Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas

Resumo

Os modelos atuais ex vivo de glioblastoma (GBM) não são otimizados para o estudo fisiologicamente relevante da invasão de tumores humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de fatia organotípicas a partir de tecido GBM humano fresco. É fornecida uma descrição da microscopia por lapso de tempo e técnicas quantitativas de análise de migração celular.

Resumo

Glioblastoma (GBM) continua a apresentar um prognóstico clínico extremamente fraco, apesar da terapia cirúrgica, quimioterapêutica e de radiação. A invasão progressiva do tumor no parênquima cerebral circundante representa um desafio terapêutico duradouro. Para desenvolver terapias anti-migração para GBM, os sistemas modelo que fornecem um fundo fisiologicamente relevante para experimentação controlada são essenciais. Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de culturas de fatia de tecido GBM humano obtido durante ressecção cirúrgica. Essas culturas permitem a experimentação ex vivo sem passar por meio de xenoenxertos de animais ou culturas de células únicas. Além disso, descrevemos o uso da microscopia confocal de varredura a laser em lapso temporal em conjunto com o rastreamento celular para estudar quantitativamente o comportamento migratório das células tumorais e resposta associada à terapêutica. As fatias são reproduzíveis geradas dentro de 90 minutos da aquisição de tecido cirúrgico. Células fluorescentes mediadas por RetrovirallyAs imagens de imagem confocal e de migração de células tumorais são posteriormente concluídas dentro de duas semanas de cultura. Nós usamos com sucesso essas culturas de fatia para descobrir fatores genéticos associados ao aumento do comportamento migratório no GBM humano. Além disso, validamos a capacidade do modelo para detectar variações específicas do paciente em resposta a terapias anti-migração. Avançando, as culturas de fatia GBM humanas são uma plataforma atraente para uma avaliação rápida e ex vivo da sensibilidade do tumor a agentes terapêuticos, a fim de promover a terapia neurocircóológica personalizada.

Introdução

O estudo laboratorial do glioblastoma (GBM) é dificultado pela falta de modelos que recapitulem fielmente as características patológicas necessárias da doença humana, nomeadamente a migração de células tumorais e a invasão. Estudos comparativos de ensaios de invasão in vitro 2D e 3D, bem como modelos de cultura de fatias de roedores 3D, descobriram programas de migração celular mecanicamente dispares nestes dois contextos, potencialmente limitando a translatabilidade dos achados dos sistemas 2D à doença humana ^{1 , 2 , 3} . O paradigma de cultura e imagem de corte de tumor organotípico aqui descrito permite o estudo da migração de células tumorais em fatias de tecido de tumor humano ex vivo obtido a partir de ressecção cirúrgica. Assim, as culturas de fatia de tecido tumoral ressecado cirurgicamente em conjunto com microscopia confocal de lapso de tempo fornecem uma plataforma para estudar a migração de células tumorais no nativoMicroambiente sem dissolução de tecido ou passagem de cultura.

Existe uma extensa literatura que emprega modelos de cultura de fatias de cérebros de roedores de GBM gerados a partir de xenoenxertos de tumores humanos, tumores induzidos por retrovirais e sobreposições celulares para estudar invasão tumoral ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Recentemente, vários grupos descreveram a geração de culturas de fatia organotípicas diretamente do tecido GBM humano ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10} . No entanto, existe uma variação acentuada entre os protocolos publicados em relação à técnica de corte e aos meios de cultura. Além disso, o uso de culturas de fatias organotipicas se concentrou em pontos finais experimentais estáticos que incluíram mudanças no sinal celularNg, proliferação e morte. O protocolo aqui descrito expande sobre paradigmas de cultura de fatia anteriores, incorporando observação resolvida no tempo de comportamentos dinâmicos de células tumorais através de microscopia confocal de varredura laser com lapso de tempo. A descoberta recente de inter ¹¹ e intratumoral ^{12 , 13} variação genética no GBM humano ressalta a importância de vincular essa heterogeneidade com os comportamentos das células tumorais e suas implicações na resposta do tumor à terapia. Aqui, relatamos um protocolo simplificado e reprodutível para o uso de culturas de fatia diretas de um tecido de câncer humano para visualizar migração de células tumorais em tempo quase em tempo real.

