Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi

Riepilogo

I modelli attuali ex vivo di glioblastoma (GBM) non sono ottimizzati per studi fisiologicamente rilevanti di invasione tumorale umana. Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la manutenzione di culture organiche di fetta da tessuti freschi umani GBM. Viene fornita una descrizione della microscopia a tempo trascorso e tecniche quantitative di analisi delle migrazioni di cellule.

Abstract

Glioblastoma (GBM) continua a portare una prognosi clinica estremamente scarsa, nonostante terapia chirurgica, chemioterapica e radioterapia. L'invasione tumorale progressiva nel parenchima del cervello circostante rappresenta una dura sfida terapeutica. Per sviluppare terapie anti-migrazione per GBM, sono essenziali sistemi di modello che forniscono un background fisiologicamente rilevante per la sperimentazione controllata. Qui presentiamo un protocollo per la generazione di culture di fetta da tessuto umano GBM ottenuto durante la resezione chirurgica. Queste colture permettono la sperimentazione ex vivo senza passaggio attraverso xenograft di animali o colture di cellule singole. Inoltre, descriviamo l'uso di microscopia confocale di scansione laser a tempo intervallato in combinazione con il monitoraggio delle cellule per studiare quantitativamente il comportamento migratorio delle cellule tumorali e la risposta associata alle terapie. Le fette sono generate in modo riproducibile entro 90 minuti dall'acquisizione di tessuti chirurgici. Cellula fluorescente mediata retroviralmente laIl rilievo, l'imaging confocale e le analisi delle migrazioni delle cellule tumorali vengono successivamente completate entro due settimane dalla cultura. Abbiamo utilizzato con successo queste culture di fetta per scoprire i fattori genetici associati ad un aumento del comportamento migratorio nel GBM umano. Inoltre, abbiamo convalidato la capacità del modello di individuare variazioni specifiche del paziente in risposta alle terapie anti-migrazione. Passando in avanti, le colture umane GBM fetta sono una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo della sensibilità tumorale agli agenti terapeutici, al fine di favorire la terapia neuro-oncologica personalizzata.

Introduzione

Lo studio di laboratorio del glioblastoma (GBM) è ostacolato da una mancanza di modelli che ricapitolano fedelmente le caratteristiche patologiche necessarie della malattia umana, vale a dire la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Gli studi comparativi relativi ai test di invasione in vitro 2D e 3D, nonché i modelli di coltura a fetta di roditori 3D, hanno messo in evidenza programmi migratori cellulari disarmati meccanicamente in questi due contesti, potenzialmente limitando la traducibilità dei risultati dei sistemi 2D alla malattia umana ^{1 , 2 , 3} . Il paradigma della coltura del tumore dell'organotipo e del processo di imaging qui descritto consente lo studio della migrazione delle cellule tumorali all'interno di fette di tessuto tumorale umano ex vivo ottenuto da resezione chirurgica. Così, le colture di tessuti tumorali chirurgicamente resecati in combinazione con la microscopia confocale a tempo scadere forniscono una piattaforma per studiare la migrazione delle cellule tumorali nel nativoMicroambiente senza dissoluzione del tessuto o passaggio della cultura.

C'è una vasta letteratura che utilizza modelli di coltura di fegato di cervello di roditore di GBM generati da tumori umani xenografts, tumori indotti da retrovirus e sovrapposizioni cellulari per studiare l'invasione tumorale ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Recentemente, diversi gruppi hanno descritto la generazione di colture di fetta organotipiche direttamente dal tessuto GBM umano ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10} . Tuttavia, vi è una marcata differenza tra i protocolli pubblicati per quanto riguarda la tecnica di affettatura e il supporto della cultura. Inoltre, l'uso di culture di fetta organotipiche si è concentrato sugli endpoint sperimentali statici che hanno incluso i cambiamenti nei segnali cellulariNg, proliferazione e morte. Il protocollo qui descritto si espande sui precedenti paradigmi della coltura della fetta incorporando un'osservazione temporale del comportamento delle cellule tumorali dinamiche attraverso la microscopia confocale di scansione laser a tempo scadente. La scoperta recente della variazione genetica di inter ¹¹ e intratumoral ^{12 , 13} nel GBM umano sottolinea l'importanza di collegare questa eterogeneità con i comportamenti delle cellule tumorali e le sue implicazioni sulla risposta tumorale alla terapia. Qui riportiamo un protocollo semplificato e riproducibile per l'utilizzo di culture di fetta diretta da un tessuto tumorale umano per visualizzare la migrazione delle cellule tumorali in quasi tempo reale.

