マウスにおける変形性関節症の痛みのMonoiodoacetateモデル

要約

変形性関節症（OA）、または変性関節疾患、部分的にしか利用でき鎮痛剤によって制御されたまま痛みを伴う衰弱状態です。動物モデルは、OAに関連する疼痛の機序の我々の理解を改善するために開発されています。ここでは、マウスでのOA痛みのmonoiodoacetateモデルのための方法論について説明します。

要約

変形性関節症（OA）患者の主な症状は、疼痛経路内の周辺だけでなく、中央の変化によってトリガされる痛みです。このようなNSAIDSやアヘンなどのOA疼痛に対する現在の治療は、いずれも十分な効果も有害な副作用を欠いています。 OAの動物モデルは、OAに関連する疼痛の機序の我々の理解を改善し、治療のための新規な薬理学的標的を規定するために開発されています。現在、げっ歯類におけるOAの利用可能なモデルは、1膝関節への外科的および化学的介入が含まれます。 monoiodoacetate（MIA）モデルは、ラットとマウスの両方におけるOAにおける関節破壊をモデル化するための標準となっています。ラットにおいて行うことが容易であるモデルは、同側肢における急速な疼痛様反応、種々の用量の注入によって制御可能なレベルを誘導膝関節へのMIAの注射を含みます。 MIAの関節内注射はglycerを阻害することにより軟骨細胞の解糖を妨害しますアルデヒド-3-ホスファターゼデヒドロゲナーゼおよび軟骨細胞死、血管新生、軟骨下骨壊死と崩壊をもたらすだけでなく、炎症。関節軟骨および骨破壊の形態学的変化は、患者の病状のいくつかの側面を反映しています。関節損傷に伴い、MIA注射の誘発は、測定および定量化可能であり、同側後肢および体重負荷赤字に機械的な感度を呼びます。これらの行動の変化は、それによってOAの痛みの有用かつ関連する前臨床モデルとして膝でMIA注射を検証し、患者集団によって報告された症状のいくつかに似ています。

この記事の目的は、一貫して信頼性の高い記録を与えるために必要なステップを強調するために、心と関節内MIAの注射や過敏症の関連する開発の行動記録の方法論を記述することです。

概要

臨床的には、変形性関節症（OA）、または変性関節疾患は、関節軟骨の進行性の喪失、関節とその周辺の組織の軽度の炎症によって特徴づけられる痛みを伴う衰弱状態で、時には骨棘​​と骨嚢胞の形成。 OA患者は、持続性の痛み¹と表示が関節炎の関節^2-4に圧力と侵害刺激に対する感受性の増加を報告しています。現時点では、利用可能な治療方法と鎮痛剤が成功⁵のいくつかの学位を取得し、この条件に伴う痛みを軽減するために処方されると、OAの治療法はありません。しかし、OAの痛みは、OAの臨床的問題と動物モデルは、OA関連痛のメカニズムの理解を改善し、治療のための新たな標的を開示するために開発されているままです。

異なる特性を⁶で利用可能なOAのいくつかの動物モデルがあります。このような前方として外科的方法、十字靱帯離断を、利用することができます。しかし、それらは、熟練した外科的介入を伴い、内側半月板（DMM）の不安定化は、マウスで使用されている間、主に、ラットで行われます。 OAの自発的な開発は、モルモットで発生し、自発的な関節の変性は、年齢^7,8の3〜16ヶ月からC57黒マウスで報告されています。自発的なOAモデルは状態を誘導する任意の介入を伴わないが、彼 ​​らは固有の変動を持っている、そのようなものとして、より大きな数字を負担し^、9,10を要しました。化学的に誘導されたモデルは、一方で、外科的モデルよりもはるかに低侵襲性の処置を必要とする、そのようなものとして、実装が容易であり、異なる段階でOA病変の研究を可能にします。これらのモデルは、彼らが関節空間を逃れる場合毒性であり得る炎症剤、免疫毒素、コラゲナーゼ、パパイン、またはmonoiodoacetateの膝、で単回注射が含まれます。 OAの全ての化学モデルのうち、MIAは、PA、最も頻繁に使用されているものですこのモデルはMIA用量^11-15を変更することによって等級分けすることができ、再現性のある堅牢、かつ迅速な痛みのような表現型を生成するようrticularly、痛みを治療するための薬理学的薬剤の有効性をテストします。