Protocolo

Antes de iniciar a coleta de amostras de tecido do paciente, o consentimento informado deve ser obtido de cada paciente de acordo com um protocolo aprovado da Junta de Revisão Institucional (IRB). Os autores deste protocolo receberam o consentimento para o trabalho descrito nos protocolos IRB aprovados no Hospital da Universidade do Colorado e no Hospital Inova Fairfax. Os dados coletados dessas culturas de fatia não foram usados ​​para direcionar as decisões de cuidados ao paciente.

1. Preparação pré-cortar

1. Prepare mídia de "processamento de tecidos" e mídia de "manutenção de cultura de fatia" no dia anterior à ressecção de tumor planejada e coleta de tecido (ou utilize mídia gerada anteriormente dentro de 2 semanas). Adicione 5 mL de solução de penicilina-estreptomicina (10 000 U / mL) e 5 mL de HEPES 1 M para 500 mL de um DMEM com alto teor de glicose para gerar o meio de processamento de tecidos.
2. Prepare 250 mL de meios de manutenção de cultura de fatia usando uma base de meio neuronal ( por exemplo , Neurobasal) witHalo de vermelho de fenol. Complemente este meio com HEPES 10 mM, 1x suplemento B-27, L-glutamina 400 μM, dipeptídeo L-alanil-L-glutamina 600 μM, penicilina 60 U / mL, estreptomicina 60 μg / mL e 6 nistatina U U / mL.
3. Armazene todas as mídias a 4 ° C por não mais de 2 semanas.

2. Dia de cirurgia: aquisição de tecidos

1. No dia da aquisição do tecido, prepare 50 - 100 mL de soluções de 1% e 2% (% em peso / volume) de agarose de baixa temperatura de fusão em meios de processamento de tecidos usando produtos de vidro autoclavados e técnica estéril em uma capa de fluxo laminar. Ambas as concentrações de agarose são necessárias para acomodar a variação imprevisível da consistência do tecido tumoral.
2. Aqueça a suspensão de agarose, usando um microondas, até observar uma ebulição suave. Coloque a solução de agarose em um banho de água a 37 ° C para manter no estado líquido até o uso.
3. Coloque 1 mL de meio de manutenção de cultura de fatia em cada poço de uma placa de 6 poços.
4. Use um estérilFórceps para colocar inserções de cultura de PTFE vazias em cada poço. Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada, revestida com água, com uma atmosfera de 5% de CO ₂ mantida a 37 ° C.
5. Usando uma pipeta de Pasteur estéril numa câmara de fluxo laminar, de espuma uma mistura de 95% _O2 / 5% de gás de CO ₂ num balão contendo gelo tecido frio meios de processamento para, aproximadamente, 15 a 30 min, antes da aquisição tecido tumoral. O uso de meios supra-oxigenados minimiza a hipoxia no tecido em massa durante o processamento.
6. Prepare os tubos cônicos de 50 mL rotulados (suficiente para o número desejado de regiões tumorais individuais a serem isoladas) contendo alíquotas de 20 mL de meios de processamento gelados supra-oxigenados para transportar tecido entre a sala de operação e a instalação de fatiamento.
7. Em conjunto com um neurocirurgião, planeja pré-operativamente a região tumoral para a aquisição da amostra. Selecione uma região de tumor com aumento de contraste como demonstrado na imaginação clínica do pacienteG (sequências de ressonância magnética pós-gadolínio T1 (MRI)). A experiência anterior sugere que esta área produz tecido tumoral viável em oposição ao tecido necrótico.
   NOTA: foi tentada a geração de fatias da substância branca circundante (peritumoral); No entanto, a autofluorescência de fundo e a diminuição da densidade de células tumorais limitaram a utilidade experimental dessas fatias.
8. Obtenha tecido tumoral no início da ressecção tumoral. Evite a coleta de tecido tumoral exposto ao cauterismo bipolar extensivo, o que pode comprometer a viabilidade do tecido secundário à lesão térmica. As amostras de tecido adquiridas durante a ressecção tumoral fragmentada demonstram viabilidade melhorada quando comparadas aos tecidos adquiridos a partir de ressecções em bloco longas. Esta observação pode referir-se à privação diferencial do tecido tumoral do fluxo sanguíneo como resultado da ressecção cirúrgica e tempo prolongado para a aquisição.
9. Se desejar, rotular e armazenar o tecido tumoral em tubos cônicos separados para isolar amostrasDe regiões tumorais distintas. (Ou seja, tecido superficial versus tecido tumoral profundo). Localizações precisas de tecido podem ser registradas se / quando a navegação cirúrgica intra-operatória estiver disponível.