Protocollo

Prima di iniziare la raccolta di campioni di tessuti del paziente, è necessario ottenere un consenso informato da ciascun paziente in base ad un protocollo IRB approvato. Gli autori di questo protocollo hanno ricevuto il consenso per i lavori descritti in protocolli IRB approvati presso l'Università di Colorado Hospital e l'Inova Fairfax Hospital. I dati raccolti da queste culture di fetta non sono stati usati per dirigere le decisioni di cura del paziente.

1. Preparazione di pre-affettatura

1. Preparare il supporto di "tessuto" e "mantenere la cultura della fetta" il giorno prima della pianificazione della resezione tumorale e della raccolta dei tessuti (o utilizzare i media precedentemente generati entro 2 settimane). Aggiungere 5 ml di soluzione Penicillina-Streptomicina (10.000 U / mL) e 5 mL di 1 M HEPES a 500 mL di un DMEM ad alto Glucosio per generare il mezzo di trattamento dei tessuti.
2. Preparare 250 ml di mezzi di manutenzione della coltura a fetta usando una base del mezzo neuronale ( ad es. , Neurobasal)Hout fenolo rosso. Supplementare questo mezzo con 10 mM HEPES, 1x B-27 supplemento, 400 μM di L-glutamina, 600 μM L-alanyl-L-glutammina dipeptide, 60 U / mL penicillina, 60 μg / mL streptomicina e 6 U / ml nistatina.
3. Conservare tutti i supporti a 4 ° C per non più di 2 settimane.

