急性呼吸窮迫症候群（ARDS）のモデルとして、ブタにおける洗浄によって誘発される界面活性剤枯渇

要約

麻酔したブタにおける反復肺洗浄液は、ヒト急性呼吸窮迫症候群（ARDS）の主要な側面に似た肺損傷を引き起こします。この目的のために肺を繰り返し、37℃で0.9％食塩水でlavagedされます。プロトコルの目標は、ARDSの研究のためのガス交換と血行動態の再現性の緩和です。

要約

肺障害の種々の動物モデルは、ヒトの急性呼吸窮迫症候群（ARDS）の複雑な発症機序を研究し、将来の治療を評価するために存在します。肺のガス交換と血行動態の再現性の劣化を伴う重度の肺損傷は、温めた0.9％生理食塩水（50ミリリットル/ kg体重）で繰り返し肺洗浄液を使用して麻酔したブタに誘導することができます。このモデルでは、臨床的に適用されるデバイスとの標準的な呼吸と血行動態モニタリングを含めると、新規治療戦略（薬、現代の人工呼吸器、体外膜型人工肺、ECMO）の評価を可能にし、ベンチ、ベッドサイド間のギャップを埋めます。さらに、肺洗浄​​液と肺損傷の誘導は、プロと抗炎症性サイトカインの測定に病原体/エンドトキシンその影響の注入を必要としません。モデルの欠点は、無気肺組織の高いrecruitabilityあります。モデルの標準化は、cを確保するために、落とし穴を回避するのに役立ちます実験間omparabilityは、必要な動物の数を減少させます。

概要

ヒト急性呼吸窮迫症候群（ARDS）の死亡率は、鋭意研 ​​究の4つ以上の数十年にもかかわらず、40および^50％1の間の値と高いままです。肺損傷の動物モデルは、死亡率を低減し、長期の障害を制限するために、複雑な発症機序または新規治療アプローチを調査において主要な役割を果たす。

様々なモデルは、大規模（ 例えば 、ブタ）、小さい動物（ 例えば 、げっ歯類）のいずれかでのヒトARDSの側面をシミュレートする肺傷害を誘発するために設立されました。方法は、オレイン酸の肺動脈内注入、細菌の静脈内（IV）注入、およびエンドトキシンまたは盲腸結紮および敗血症誘発性ARDSを引き起こす穿刺（CLP）モデルを含む、強く異なります。また、大きな一回換気量による直接肺損傷および高ピーク吸気圧力（人工呼吸器誘発肺損傷; VILI）、煙/傷害または肺の虚血を燃やす/再灌流（I / R）モデルがしばしば使用されています^2。エンドトキシンで作業CLPモデルならびにモデルの1つの主要な欠点は、単独で肺損傷によって引き起こさbiotraumaの分析を妨げる根本的な炎症があります。大型動物でVILIの場合のようにまた、それは、肺損傷をもたらすことが数時間から数日かかる場合があります。

反復肺洗浄液と界面活性剤のウォッシュアウトによる肺傷害の誘導、それが最初にラックマンらによって記載されたように。モルモット³で、再現可能な機能的及び機械的妥協、ならびに肺血管抵抗の変化と肺損傷を誘発する時間効率的な方法です。ガス交換と血行動態における妥協が同時に⁴で高度に再現可能である一方で、機械的に約30〜60 kg体重の豚を換気するために、このモデルの適応は、臨床的に使用される人工呼吸器、カテーテルおよびモニターの基本的な研究を支援しています。また、洗浄液による肺損傷の誘導はしていません大型動物での実験のために設計された呼吸の研究室で一般的に利用できない特定の機器が必要です。この記事で紹介したモデルは、ヒトにおける使用のために設計され、さらに肺機能の発生する劣化で高い再現性を保証されている機器（ 例えば 、人工呼吸器を）求めて研究するのに適しています。このモデルの標準化は、実験間の比較可能性を確保し、必要な動物の数を減らすことができます。故意または未知の募集演習と無気肺領域のポテンシャルrecruitabilityは、この特定のモデルの厳しい制限です。次の記事では、肺損傷の誘導のための洗浄モデルの詳細な説明を与え、肺機能に妥協の安定性を特徴づけるために代表的なデータを提供します。

