Laserleistungseinstellung, die erforderlich ist, um die Tumorzellenkörper und Prozesse klar zu begrenzen, um die Phototoxizität zu begrenzen. Spezifische bildgebende Parametereinheiten ( dh Leistung und konfokale Pinhole-Einstellungen) variieren je nach Mikroskop- und Laserquellenspezifikation.
   5. Kompensieren Sie für potenzielle Medien Verdunstung durch Hinzufügen von 2 - 3 "Puffer" Z-Stack-Schritte in den Fokus Ebenen Fortschritte auf das Ziel. Dies verhindert effektiv, dass das Gewebe den Bereich der Z-Stack-Erfassung verlässtIonen in der vertikalen Ebene.

7. Bildnachverarbeitung und Tumorzellverfolgung

HINWEIS: Viele konfokale Bildgebungssysteme sind mit proprietärer Bildverarbeitungssoftware ausgestattet. Die nachfolgend erläuterten Verarbeitungsschritte umfassen ein allgemeines Protokoll, das über Softwareplattformen durchgeführt werden kann. Für die Open-Source-Plattformen, NIH ImageJ und MTrackJ ^{15, werden} spezifische Anweisungen gegeben.

1. Öffnen Sie eine Z-Stack-Datei. Klicken Sie in ImageJ auf "Bild → Stapel → Z-Projekt". Wählen Sie den ersten und letzten Z-Stack aus und wählen Sie "Max Intensity" als Projektionstyp. Das Ergebnis ist ein Rendering namens Maximum Intensity Projektion (MIP). Erstellen Sie ein MIP aus jedem Satz von Z-Stack-Bildern, die in jeder Region abgebildet sind.
2. Verknüpfen Sie die MIPs aus jeder Region, um eine Zeitreihe zu erstellen. Klicken Sie auf "Bild → Stapel → Bilder zum Stapeln".
3. Manuell den Standort identifizierenDes Zellkörpers "Schwerpunkt" durch Auswahl des visuell angenäherten Mittelpunktes des Tumorzellkörpers. Dies geschieht durch Anklicken des Zellenkörpers mit der "Add" -Spurfunktionalität von MTrackJ (ein Open-Source-Plugin für NIH ImageJ).
4. Klicken Sie hier, um die Zellenkörperposition in jedem Rahmen der Bildserie abzugrenzen. Dies schafft für jede Zelle einen einzigartigen "Track". Sequenziell markieren Sie die Zellenkörperplätze der nächsten Zelle. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Zellmigrationswege verfolgt werden.
5. Sobald eine Population von Zellen in einer gegebenen Tumor-Mikroregion verfolgt wird, exportieren Sie alle Zellspurkoordinaten mit der "Maß" -Funktion von MTrackJ. Speichern Sie die Datei als .xls-Format, damit die Rohdaten mit Hilfe von Tabellenkalkulationen oder benutzergenerierten Software analysiert werden können.
6. Verwenden Sie die Koordinaten, die für jeden Punkt entlang einer Zelle Migrationsspur aufgezeichnet wurden, um quantitative Analysen einschließlich Ableitung von Migrationsgeschwindigkeit, Direktionalität und andere Migration durchzuführenMetriken, wie ¹⁶ in Parker et al.
   HINWEIS: Alle berechneten Entfernungen und Geschwindigkeiten sind Unterschätzungen der Istwerte. Dies ist bei der Umwandlung von dreidimensionalen Bildern (und Migrationswegen) zu zweidimensionalen Daten durch Erzeugung von maximalen Intensitätsprojektionen inhärent.

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Ergebnisse

Unsere Gruppe hat erfolgreich Schnittkulturen von über 50 Patienten, die sich einer ersten GBM-Resektion unterziehen, erfolgreich produziert. Dieses Scheibenerzeugungs-, Kultur-, Retroviral-Labeling-, Imaging- und Migrationsanalyse-Protokoll wurde in einen reproduzierbaren Workflow gestrafft ( Abbildung 1 ). Kritisch zeigen diese organotypischen GBM-Scheiben die Übereinstimmung mit dem Ursprung des Tumorgewebes während der Kultur, einschließlich der Erhaltung v...

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Diskussion

Organotypische Scheibenkulturen aus menschlichem Krebsgewebe bieten eine attraktive und nicht genutzte Plattform für präklinische Translationsversuche. Das Verständnis von Populationsniveaus von Tumorzellen in Bezug auf Migration, Proliferation und Zelltod in der nativen Tumormikroumgebung fehlt. Kritisch kann das Studium der Tumorreaktion auf die Therapie in einer dynamischen, zeitaufgelösten Weise auf der Ebene des Zellverhaltens Licht auf neue Mechanismen der Behandlungsresistenz werfen. Menschliche Tumorscheiben...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Supplement	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas	Fisher Scientific	S50823	Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors)	Fisher Scientific	17-989-001	Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm
LSM 510 Confocal Micoscope	Zeiss	LSM 510	10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON Germany	(Discontinued)	Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.