2. Giornata della chirurgia: Acquisizione tissutale

1. Nel giorno dell'acquisizione dei tessuti, preparare 50-100 mL di soluzione di agarosio a basse temperature di fusione nel mezzo di lavorazione dei tessuti, utilizzando 50-100 mL di un mezzo di trattamento tessuto utilizzando vetri autoclavati e una tecnica sterile in un cappuccio di flusso laminare. Entrambe le concentrazioni di agarosio sono necessarie per accogliere variazioni imprevedibili nella coerenza del tessuto tumorale.
2. Scaldare la sospensione di agarosio usando un forno a microonde, fino a quando non viene osservata una bolla leggera. Mettere la soluzione agarosa in un bagno d'acqua di 37 ° C per mantenere in uno stato liquido fino all'uso.
3. Inserire 1 ml di supporti di mantenimento della coltura in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
4. Usa un sterilePinza per inserire inserti vuoti della coltura PTFE in ogni pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale umidificato con acqua con una atmosfera di 5% di CO ₂ mantenuta a 37 ° C.
5. Usando una pipetta sterile di Pasteur in un cappuccio di flusso laminare, bolle una miscela di gas 95% O ₂ /5% CO ₂ in un pallone contenente mezzi di trattamento del freddo di ghiaccio per circa 15-30 minuti, prima dell'acquisizione del tessuto tumorale. L'utilizzo di supporti sovra ossigenati minimizza l'ipossia nel tessuto di massa durante l'elaborazione.
6. Preparare etichettati tubi conici da 50 mL (sufficienti per il numero desiderato di singole regioni tumorali da isolare) contenenti aliquote di 20 mL di supporti di trattamento ghiacciati sovra ossigenati per trasportare il tessuto tra sala operatoria e impianto di affettatura.
7. In combinazione con un neurochirurgo, pianificare pre-operativamente la regione tumorale per l'acquisizione del campione. Selezionare una regione tumorale con miglioramento del contrasto come dimostrato nell'immagine clinica del pazienteG (sequenze T1 post-gadolinium di risonanza magnetica (MRI)). L'esperienza precedente suggerisce che questa zona renda il tessuto tumorale vivo al contrario del tessuto necrotico.
   NOTA: è stata tentata la generazione di fette dalla materia bianca (peritumorale) circostante; Tuttavia, l'autofluorescenza di sottofondo e la diminuzione della densità delle cellule tumorali hanno limitato l'utilità sperimentale di queste fette.
8. Ottenere il tessuto tumorale verso l'inizio della resezione tumorale. Evitare la raccolta di tessuti tumorali esposti a cautery bipolare estesa, che può compromettere la vitalità del tessuto a seguito di lesioni termiche. I campioni di tessuto acquisiti durante la resezione del tumore frammentario dimostrano una vitalità migliorata rispetto al tessuto acquisito da lunghe rese bloc . Questa osservazione può riguardare la deprivazione differenziale del tessuto tumorale del flusso sanguigno come risultato della resezione chirurgica e del tempo prolungato all'acquisizione.
9. Se lo si desidera, etichettare e memorizzare i tessuti tumorali in tubi conici separati per isolare campioniDa regioni tumorali distinte. (Vale a dire il tessuto tumorale superficiale o profondo). Le posizioni tissutali precise possono essere registrate se / quando è disponibile la navigazione chirurgica intraoperatoria.

3. Preparazione della cultura della fetta

NOTA: Questo protocollo richiede l'uso di tessuti umani freschi e non fischiati. Tutti i campioni sono presunti infettati e devono essere trattati secondo i protocolli patogeni universali. Appropriate attrezzature di protezione personale devono essere indossate in qualsiasi momento. Le pinze ei bisturi devono essere esposti a 15 minuti di luce UV prima dell'uso. Durante l'uso, spruzzare a intermittenza gli utensili con etanolo al 70% (EtOH), lasciando tempo per evaporare il liquido prima dell'uso. Il processo di taglio viene eseguito in modo semi-sterile utilizzando un cappuccio di flusso laminare orizzontale con aria filtrata.