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プロトコル

実験は、実験医学、シャリテの部門で行われた - Universitätsmedizin、ベルリン、ドイツ（EN DIN ISO 9001に従ってCERTI Fiの編：2000）、および実験の前にベルリン、ドイツの動物研究のための連邦当局により承認されました。すべての実験で使用した実験動物のケアの原則は、実験動物科学のヨーロッパとドイツの学会のガイドラインに従いました。

1.動物福祉と動物実験

1. 全ての実験30〜60 kgの年齢の3〜4ヶ月の完全麻酔した雄ブタ（ドイツランドレースは大×ホワイト）、で行いました。

2.麻酔、挿管および機械的人工換気

1. 豚の満腹を避けるために、麻酔前に12時間のための食糧を差し控えるが、ストレスを最小限に抑えるために、水への自由なアクセスを可能にします。
2. 前投薬のために、共同を注入豚の首の筋肉へのアザペロンのmbination（3ミリグラム/キログラム）、アトロピン（0.03ミリグラム/キログラム）、ケタミン（25 mgの/キログラム）、およびキシラジン（3.5ミリグラム/キログラム）動物はまだボックスに保管されている間ストレスを最小限に抑えることができます。
   1. 担架の上に動物を置き、麻酔の適切なレベルが達成された後の輸送のための布で目をカバーしています。
   2. 手術室に豚を輸送し、遮るもののない鼻を維持することによって、すべての回で十分な自発呼吸を確保します。
   3. 酸素の高流量（ 例えば 10リットル/分）を用いて、動物の鼻にフィットするマスクで腹臥位とpreoxygenateに豚を置きます。
3. 耳の一方にモニタの各センサをクリッピングすることにより、末梢酸素飽和度（S _pが O _2）を監視を開始します。アルコールスワップで拭いてください手順の後に耳静脈のいずれかに配置され、臨床的に使用される末梢静脈カテーテル（通常は18または20 G）と静脈アクセスを得ることができます。
   1. （実験に応じて、臨床的に必要と判断されるように）約4ミリリットル/ kg /時間の連続注入に続いて500ミリリットルボーラスとバランス晶質液で注入を開始し、麻酔薬のその後の注入のためのカテーテルの正確な配置を確保します。
      注：代わりに高クロル性アシドーシスをもたらすことができる平衡晶質液の生理食塩水の大量の注入、増大した血清乳酸濃度をもたらし、したがって、血液ガス分析の解釈または干渉するができる乳酸を含有する溶液の注入に対しその後の実験の結果。
4. 正確な用量は、前投薬と異なりの効果に依存する-十分なpreoxygenation（末梢静脈アクセスのための完全な時間の間preoxygenation、百分の95から100のS _p個の O _2を測定）した後、プロポフォール（約5〜10 mg / kg体重注入末梢静脈カテーテルを用いて、動物に対する動物）から。
5. 臨床応用（7.5-8.5 ID）と大型動物用に設計された喉頭鏡（約25センチの長さのストレート刃）のために気管内チューブを使用して、腹臥位で豚を挿管。
   1. 動物（第一研究者）の鼻を介して2つの包帯ストラップ。鼻を開くために、他の包帯をプルダウンし、正しい位置にヘッドを移動し、口腔咽頭の構造を真っ直ぐに上向きに1包帯を引っ張ります。一方の側（第2研究者）に舌を引き出します。
   2. 喉頭鏡のブレードで舌を押し下げると喉頭蓋に向かって刃を進めます。注意、この位置に喉頭蓋は、多くの場合、豚の軟口蓋の後ろに押し込まれます。
   3. 、チューブで喉頭蓋を動員喉頭鏡のブレードで、それを下に押して、挿管のために声帯を視覚化します。
   4. 上向きにチューブを回転させながら声帯を通ってチューブを進め、Theisen らによって詳細に記載されるようにカフをブロックします^。5 アップ。
      注：挿管も研究者の訓練だけでなく、特定の機関の標準的な手順に応じて、仰臥位で可能です。大管径が速く流入し、洗浄液の流出に起因する界面活性剤の洗い出しをサポートしています。
   5. カプノグラフィーと聴診を使用してチューブの正しい配置を確認してください。このため、カプノグラムが「通常」形状であることを確認し、診療所に行ったように同じ呼吸音の両方の肺を聴診。
      注：機械的に失敗したか、または遅延挿管の場合には胸部圧迫と豚を換気。タイトなフィッティングフェイスマスクを介して高流量で酸素を供給しながら、これは両側から胸郭の手動圧縮が必要です。
6. （：E I）の満了比1に（F _I O _2）インスピレーションを得た酸素の割合を設定し、機械的な換気を開始し、人工呼吸器の周波数に15-20 /分で8-9ミリリットル/ kg体重の一回換気量、インスピレーション1：1.5、および5cmのH ₂ Oの呼気終末陽圧（PEEP）を適用35-40 mmHgでの二酸化炭素の呼気終末分圧（P _ら CO _2）と95％以上のS _pが O _2を標的とするように設定を調整します。
   1. 連続静脈チオペントンの注入（20ミリグラム/ kg /時）とフェンタニル（7μgの/ kg /時）で麻酔を維持します。
      注：必要な投与量は、動物から動物に異なる場合があります。無人の動物を放置しないでください。動物福祉と科学的な理由のための実験中にすべての回で十分な麻酔を確認してください。
   2. 角膜反射の不在を確認し、インスツルメンテーション時の応力/痛みの反応のために密接に動物を監視します。インストルメンテーションは、麻酔が十分であれば筋弛緩剤を投与しなしで可能であるべきです。筋弛緩は、実験のために必要であれば臭化パンクロニウム（0.15ミリグラム/ kg体重/時間の連続注入に続いては0.15mg / kg体重の静脈内ボーラス）を管理（ 例えば 、 肺コンプライアンス測定）。