げっ歯類におけるMIAの関節内注射は、OAのような病変および分析し​​、定量化することができる機能障害を再生します。 MIAは、細胞の解糖を破壊し、最終的に細胞死^16,17もたらす、グリセルアルデヒド-3-ホスファターゼの阻害剤です。 MIAの関節内注入は軟骨の変性と、骨骨棘^18,19の出現として後続の軟骨下骨の変化をもたらす、軟骨細胞死を引き起こします。

ラットにおけるMIAのユーティリティが²⁰前に説明したように、このモデルはますますノックアウトマウスの可用性と使用されているように、本 ​​論文では、マウスにおけるMIA誘発性OAの方法論に焦点を当てています。私たちはinjecための手順を記載しています膝と後肢における有害および非侵害刺激に対する感受性を測定するための方法に非常に小さな体積の化。

方法論の内訳は、ばらつきを低減し、そのようなものとして、モデルを改良し、研究に必要な動物の数を減らすのに役立ちます。

プロトコル

動物を対象とする手順は、キングス・カレッジ・ロンドンでの倫理委員会によって承認され、英国内務省規則に従っているされている（動物科学的手続きは1986 ACT）。

膝でMonoiodoacetateの1関節内注射

1. ハウス8から12時間の明/暗サイクル下での5のグループで10週齢のマウス（午前7:00に点灯）、食物および水を自由摂取とマウスは、実験前の起動に1週間順化してみましょう。
2. 治療に実験を盲目にコードとして5.動物数のグループにマウスをランダム化し、ケージ。ランダム化のためのパラメータとして体重を使用してください。
3. 注射の日に、新鮮に所望の濃度の滅菌生理食塩水（0.9％NaCl）でmonoiodoacetateの溶液を調製。対照マウスの別のグループに注射用の滅菌生理食塩水を使用してください。 MIAの最高勧め線量は10マイクロリットルで1 mgです。
   注意：Monoiodoacetate verはありますyの毒性。したがって、粉末を処理し、溶液を調製する際に手袋とマスクを着用することをお勧めします。溶液は無菌0.22μmのフィルターで濾過されるべきです。
4. O ₂混合（流量1.5 L /分）で2％イソフルランを提供する第一の室に置くことにより、麻酔トロリーを使ってマウスを麻酔し、その後も2％イソフルラン-O ₂混合物を提供するノーズコーン部分にマウスを転送、そのようなものとして、注入中に麻酔を維持します。麻酔下ながら、乾燥を避けるために、目に獣医軟膏を置きます。注入手順を実行しながら手術用ガウン、手袋、マスクを着用してください。
5. 後足上のピンチ刺激に対する応答の動物の欠如をチェックすることによって、麻酔を確認してください。
6. 動物が麻酔下になると、その背中の上に置きます。トリムやアルコールで膝関節の周囲を拭きます。ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンはFと同様に使用することができますまたは消毒。膝蓋腱（膝蓋骨怒鳴る白線）が見えるようになります。
7. 、注射部位を安定化させる膝関節と足関節の前面上の親指の下に人差し指を置くことにより、屈曲した位置に、まだ膝を維持するために。共同好みは必要ありません。
8. それは膝蓋骨の下にギャップが見つかるまで、注射の正確な部位を見つけるには、（先端が皮膚を貫通しないように）膝に沿って水平方向に注射器に取り付けた26 Gの針を実行します。領域をマークし、その後、注射のために垂直に針と注射器を持ち上げるために穏やかな圧力を適用します。脛骨に対して垂直に、膝蓋腱を通して、マークされた領域に針を挿入します。いいえ抵抗が感じされるべきではありません。
   1. ガイドとして、親指を使用して、エントリのサイトに表面的な注入。注入後、溶液の均一な分布を確実にするために、膝をマッサージ。シャープですぐに針を捨てますsのビン。
   2. 加熱されたマットの上に戻ってきれいなホームケージにマウスを置き、それらを回復することができます。彼らは胸骨横臥位を取り戻すそれらによって測定され、適切な意識を、取り戻すまで、動物に一定の警戒をしてください。動物が回収されたら、自分のケージに戻します。
      注：これは、染料が使用されているベストプラクティスとトレーニング目的や注射の正しい局在を確認するために行っ即時死後解剖のために提案されています。