1. Posizionare i pezzi di tessuto tumorale in un piatto di Petri con i mezzi di trattamento ghiacciati. Per lavare il tessuto tumorale e ridurre al minimo i globuli rossi aderenti, noiEa pipetta per scambiare delicatamente e scartare i supporti nel piatto di Petri tre volte.
2. Usando un bisturi, tagliare i pezzi del tumore in forme di scatola rettangolare. Tagliare i pezzi di tessuto a circa 3 mm x 3 mm x 10 mm. Rimuovere con cautela le eventuali imbarcazioni collegate tramite l'estrazione o la trazione dolce con le pinze fine.
3. Pipettare 5 - 7 ml di agarosio 37 ° C in un piccolo stampo in plastica (~ 2 cm ³ ) a forma di cubo. Confermare che la temperatura della soluzione di agarosio non sia superiore a 37 ° C con un termometro sterile prima dell'uso.
4. Lasciare agarossi sedere per circa 1 min su un letto di ghiaccio.
5. Inserire 2 "4" strisce tumorali in agarosio con asse lungo orientato verticalmente.
   NOTA: Le strisce tissutali tendono a "affondare" nell'agarose prima della solidificazione. Per evitare questa complicazione, tenere temporaneamente la striscia tissutale in posizione verticale finché l'agarosio non viene ulteriormente solidificato.
6. Tenere il tessuto contenente agarosio in un letto di ghiaccio per 2 - 5 miN per facilitare la solidificazione.
7. Rimuovere lo stampo dal ghiaccio e rimuovere delicatamente il blocco agarosio tagliando i lati della forma con un bisturi. Evitare di applicare una forza eccessiva sul blocco, che può rompere l'agarosio.
8. Usare una generosa goccia di colla cianoacrilato per inserire il blocco di agarosio sulla piastra del campione vibratome. Lasciare incollare per circa 1 - 2 min.
9. Riempire il serbatoio vibratome con supporti di trattamento ghiacciati per immergere il blocco agarosio apposto sulla piastra del campione.
10. Durante la tranciatura, bolle una miscela di gas 95% O ₂ /5% CO ₂ nel serbatoio vibratome attraverso una pipetta in plastica sterile tagliata.
11. Impostare lo spessore della fetta di vibratore a 300 - 350 μm.
12. Regolare la velocità di avanzamento della lama e l'ampiezza della lama in base alla consistenza del tessuto. Il tessuto "Stiffer" GBM richiede velocità di avanzamento più lente e ampiezza più elevata. Le regolazioni esatte della velocità e delle ampiezze della lamierina variano in base alle specifiche del vibratome.
    NOTA: Molte edizioni si presentano comunemente durante la tranciatura. Se la striscia di tessuto scompare dal blocco di agarosio, tentare di incorporare il tessuto in una maggiore concentrazione di agarosio. Se le fette del tumore sono più spesse del desiderato (set di macchine) o sono asimmetriche, aumentare l'ampiezza e diminuire la velocità della lama vibratome. Per garantire che il tessuto tumorale non sia bloccato o "trascinato" dal supporto della lama, in quanto si affronta, posizionare con cura la microspatula tra il supporto della lama e la fetta, quando la lama si muove.
13. Trasferire le fette di tessuto in un piatto di Petri con supporti di trattamento con ghiaccio freddo utilizzando una microspatula in acciaio inossidabile.
14. Ottenere piastre a 6 pozzetti contenenti inserti PTFE e supporti di coltura equilibrati di fetta dall'incubatore (come preparato nella sezione 2, passaggio 4).
15. Fette di tessuto a piastre utilizzando una microspatula in acciaio inossidabile. Ridurre al minimo il contatto diretto e la manipolazione del tessuto utilizzando un piccolo pennello di seta fine per generare una "onda fluida" per spingere delicatamente la fetta dalla spatola aNd sull'inserto di coltura.
    NOTA: Ridurre al minimo la quantità di supporti di elaborazione introdotti in cima all'inserto della coltura tissutale. Se si trasferiscono quantità eccessive di supporti che causano le fette di galleggiamento, utilizzare una pipetta sterile Pasteur per rimuovere i supporti.
16. Restituire le piastre a 6 pozzetti contenenti fette tumorali in un incubatore mantenuto a 37 ° C con un'atmosfera al 5% di CO ₂ .
    NOTA: L'intero protocollo di embedding e di affettatura dovrebbe essere completato entro 90 minuti dall'acquisizione dei tessuti tumorali dalla sala operatoria.

4. Manutenzione della cultura della fetta

1. Dopo 12 - 24 h, trasferire le colture di fettine afferrando ogni bordo dell'inserto con una pinza sterile e trasferendo su piastre contenenti mezzi di manutenzione della coltura fresca della fetta. Assicurarsi che i mezzi di manutenzione della cultura della fetta, aliquotati in ciascun pozzetto, si equilibrino nell'incubatrice per almeno 15 minuti prima di trasferire gli inserti.
2. Spostare gli inserti in nuovi piatti a 6 pozzetti con cul fresco equilibratoOgni 48 ore.
3. Se si desidera, l'aliquota di vecchia coltura di fetta con una pipetta per uso immediato nei dosaggi biochimici ( cioè ELISA) o congelare a -80 ° C per un futuro impiego.