3. Fatia Cultura Preparação

NOTA: Este protocolo requer o uso de tecido humano fresco não fixado. Todas as amostras são presumidas como infecciosas e devem ser manipuladas de acordo com os protocolos de patógenos transmitidos pelo sangue. O equipamento de proteção pessoal apropriado deve ser colocado em todos os momentos. A pinça e os bisturis devem ser expostos a 15 min de luz UV antes do uso. Durante o uso, pulverize intermitentemente as ferramentas com etanol a 70% (EtOH), permitindo que o tempo de evaporação do líquido antes do uso. O processo de corte é realizado de forma semi-estéril, utilizando um capuz de fluxo laminar horizontal com ar filtrado.

1. Coloque peças de tecido de tumor em uma placa de Petri com meios de processamento gelados. Para lavar o tecido do tumor e minimizar os glóbulos vermelhos aderentes, nósEa pipeta para trocar e descartar a mídia na placa de Petri três vezes.
2. Usando um bisturi, corte peças de tumor em formas de caixa retangulares. Ajustar peças de tecido para aproximar 3 mm x 3 mm x 10 mm. Remova com cuidado todas as embarcações presas por excisão ou tração suave com fórceps finos.
3. Pipetar 5 - 7 mL de agarose a 37 ° C em um molde de incrustação de plástico pequeno em forma de cubo (~ 2 cm ³ ). Confirmar a temperatura da solução de agarose não é superior a 37 ° C com um termômetro estéril antes da utilização.
4. Permitir que agarose se sente durante aproximadamente 1 minuto sobre uma cama de gelo.
5. Coloque 2 a 4 tiras de tecido de tumor em agarose com eixo longo orientado verticalmente.
   NOTA: As tiras de tecido tendem a "afundar" na agarose antes da solidificação. Para evitar esta complicação, mantenha temporariamente a tira de tecido em orientação vertical até que a agarose seja solidificada.
6. Mantenha o tecido contendo o molde de agarose em uma cama de gelo por 2 a 5 miN para facilitar a solidificação.
7. Retire o molde do gelo e remova suavemente o bloco de agarose cortando os lados da forma com um bisturi. Evite colocar força excessiva no bloco, que pode frustrar a agarose.
8. Use uma gota generosa de cola de cianoacrilato para afixar o bloco de agarose na placa do espécime de vibração. Deixe a cola ser ajustada por aproximadamente 1 a 2 min.
9. Encha o reservatório de vibração com meios de processamento gelados para submergir o bloco de agarose afixado na placa do espécime.
10. Durante o corte, bolha de 95% _{de O2} / 5% de CO ₂ da mistura de gases para dentro do reservatório vibratome através de uma pipeta de plástico estéril aparado.
11. Defina a espessura da fatia de vibração para 300 a 350 μm.
12. Ajuste a velocidade de avanço da lâmina e a amplitude da lâmina de acordo com a consistência do tecido. O tecido GBM "mais rígido" requer velocidades de avanço da lâmina mais lentas e maior amplitude. As configurações exatas da velocidade da lâmina e da amplitude variam de acordo com as especificações do vibratome.
    NOTA: várias questões geralmente ocorrem durante o corte. Se a tira de tecido se desprender do bloqueio de agarose, tente incorporar o tecido em uma agarose com maior concentração. Se as fatias do tumor forem mais espessas do que o desejado (conjunto da máquina), ou são assimétricas, aumente a amplitude e diminua a velocidade da lâmina vibratoma. Para garantir que o tecido do tumor não seja preso ou "arrastado" pelo suporte da lâmina, à medida que ocorre o corte, posicione cuidadosamente a microspatula entre o suporte da lâmina e a fatia, à medida que a lâmina se move.
13. Transfira as fatias de tecido para a placa de Petri com meios de processamento gelados usando uma microspatula de aço inoxidável.
14. Obtenha placas de 6 poços contendo inserções de PTFE e meios de cultura de fatia equilibrados da incubadora (conforme preparado na seção 2, passo 4).
15. Corte fatias de tecido usando uma microspatula de aço inoxidável. Minimize o contato direto e manipulação de tecido, usando um pincel de cerdas finas para gerar uma "onda fluida" para empurrar suavemente a fatia da espátula aE na inserção de cultura.
    NOTA: Minimize a quantidade de mídia de processamento introduzida na parte superior da inserção de cultura de tecidos. Se quantidades excessivas de mídia forem transferidas, fazendo com que as fatias flutuem, use uma pipeta Pasteur estéril para remover a mídia.
16. Retornar as placas de 6 poços contendo fatias de tumor para uma incubadora mantida a 37 ° C com uma atmosfera de CO _{2 a} 5%.
    NOTA: Todo o protocolo de incorporação e corte deve ser completado dentro de 90 min da aquisição de tecido tumoral na sala de operações.