3.計測テクニック

1. 仰臥位に動物を配置し、計画された切開部位上の皮膚を伸ばすために包帯を使用して足を引っ込めます。アルコール/ 1％ヨウ素溶液などの術前皮膚消毒剤を使用して動作領域を滅菌します。
   注：私たちは、動作領域を滅菌する拭うの手順を使用しますが、これはnonsurvivalモデルであるため、完全なaseptical手法を使用していません。外科的な無菌状態のレベルは、肺損傷の誘導後の調査に依存します。
2. 中心静脈ラインの配置と肺動脈カテーテルの導入器シース用のメスを用いて皮膚を切開下顎と胸骨を結ぶ直線上に10cmの切開（可能な左側または右側）にしてください。麻酔の深さを再評価し、必要に応じて投与量を増加させます。
3. 皮下組織と板状を分離SMA組織鉗子および外科はさみを使用して。腕頭とsternocephalic筋肉が表示されたら鈍いが可視鉗子や指のような器具を使用している外頸静脈まで筋肉の間の筋膜を分離する手順を切り倒し行います。
4. 中心静脈カテーテルおよび変更されたセルジンガー法により導入シースと外頸静脈にカニューレを挿入。それらを導入する前に、通常の生理食塩水ですべてのカテーテルをフラッシュします。
   1. 静脈血（暗い、脈動ないが）吸引できるようになるまでこのために、静脈内に設定され、導入からそれぞれの針を進めます。約15cmのための静脈にカニューレを通してガイドワイヤを進めます。針を外し、静脈内に導入シースを進めます。ガイドワイヤを外します。必要に応じて、実験のために中心静脈カテーテルの配置のために同じ手順を繰り返します。
5. Vの吸引によりカテーテルの正確な配置を制御enous血。標準の縫合糸で閉じます。
   注：経皮的アプローチの場合と同じようこれは静脈（ 図1）を裂けるため、血管拡張剤で静脈を拡張しないでください。研究者は、ブタにおける超音波ガイドカニューレ挿入技術で訓練されている場合は、超音波ガイド下アプローチも可能です。
6. 動脈カテーテルの配置のために（左または右が可能です）後肢の薄と縫工筋の間に倍に識別します。これは、大腿動脈の脈動を触診することができる倍です。
7. メスを用いて皮膚を切開倍に沿って5cmの切開を行います。
8. 組織鉗子および外科はさみを使用して皮下組織を分離します。大腿動脈のレベルに筋肉の間の筋膜を分離する手順をブラントカットを下に使用してください。注意、それらの削減手順の頭蓋を行うことにより、伏在血管を切断しないようにします。
9. によって大腿動脈にカニューレを挿入3.2で説明したように変更されたセルジンガー法。リガチャーは、動脈の周りにループされ、穿刺部位の出血の場合に閉じることができます。可能な場合には、後肢への血流を損なうので、このステップは、避けるべきです。標準の縫合糸で閉じます。
10. 監視を開始するために動脈カテーテルおよび中心静脈ラインはトランスデューサシステムに接続し、大気（ゼロ）に対しての両方を校正し、いずれかの200 mmHgの（動脈ライン）または50 mmHgの（中心静脈ライン）。
11. （胸部の高さの半分程度仰臥位で豚で）右心房の高さで、全ての圧力変換器を配置します。
12. 膀胱カテーテル法のためにメスを用いて膀胱上の皮膚を切開小（4〜5センチメートル）切開を行います。ここでも、鈍器を使用して皮下組織を分離します。
13. それが可視化されると、膀胱の壁に巾着縫合糸（直径1〜センチ）を実行します。
    注：縫合糸は、nべきこの穿刺を通る尿の喪失をもたらすので、OTは、膀胱壁の全層を貫通します。
14. 、縫合糸の真ん中に最小限の切開を行う尿道カテーテルを導入し、水ビデ10mlでバルーンをブロックし、耐光性が感じられるまで戻ってカテーテルを引き出し、カテーテルの周りに巾着縫合を閉じます。標準的な縫合糸を使用して皮膚を閉じます。