5. Etichettatura delle cellule tumorali attraverso la proteina fluorescente verde esprimendo retrovirus

NOTA: La microscopia a tempo trascorso per l'analisi della migrazione delle cellule tumorali richiede una stabile e lunga durata di etichettatura fluorescente delle cellule all'interno della coltura di fetta. L'uso del retrovirus è suggerito perché infetta infatti selettivamente le cellule di divisione, arricchendo così l'etichettatura fluorescente all'interno della popolazione delle cellule tumorali in contrasto con microglia o altri tipi di cellule presenti all'interno della fetta. La standardizzazione dell'infezione suggerisce che un titolo virale di 10 ⁴ CFU / μL abbia un'espressione sufficiente di proteine ​​fluorescenti verdi per il monitoraggio e l'analisi della migrazione cellulare. Aumento del titolo virale, uso di virus non selettivi (ad es. Adenovirus, lentivirus) o otI suoi mezzi di etichettatura di tutte le cellule possono escludere l'identificazione dei confini delle cellule chiare durante la migrazione, complicando così l'analisi. L'uso di marcatori fluorescenti alternativi può essere utilizzato e ottimizzato se necessario.

1. Ottieni il retrovirus per l'infezione di fette tumorali sia tramite protocolli standard ^{5 , 14 ,} sia da una fonte disponibile in commercio. Diluire il surnatante virale aggiungendo il volume appropriato in un mezzo neuronale non fornito per ottenere un titolo virale di 10 ⁴ CFU / μL.
2. Tra 7 e 10 giorni di coltura infettano le colture tumorali di interesse con 5-10 μL di virus (10 ⁴ CFU / μL). Posizionare il virus delicatamente in goccia sulla superficie di ogni fetta di tessuto. Diminuire il volume di supernatante aggiunto se la fetta galleggia sulla superficie dell'inserto. Piastre di ritorno contenenti culture di fetta all'incubatore.
3. Valutare le fette per le cellule tumorali etichettate a partire da 24 h dopo Infezione virale (vedere paragrafo 6). Questo ritardo di tempo varia a seconda dell'insorgenza virale e della cinetica di espressione genica di fluorescenza. Per i costrutti virali utilizzati qui, è stato richiesto 72 h per osservare un robusto segnale fluorescente con un microscopio standard di epifluorescenza.
   NOTA: Raramente, le fette mostrano una distribuzione prevalentemente periferica di celle con etichetta viralmente, che può complicare l'imaging confocale. Per evitare questa complicazione, cercare di ridurre lo spessore della fetta e la variazione dello spessore in tutta la fetta. Se la cultura della fetta ha una regione più spessa vicino al centro, questo può impedire una adeguata penetrazione dei nutrienti, limitando così la popolazione di dividere attivamente le cellule tumorali. Un test qualitativo per la visualizzazione di questa complicazione è l'aggiunta di un reagente di tint tetrazolio ( cioè MTT) al supporto di coltura della fetta. Le aree della fetta che non diventano blu dopo l'aggiunta del reagente indicano una mancanza di attività metabolica e compromesso la salute delle fette.

Le "> 6. Scansione laser a singolo fotone a tempo scadente Imaging confocale della migrazione di cellule tumorali

NOTA: Una volta confermata la buona trasduzione e la salute della cultura, le cellule possono essere riprese in condizioni di controllo, seguite da un periodo di imaging simile in condizioni di trattamento. Utilizzando questo protocollo, le cellule sono state immagazzinate e monitorate con successo per 12 ore in ogni condizione. Tuttavia, periodi più brevi o più lunghi di imaging e manipolazione ambientale possono anche essere informativi.