4. Cortar a manutenção da cultura

1. Após 12 - 24 h, transfira as culturas da fatia agarrando cada rebordo de inserção com uma pinça estéril e transfira para placas que contenham meios de manutenção de cultura de fatia fresca. Certifique-se de que a mídia de manutenção da cultura da fatia aliquoteada em cada poço se equilibre na incubadora por pelo menos 15 min antes de transferir as pastilhas.
2. Mova as pastilhas para novas placas de 6 poços com fatias frescas frescasTure mídia a cada 48 h.
3. Se desejado, alíquota de meio de cultura de fatia de idade com uma pipeta para uso imediato em ensaios bioquímicos ( ou seja, ELISA) ou congelar a -80 ° C para uso futuro.

5. Rotulação de células tumorais através de proteína de fluorescência verde que expressa o retrovírus

NOTA: O microscópio de lapso de tempo para análise da migração de células tumorais requer rotulagem fluorescente estável a longo prazo das células dentro da cultura da fatia. O uso de retrovírus é sugerido porque infecta seletivamente as células em divisão, enriquecendo a rotulagem fluorescente dentro da população de células tumorais em oposição à microglia ou a outros tipos de células presentes dentro da fatia. A padronização da infecção sugere que um título viral de 10 ⁴ UFC / μL resulta em uma expressão de proteína fluorescente verde suficiente para o rastreamento e análise da migração celular. Aumento do título viral, uso de vírus não seletivos ( ou seja , adenovírus, lentivírus) ou otSeu meio de rotular todas as células pode impedir a identificação de limites celulares claros durante a migração, o que complica a análise. O uso de marcadores fluorescentes alternativos pode ser utilizado e otimizado conforme necessário.

1. Obter retrovírus para infecção de fatias de tumor, quer através de protocolos padrão ^{5 , 14} ou de uma fonte comercialmente disponível. Diluir o sobrenadante viral adicionando o volume apropriado em meio neuronal não suplementado para obter um título viral de 10 ⁴ UFC / μL.
2. Entre 7 e 10 dias de cultura, infectam as culturas de fatiga do tumor de interesse com 5 - 10 μL de vírus (10 ⁴ CFUs / μL). Coloque o vírus gentilmente gota a gota na superfície de cada fatia de tecido. Diminua o volume do sobrenadante adicionado se a fatia flutuar na superfície da inserção. Devolver placas contendo culturas de fatia para incubadora.
3. Avalie as fatias das células tumorais marcadas a partir das 24 h após Infecção viral (ver seção 6). Esta demora no tempo variará dependendo da incorporação viral e da cinética de expressão de genes de fluorescência. Para as construções virais usadas aqui, 72 h foram obrigados a observar o sinal fluorescente robusto com um microscópio padrão de epifluorescência.
   NOTA: Raramente, as fatias exibem uma distribuição predominantemente periférica de células marcadas viralmente, o que pode complicar a imagem confocal. Para evitar esta complicação, tente reduzir a espessura da fatia e a variação da espessura em toda a fatia. Se a cultura da fatia tiver uma região mais espessa perto do centro, isso pode impedir a penetração adequada de nutrientes, limitando assim a população de células tumorais que dividem ativamente. Um ensaio qualitativo para detectar esta complicação é a adição de um reagente de corante de tetrazólio ( isto é, MTT) ao meio de cultura de fatia. As áreas da fatia que não ficam azuis depois de adicionar o reagente indicam falta de atividade metabólica e compromete a saúde da fatia.