肺動脈カテーテルの4紹介

1. （カテーテルのサイズに応じて）肺動脈カテーテルのバルーンに空気の0.5〜1ミリリットルを注入し、バルーンの可能な損傷がないかどうかを確認。再びバルーンを収縮させます。
2. 圧力変換器システムに肺動脈カテーテルを接続し、大気（ゼロ）と100 mmHgのに対してPACを校正する（ 図2及び3）。
   1. 10 1にするために導入シース（収縮したバルーン）を介して肺動脈カテーテルを導入シースの長さに応じて5センチ、。
   2. バルーンを膨らませる（バルーンがこのためにシースを残している必要があります）と圧力と血行動態のモニター上の典型的な波形を監視しながら、さらに肺動脈カテーテルを進めます。
   3. 右心房、右心室、肺動脈に典型的な波形が表示されている間PACを進め、肺毛細血管楔入圧（PCWP）曲線は（ 図4）が表示されたときに前進を停止します。バルーンを収縮させます。
      注：バルーンが収縮されるとPCWP、波形が消えなければならず、肺動脈圧の波形が表示される必要があります。それ以外の場合は、カテーテルは、最も可能性の高い動脈（オートウェッジ位置）の永久閉塞が生じ、肺動脈にすぎ挿入されています。この場合には、肺動脈圧の波形は重篤な合併症を回避するために、（血管の破裂など ）が再表示されるまで、バックカテーテルを引っ張る^6。
   <李>バルーンがカテーテルが重篤な合併症を回避するために引き戻されたときに収縮していることを確認します。
   注：肺動脈カテーテルは、しばしば誤ってブタの下大静脈から肝静脈に進められます。このように、カテーテルを引き戻すと右心室が30cm程度後に到達されていない場合は、最初からやり直します。