1. Caricamento del microscopio
   1. Prima di imaging, posizionare 1 ml di supporti freschi della fetta in un piatto di fondo in vetro.
   2. Lasciare che i supporti nel piatto di fondo in vetro siano equilibrati in un incubatore per 15 minuti.
      NOTA: A questo punto possono essere aggiunti agenti di etichettatura solubili, quali lectine coniugate fluorescenti ( cioè Isolectin IB ₄ per etichettatura microglia) o punti quantici coniugati ligandi, al supporto di coltura della fetta per identificare la cellulaSubpopulazioni ular durante l'imaging.
   3. Trasferire l'inserto da imaging su un piatto di fondo in vetro utilizzando pinze sterili in un cappuccio flusso laminare. Trasportare il piatto alla fase del microscopio.
   4. Mantenere le colture di fetta a 37 ° C e 5% di CO ₂ in un incubatore a microscopio sigillato. Utilizzare l'umidificazione sterile di H ₂ O della camera di incubazione, se disponibile per prevenire l'evaporazione eccessiva del mezzo (particolarmente importante per esperimenti di imaging più lunghi).
   5. Utilizzare un microscopio confocale con una lunga distanza di lavoro 10x e l'eccitazione laser per singolo fotone e / o multi-fotone.
      NOTA: Assicurarsi che l'obiettivo obiettivo del microscopio fornisca una distanza di lavoro adeguata. Come risultato dell'altezza aggiunta dall'incubatrice a palchi, piatto di fondo in vetro e inserto per la coltura tissutale, gli obiettivi di lunga distanza di lavoro sono critici.
   6. Fissare la lastra di vetro, rimuovere la copertura in plastica di Petri e coprire con un gas-Membrana permeabile.
2. Acquisizione dell'immagine
   1. Utilizzare il microscopio per ispezionare visivamente la fetta e individuare un campo adatto con un'adeguata densità di cellule tumorali a fluorescenza tra il bordo della fetta e il centro. Evitare i campi di imaging al bordo della fetta, a causa di una maggiore suscettibilità dei cambi di tessuto durante l'imaging. Possono essere impiegate arpe di fetta di tessuto per limitare questo turno.
   2. Utilizzare il software di imaging in modalità di analisi multidimensionale per impostare i primi (inferiori) e ultimi (superiori) confini dello stack Z, in modo che tutte le posizioni da immaginare contengano il segnale cellulare fluorescente visibile. L'imaging attraverso 150 - 200 μm della fetta, con una costante Z di 10 μm, ha fornito una risoluzione adeguata per il tracciamento dei percorsi cellulari (questo può essere regolato per esigenze individuali di imaging).
   3. Se il microscopio ha uno stadio motorizzato, assicurarsi che sia sufficiente un tempo sufficiente per ogni acquisizione di stack Z. Imposta l'intervallo di tempo tra le acquisizioni a pariTempo di scansione per posizione x numero di posizioni all'immagine ( vale a dire regioni tumorali rappresentate).
      NOTA: per l'eccitazione simultanea dei fluorofori verdi e rossi, utilizzare un programma di scansione lineare a doppia linea, con eccitazione simultanea di 488 nm e 633 nm. La lunghezza d'onda dell'eccitazione laser selezionata varia in base alle singole proteine ​​fluorescenti espresse.
   4. Mantenere il potere laser uniforme e le impostazioni del pinhole confocale tra le regioni del tumore imaged. Utilizzare l'impostazione più bassa di potenza laser necessaria per chiarire chiaramente i corpi e processi delle cellule tumorali per limitare la fototossicità. Le unità di parametri di imaging specifiche (ad es., Potenza e confocal pinhole) variano in base alle specifiche del microscopio e della sorgente laser.
   5. Compensare l'evaporazione potenziale del mezzo aggiungendo i gradini Z-stack da 2 a 3 "tampone" nei piani focali che avanzano verso l'obiettivo. Questo impedisce efficacemente il tessuto di lasciare la gamma di acquisizione Z-stackIoni nel piano verticale.