機械的過敏症の2測定（アロディニア）

注：静的機械逃避閾値は、後足の足底表面にフォン・フライ毛を適用することによって評価されます。

1. 行動の部屋にマウスを持参し、気ままな動物はワイヤーメッシュグリッド上にアクリルキュービクル（8センチメートルのx 5センチメートル×10センチ）に順応しましょう​​。
   1. フォン・フレイ毛のアプリケーションへの2日前の順序でのためのキュービクルに取り扱い、2時間の馴化によって列車のマウスフォン・フレイ毛の適用中にストレスや歩行を制限します。試験日に、試験前に最大60分間キュービクルに動物を慣らします。全ての行動実験中にガウン、手袋、マスクを着用してください。
2. 繊維が曲がるまで後肢の足表面に校正フォン・フライ毛（製造会社によって較正され、グラム（g）のように表現されるような力の定義されたレベルを発揮する拡径の柔軟なナイロン繊維）を適用します。テスト中に0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、および1.0グラムの繊維を使用してください。
   1. 3秒間の場所でそれぞれの髪を保持するか、足が引き抜かれるまで、後者は肯定的な反応を定義します。引っ込め応答Xとしてマークし、応答のO不在：0.07グラムの刺激強度で開始し、「アップダウンの方法^」21に従って毛を適用します。応答が検出されるまで、1グラム（カットオフ力）まで、力の昇順に適用します。
   2. 繰り返すことによって、足を再テストステップ2.2.1、撤退を生産1以下の力を発揮するフィラメントから始まります。
   3. そして、何の撤退が発生しなくなるまで、力を下降することにより、順次残りのフィラメントを適用します。応答が観察されるまで昇順にフィラメントを再適用します。 6応答のシーケンスが得られるまで平板値²¹を参照して'K'値を得るために、（ 例えば 、OXOXOX）続けます。
   4. グラムの50％足引っ込め閾値として足引っ込め値を表します。式（10 ^{[Xrを+ Kδ]）/} 10,000（対数単位）のシーケンスで使用された最後のvon FreyフィラメントのXrを=値で、k =表形式の値、およびδを使用=繊維間の力の差を意味します。応答が検出されない場合は、1グラム^21,22の最大応答を使用します。
3. 上記の手順（2.2.1-2.2.4）に続いて、MIA充血前に、両方の後足の機械的閾値を評価しますベースライン値としてのn。注入後、機械的異痛の発症を確認するために、MIA後数週間のための定期的な日間隔で同側と反対側の足のしきい値を評価します。
   注：例では、閾値は0、3、5、7、10、14、21を測定し、28日MIA注射後に報告します。彼らは0.1グラム以下への応答を表示するとき、動物を異痛症と考えられています。 1グラムの範囲 - 通常の応答が0.6に入ります。