5.肺動脈熱希釈法および血行動態測定

1. 心拍数、収縮期血圧、拡張期のようにすべての血行動態の値をコピーし、血行動態モニタから動脈圧（MAP）、肺動脈圧、および中心静脈圧（CVP）を意味します。
2. 速やかPCWPを測定します。このために、肺動脈カテーテルのバルーンを膨らませると、正しいPCWP曲線は（ 図4）が表示されていることを確認。モニターからの呼気の終わりの肺毛細血管楔入圧（PCWP）をコピーします。すぐに（4.2.4を参照）、その後、バルーンを収縮させます。 DEFLバルーンを食べ、カテーテルを引き戻すと、あなたは4.2.2で説明したように、正しいPCWP曲線を見ることができない場合、それを再配置します。
   1. サーミスタおよび心拍出量（CO）を測定するための肺動脈カテーテルの中心静脈内腔へとモニターにハウジングを通って適切なフローを接続します。次に、モニターにカテーテル（赤キャップ）の先端温度ポートを接続します。
   2. モニターを開始し、時間-温度曲線を監視するため、肺動脈熱希釈法⁷と心拍出量（CO）を測定するために「ボーラスCO」を選択します。
   3. 押して「インジェクション巻」は、冷却した生理食塩水の体積（ここに提示した実験で5ミリリットル）を選択します。前の画面に戻ります。押して「カテーテル」とは、使用されている肺動脈カテーテルのサイズを選択します。前の画面に戻ります。
   4. 選択して「ボーラスを開始 'と使用して可能な限り迅速に4°Cの温度の通常の生理食塩水の5ミリリットルを注入筐体を通る流れ。測定が完了するまで待ってから、それぞれの時間 - 温度曲線は、モニターに表示されます。モニターからのCO値をコピーします。
   5. 5.3.4で説明したように、人工呼吸器の呼吸サイクル全体にわたってランダムな順番で立て続けに5回の測定を行います。最高値と最低値を無視して、心拍出量の平均値を計算するために残りの3つを使用しています。
      注：この監視設定がエドワーズ警戒監視、モデルVGS1に記載されています。セットアップは、モニターによって異なる場合があります。それにもかかわらず、正しい注射生理食塩水の量​​、並びに、カテーテルのサイズを選択することが不可欠です。一部のモニターには、生理食塩水およびカテーテルサイズのコードそれぞれの量、その定数計算の選択を必要とします。定数は通常、カテーテルの包装内部リーフレットに記載されています。実験を通して同じ温度で生理食塩水にしてください（<5℃）正しいmeasurを保証しますements。電解質の摂取量と恒常性の正確な測定を含む研究のために、5％グルコース溶液の代わりに生理食塩水を使用してください。
3. すべてのパラメータが記録されており、その動脈および混合静脈血サンプルは、肺内、右から左へのシャントの計算を可能にするために取られたことを確認します。
4. レコードはすべて速やかに人工呼吸器からのピークと高原吸気圧のような呼吸器のデータを必要に応じて、または実験の任意の時点でデータを完了するために肺圧差を測定するなどの追加の測定を行います。