7. L'elaborazione dell'immagine e il monitoraggio delle cellule tumorali

NOTA: Molti sistemi di imaging confocale sono dotati di software di elaborazione delle immagini proprietari. Le fasi di elaborazione di seguito descritte comprendono un protocollo generale, che può essere eseguito su piattaforme software. Le istruzioni specifiche verranno fornite per le piattaforme open source, NIH ImageJ e MTrackJ ¹⁵ .

1. Aprire un file Z-stack. In ImageJ, fai clic su "Immagine → Stack → Progetto Z". Sceglie la prima e l'ultima Z-stack da includere e sceglie "Max Intensity" come tipo di proiezione. Il risultato è un rendering chiamato proiezione di intensità massima (MIP). Creare un MIP da ciascun insieme di immagini Z-stack catturate in ciascuna regione imaged.
2. Concatenare i MIP di ciascuna regione per creare una serie temporale. Fai clic su "Immagine → Pile → Immagini in pila".
3. Identificare manualmente la posizioneDel corpo cellulare "centroid" selezionando il punto centrale approssimato dal punto di vista del corpo della cellula tumorale. Ciò avviene facendo clic sul corpo della cella usando la funzionalità di traccia "add" di MTrackJ (un plugin open-source per NIH ImageJ).
4. Fare clic per demarcare la posizione del corpo cellulare in ogni fotogramma delle immagini. Ciò crea una "traccia" univoca per ogni cella. Sequentemente, contrassegnare le posizioni del corpo cellulare della cella successiva. Ripetere questo processo finché non vengono tracciati tutti i percorsi di migrazione della cella.
5. Una volta che una popolazione di cellule viene tracciata in una determinata regione microumorale del tumore, esportare tutte le coordinate della traccia cellulare utilizzando la funzione "misura" di MTrackJ. Salvare il file in formato .xls in modo da analizzare i dati grezzi utilizzando il foglio di calcolo o il software generato dall'utente.
6. Utilizza le coordinate registrate per ogni punto lungo la traccia di migrazione di una cella, per eseguire analisi quantitative tra cui la derivazione della velocità di migrazione, della direzionalità e di altre migrazioniMetrici, come descritto in Parker et al ¹⁶ .
   NOTA: Tutte le distanze e le velocità calcolate sono sotto-stime dei valori reali. Questo è inerente alla trasformazione di immagini tridimensionali (e percorsi di migrazione) a dati bidimensionali attraverso la generazione di proiezioni di massima intensità.

Risultati

Il nostro gruppo ha generato con successo colture di fetta da oltre 50 pazienti sottoposti a resezione iniziale GBM. Questa generazione di fetta, la cultura, l'etichettatura retrovirale, l'imaging e il protocollo di analisi delle migrazioni sono stati semplificati in un flusso di lavoro riproducibile ( Figura 1 ). Criticalamente, queste fettine organotipiche GBM dimostrano la concordanza con il tessuto tumorale originario in tutta la cultura, compreso il ma...

Discussione

Le colture organotipiche di fetta del tessuto tumorale umano forniscono una piattaforma attraente e inutilizzata per la sperimentazione preclinica di traslazione. La comprensione dei comportamenti a livello di popolazione delle cellule tumorali per quanto riguarda la migrazione, la proliferazione e la morte cellulare nel microambiente del tumore nativo manca. Critico, studiare la risposta tumorale alla terapia in modo dinamico e temporaneo a livello di comportamento delle cellule possono illuminare nuovi meccanismi di r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, minus phenol red	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Supplement	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C.
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	Used in media to label Microglia/Macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
GP2-293 Viral packaging cells	Clonetech	631530	part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	Medium-viscosity
Equipment
Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Molds for tumor sample embedding
Stainless Steel Micro Spatulas	Fisher Scientific	S50823	Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-875
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors)	Fisher Scientific	17-989-001	Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Hydrophilic PTFE cell culture insert	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm
LSM 510 Confocal Micoscope	Zeiss	LSM 510	10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON Germany	(Discontinued)	Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.