Lex.jpg 6. Time-lapse Single Photon Laser Scanning Confocal Imaging of Tumor Cell Migration

NOTA: Após a confirmação da transdução e da saúde bem sucedida da cultura, as células podem ser imaginadas sob condições de controle, seguidas de um período igual de imagem em condições de tratamento. Usando este protocolo, as células foram criadas com sucesso e rastreadas durante 12 horas em cada condição. No entanto, períodos mais curtos ou mais longos de imagem e manipulação ambiental também podem ser informativos.

1. Carregando o microscópio
   1. Antes da imagem, coloque 1 mL de mídia de fatia fresca em um prato inferior de vidro.
   2. Permitir que a mídia no prato de fundo de vidro se equilibre em uma incubadora por 15 min.
      NOTA: Neste ponto, agentes de rotulagem solúveis, tais como lectinas fluorescentemente conjugadas ( isto é, Isolectina IB ₄ para marcação de microglia) ou pontos quânticos conjugados com ligandos, podem ser adicionados ao meio de cultura de fatia para identificação de célulasSub-populações ular durante a imagem.
   3. Transfira a inserção para ser fotografada em um prato de fundo de vidro usando pinças estéril em uma capa de fluxo laminar. Transporte o prato para o estágio do microscópio.
   4. Manter culturas de fatia a 37 ° C e 5% _de atmosfera de CO2 em uma incubadora de palco com um microscópio selado. Utilize humidificação H ₂ O estéril da câmara de incubação se disponível para evitar a evaporação excessiva da mídia (especialmente importante para experimentos de imagem mais longos).
   5. Utilize um microscópio confocal com uma longa distância de trabalho objetivo de ar 10X e excitação a laser para fotón único e / ou multifônico.
      NOTA: Certifique-se de que a lente objetiva do microscópio proporciona distância de trabalho adequada. Como resultado da altura adicionada da incubadora de palco, do prato de fundo de vidro e da inserção de cultura de tecidos, os objetivos longos de distância de trabalho são críticos.
   6. Prenda a placa de fundo de vidro, remova a tampa de plástico Petri e cubra com um gás-Membrana permeável.
2. Aquisição de imagem
   1. Use o microscópio para inspecionar visualmente a fatia e localize um campo adequado com densidade adequada de células tumorais marcadas de forma fluorescente entre a borda da fatia e o centro. Evite campos de imagem na borda da fatia, devido ao aumento da suscetibilidade dos movimentos de tecido durante a imagem. As harpas de fatia de tecido podem ser empregadas para limitar esta mudança.
   2. Use o software de imagem em modo de análise multidimensional para definir os primeiros limites (da parte inferior) e o último (topo) da camada Z, de modo que todas as posições a serem visualizadas contenham um sinal celular fluorescente visível. A imagem através de 150 a 200 μm da fatia, com um passo Z constante de 10 μm forneceu uma resolução adequada para o rastreamento de caminhos celulares (isso pode ser ajustado para necessidades individuais de imagem).
   3. Se o microscópio tiver um estágio motorizado, assegure-se que seja permitido tempo adequado para cada aquisição de pilha Z. Defina o intervalo de tempo entre aquisições para igualTempo de varredura por posição x número de posições para imagem ( ou seja, regiões tumorais imaginadas).
      NOTA: Para a excitação simultânea dos fluoróforos verdes e vermelhos, utilize um programa de varredura de linha a laser de duas linhas, com excitação simultânea de 488 nm e 633 nm. O comprimento de onda da excitação laser selecionada variará de acordo com as proteínas fluorescentes individuais expressas.
   4. Mantenha o poder uniforme do laser e as configurações confinais do pinhole entre as regiões tumorais imaginadas. Utilize a configuração de potência de laser mais baixa necessária para demarcar claramente os órgãos e processos celulares tumorais para limitar a fototoxicidade. As unidades de parâmetros de imagem específicas ( ou seja, configurações de energia e configurações de pinhole confocal) variam de acordo com as especificações do microscópio e fonte de laser.
   5. Compensar a potencial evaporação da mídia, adicionando 2 - 3 "buffer" etapas de pilha Z nos aviões focais avançando em direção ao objetivo. Isso efetivamente impede o tecido de deixar o alcance do acervo Z-stackÍons no plano vertical.