6.肺洗浄液は、肺損傷を誘発するために

1. 動物は1.0のF _I O ₂で換気されていることを確認し、洗浄手順2-4センチH ₂ OにPEEPを設定します。人工呼吸器から動物を取り外します。
2. 温め通常の滅菌生理食塩水（37°C、50ミリリットル/ kg体重）で肺を埋めます。このために、漏斗を事前入力し、それを接続しますフィッティング弾性チューブで気管内チューブ。 1メートルの動物の上に漏斗を上げ、可能な限り迅速に肺に生理食塩水を注ぎます。静水圧は、すべての肺のセクションに生理食塩水を割り当てます。
   注：通常の滅菌生理食塩水は、病原体と動物の可能性、敗血症代償不全の肺洗浄を回避するために使用されます。低張液は、動物の即時性肺水腫、電解質の不均衡や死につながるので、0.9％生理食塩水の使用は、非常に重要です。界面活性剤が洗い流さ最大化するために洗浄した後、生理食塩水を再利用しないでください。
3. MAPが50mmHgを下回ったときに充填を停止します。
   注：のみ血行動態パラメータおよびS _P O _2は、動物は、肺洗浄液中ベンチレータから切り離されているので、代償不全のために動物を監視するために使用することができます。
4. 接地レベルに手動で漏斗を下げて、受動的に洗浄液を排出し、酸素化のための人工呼吸器に動物を再接続します。
5. 国連を待って動物を補償（MAPとS _のp O ₂の増加）ゴマ、できるだけ早く洗浄を繰り返します。再洗浄のための時間枠は5分を超えてはなりません。
   注：血行動態代償不全の場合には2洗浄液間の動物の安定化は、全身性低血圧を治療するための昇圧剤の使用を回避するために、さらに低酸素血症に遭遇する募集操縦を回避するのに役立ちます。動物が減少し、P O ₂ / F _I O ₂の比率にもかかわらず、酸素化を維持するために、洗浄液と、次の実験中1.0のF _I O ₂で換気されています。洗浄液中に2〜4センチメートルのH ₂ OでPEEPを設定すると、無気肺の迅速な形成を推進していきます。しかし、PEEPは、ARDSのベルリン定義を満たすために肺傷害の誘導後に、または5センチメートルH ₂ O以上に設定する必要があります。 PEEPにはリクルートメント手技または変更が許可されていない実験中、についても一切調査官によって誘発されるバイアスを防ぐために肺損傷の重症度秒。
6. S _pが O ₂における血行動態の悪化との妥協に応じて、第二または第三の洗浄後の動脈血ガス試料を取ります。
7. 繰り返し洗浄液P O ₂ / F _I O ₂比（ホロヴィッツ指数）が持続的にF _I O ₂ 1.0およびPEEP≥5 CMH ₂ Oで少なくとも60分間、100 mmHgの下に測定されるまで、
8. 血行動態代償不全を防止するために、7.25以上の動脈血のpHを維持するために洗浄液の期間中に人工呼吸器の速度を調整します。
9. O ₂ / F _I O ₂比（ホロヴィッツ指数）が持続的に60分間100 mmHgの下に測定されたP一度界面活性剤の洗い出しモデルに基づく実験/治療を開始します。
   注：記載のように肺傷害の誘導後、肺機能の変化は、時間安定なままで劣化し、あるいは人工呼吸器の設定に応じて改善されます。
   注：この動物モデルは、界面活性剤の洗い出しと無気肺の結果としての形成に基づきます。したがって、無気肺領域の動員につながる可能性が指定された人工呼吸器の設定からの偏差は、（PIPまたはPEEPの増加）、部分的に洗浄液の有害な効果を逆転し、このモデルの標準化の妨げになります。

実験と安楽死の7終了

1. すべての測定が行われ、データは実験終了前に固定されていることを確認してください。
2. さらに、連続麻酔にフェンタニル0.5mgのを注入し、少なくとも5分待ってください。中心線を使用して迅速にカリウムの少なくとも60ミリモル続いチオペンタール（少なくとも千mg）を過剰摂取を注入します。

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結果

P O ₂ / F _I O ₂ -ratioは、肺洗浄液中に減少するが、単一の洗浄の正確な影響を予測することは困難です。私たちは、O ₂ / F _I O 100 mmHgの下の₂ -ratio Pの低下を検出するために、以降三洗浄液から動脈血ガスサンプルを取ることを始めます。 Pの減少は、O ₂ / F _I O ₂ -ratio 100以下mmHgのが達成されると、我?...

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ディスカッション

この記事では、繰り返し、肺洗浄液によって界面活性剤の休薬によるブタにおける重度の肺損傷を誘発するステップ命令でステップを説明します。この具​​体的な方法は、肺機能および肺血管抵抗の再現性と同等の劣化を可能にします。 Pは、O ₂ / F _I O ₂比が100 mmHgの下に減少し、1時間以下の100 mmHgのまままでは豚を洗浄することが不可欠です。一度、これは募集の?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evita Infinity V500	Dräger		intensive care ventilator
Vigilance I	Edwards		monitor
Vasofix Braunüle 20G	B Braun	4268113B	peripheral vein catheter
Mallinckrodt Tracheal Tube Cuffed	Covidien	107-80	8.0 mm ID
MultiCath3	Vygon	157,300	3 lumen central venous catheter, 20 cm length
Leader Cath Set	Vygon	115,805	arterial catheter
Percutaneus Sheath Introducer Set	Arrow	SI-09600	introducer sheath for pulmonary artery catheter of 4-6 Fr., 10 cm length
Swan-Ganz True Size Thermodilution Catheter	Edwards	132F5	pulmonary artery catheter, 75 cm length
Flow through chamber thermistor	Baxter	93-505	for measuring cardiac output
urinary catheter			no specific model requiered