3.量の測定は赤字ベアリング

注：重量変化は、重量のインキャパシタンステスターを用いて測定される軸受。

1. 装置のプレキシガラス室に歩き、保持ボックスに座って、各マウスを訓練します。 、保持ボックスの前にマウスを置き、最大45°の入り口を持ち上げ、そしてマウスは中を歩くとボックスを閉じることができます。彼らは着座姿勢を採用するまで、動物が自由に移動できるようにします。この訓練は、少なくとも2日かかり、動物がまだありませんlであることを保証します室の両側にeaning。 100グラムのチェック重量（または機器の指示に応じて）で使用する前に、機器を校正。
   1. 各後足が適切な記録パッド¹¹上に置かれていることを確認します。各測定の持続時間は、製造業者の説明書に従って、1秒を要します。
2. 各記録セッションの記録パッドから各後肢に負担重量の3つの測定値を収集し、同側と反対側の足が負担重量の差を算出する平均値を使用します。グラムでの対側と同側の足の間の差として値を表します。
3. ベースライン値としてMIA注射の前に体重負荷の変化を評価します。その後、ゲート変更の発展を確認するために数週間にわたって定期的に評価を繰り返します。例えば、我々は、0、3、5、7、10、14、21日に測定された閾値を報告し、28日MIA注射後。
   注：通常の重量B50％の値を出穂は同側および対側後肢の両端に等しい量分布を表します。動物は過敏ディスプレイ、約45％の変化を重量支持考え。どちらのエンドポイントは、他に影響を与えるように、機械的閾値および体重負荷欠損の測定は、同じマウスで行うことができます。薬理学的評価のために、動物の各グループは、使用する化合物の薬物動態プロファイルに沿って投与後設定した時刻にテストする必要があります。

結果

マウスの膝関節を誘導中1mg MIA発症が用量依存性²³であるが、4週間まで赤字を保有する同側後肢および重量で機械的過敏症（異痛症）と呼ば-我々は最近、0.5の注入がことを報告しています。

図1に報告されたデータは、膝に注射投与量の範囲以下の同側後足でMIA誘発性の機械的過敏性の経時変化の一例を構成しています。具体的には、MIAの最低用量（0.5 mgの/マウス）は10日目に生理食塩水の注入に比べて閾値の50％の減少を誘導し、およびしきい値は、注射後28日目により生理食塩水対照のそれの70％に減少しました。 MIAの0.75ミリグラムの中間用量は、10日目に生理食塩水対照のしきい値よりも80％低かったとの1mg MIAの最高用量は、記号と関連していた28日目まで低いままであったしきい値の緩やかな減少をもたらしました5日目と28日目まで持続した10日、上のさらなる減少に閾値の低下ificant。

図2に報告されたデータは、膝関節におけるMIA注射に関連付けられた重み軸受変化の例を提供します。 0.5 mgのMIAの用量は、研究の28日の期間を通じて体重負荷の大幅な変化を誘導しなかったこの一連の実験では、0.75 mgのMIAの用量は、1日10から同側の足が負担重量の大幅な減少をもたらしました以降。注目すべきは、MIAの0.75 mgのに関連した体重負荷の非対称性は、研究の²³の間で可変と一貫性のない結果が生じることがあります。その代わりに、MIAは、一般的に再現可能な非対称性を重量支持し、 図2のデータを誘導するの1mgの用量は、観察期間の終了まで3日目から同側の後肢に負担重量の有意な減少を実証します。予想をSalIとして、NE-処置された動物は、変更をベアリング全く体重を示しませんでした。

図1は、 開発機械の異痛症ポストMIA注射。同側および対側後足の足引っ込め閾値は、前とMIA（0.5、0.75、および1mgの/マウス）および生理食塩水（0.9％NaCl）の注射後に評価し、N = 8ました - 10マウス/群。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、生理食塩水処置群対。スチューデント・ニューマン・クールズ事後テストに続いて、双方向反復測定ANOVA。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