7. Pós-processamento de imagens e rastreamento de células tumorais

NOTA: Muitos sistemas de imagem confocal são equipados com software de processamento de imagem proprietário. As etapas de processamento discutidas abaixo compreendem um protocolo geral, que pode ser executado em plataformas de software. Serão fornecidas instruções específicas para plataformas de código aberto, NIH ImageJ e MTrackJ ¹⁵ .

1. Abra um arquivo de pilha em Z. No ImageJ, clique em "Imagem → Pilhas → Projeto Z". Escolheu a primeira e última pilha Z para incluir, e escolheu "Max Intensity" como o tipo de projeção. O resultado é uma renderização chamada de projeção de intensidade máxima (MIP). Crie um MIP de cada conjunto de imagens de pilhas Z capturadas em cada região criada.
2. Concatene os MIPs de cada região para criar uma série de tempo. Clique em "Imagem → Pilhas → Imagens para empilhar".
3. Identificar manualmente a localizaçãoDo "centroide" do corpo da célula selecionando o ponto central visualmente aproximado do corpo da célula tumoral. Isso é conseguido clicando no corpo da célula usando a funcionalidade de trilha "adicionar" de MTrackJ (um plugin para código aberto para NIH ImageJ).
4. Clique para demarcar a localização do corpo da célula em cada quadro da série de imagens. Isso cria uma única "faixa" para cada célula. Seqüencialmente, marque as localizações do corpo da célula próxima. Repita esse processo até que todos os caminhos de migração celular sejam rastreados.
5. Uma vez que uma população de células é rastreada em uma determinada micro região de tumor, exporte todas as coordenadas de trilha celular usando a função "medida" de MTrackJ. Salve o arquivo como um formato .xls para que os dados brutos possam ser analisados ​​usando planilha eletrônica ou software gerado por usuários.
6. Use as coordenadas registradas para cada ponto ao longo da faixa de migração de uma célula, para realizar análises quantitativas, incluindo derivação de velocidade de migração, direcionalidade e outras migraçõesMétricas, como descrito em Parker et al ¹⁶ .
   NOTA: Todas as distâncias e velocidades calculadas são sub-estimativas de valores reais. Isso é inerente à transformação de imagens tridimensionais (e caminhos de migração) para dados bidimensionais através da geração de projeções de intensidade máxima.

Resultados

Nosso grupo gerou com sucesso culturas de fatia de mais de 50 pacientes submetidos à ressecção GBM inicial. Este protocolo de produção, cultura, reviragem retroviral, imagem e análise de migração de fatia foi simplificado em um fluxo de trabalho reprodutível ( Figura 1 ). Criticamente, essas fatias organotípicas de GBM demonstram concordância com o tecido tumoral originário em toda a cultura, incluindo manutenção de características patológicas e mic...

Discussão

As culturas de fatias organotípicas de tecido de câncer humano fornecem uma plataforma atraente e subutilizada para experimentação pré-clínica de tradução. Não existe conhecimento dos comportamentos a nível populacional das células tumorais no que diz respeito à migração, proliferação e morte celular no microambiente do tumor nativo. Criticamente, estudar a resposta tumoral à terapia de forma dinâmica e resolvida no tempo ao nível do comportamento celular pode esclarecer novos mecanismos de resistênc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Supplement	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas	Fisher Scientific	S50823	Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors)	Fisher Scientific	17-989-001	Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm
LSM 510 Confocal Micoscope	Zeiss	LSM 510	10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON Germany	(Discontinued)	Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.