体重負荷赤字の 図2. 開発sのポストMIA注入。体重分布の変化2後肢を[（同側と反対側の足に負担重量の同側足/合計に負担重量）* 100]として算出した間に（MIAの注射の前と後に評価しました。 0.5、0.75、および1mg /マウス）および生理食塩水（0.9％NaCl）、N = 8から10匹のマウス/群。 * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001、生理食塩水処置群対。スチューデント・ニューマン・クールズ事後テストに続いて、双方向反復測定ANOVA。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

この方法では、我々は後肢での非侵害及び侵害刺激に対する膝関節と感度の評価におけるMIAの関節内注射によりマウスにOAのような痛みを誘導するための好ましい方法を説明します。 MIA注射は、持続的な疼痛行動、すなわち変更された後肢体重負荷と呼ばれる機械的過敏症（異痛症）の発症と関連しています。このような静的な測定は、自由に移動する動物におけるトレッドミル上またはキャットウォーク分析により歩行分析によって補完することができます。 MIAモデルは、それらが治療アプローチを見分けるために有用であり得ることを示し、従来の鎮痛療法²⁴に応答します。 MIAの注射は技術的に困難ではないが、関節包は、軟骨細胞の毒性を誘導するためにカプセル外MIAの漏洩、およびその後の障害の原因となる、注入中にピアスすることができます。確かに、MIAの全身注射は、げっ歯類（a）で致命的なことができndは、軟骨細胞以外の組織や細胞にMIAの影響の可能性は望ましくないであることに加えて、結果を混乱させてもよいです。このように、モデルの重要な成分であり、信頼度は注入が関節空間に発生することを考慮する必要があるように細心の注意は、MIAの注射に与えられる必要があることを強調しなければなりません。このプロトコルは、それを実現するのに役立ちます。

ここで説明するプロトコルは、動物は、試験期間を通じて一貫性の痛みのような応答を提供確保することを目指しています。また、それらは、病理^15,23を誘導するために使用されるMIAの量を変更することにより、疾患の重症度の調整を可能にします。両方の疾患状態や痛みのような動作の迅速な誘導は、痛み改良化合物のタイムリーな評価を可能にします。これは、手術、既存と自然に過敏症を開発するために、より長い時間がかかることがOAのモデルを開発するよりも有利です。また、特に自発的なモデルのため、病気patholMIAモデルは、応答者の重要な発生率と関連しているのに対し、 - ^（80％7およそ20）術は、すべての動物を中に現れていません。 OAは両膝に発展するにつれてさらに、自発的なモデルは、体重負荷の変化の測定には適していません。行動の測定を考慮すると、動物は評価中に、穏やかでリラックスした保たれる必要があります。プロトコルに詳述されるようにこれは、動物が実験者に精通することを可能にする測定値を記録する前に、繰り返し処理によって、初期のトレーニングによって、達成されます。ストレスを軽減するためのキーポイントは、定数変更は、前述の問題を誘発するように、全体の行動試験のために同じ実験を使用することです。いずれのモデルと同様に、OAのMIAモデルは、このような患者ではOAの病態の遅い開発に似ていない、関節破壊の迅速性、などの制限を、クマ。この問題を克服する一つの方法は、SUと、このモデルを補完するであろうOAのrgicalモデル。化合物の開発におけるMIAの化学モデルの使用は、OAのような痛みの開発及び保守の上で予防および治療プロトコルの使用を可能にします。最後に、MIAモデルは、さらに、OAの疾患を理解するために貢献し、ノックアウトマウスの表現型形質の研究を補完します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monoiodoacetate	Sigma-Aldrich	I-2512-25G	≥ 98% purity
0.9% Saline	Mini-Plasco basic	365 4840
Isoflurane	Merial	DNI 4090/1
26 G Needle	Fisher Scientific	12947606
50 μl Hamilton Syringe	Sigma-Aldrich	20701
Von Frey Hairs	Linton Instruments	NC 122775-99
Incapacitance tester	Linton Instruments		Delivery on Request
Testing Cage Rack	Ugo Basile	37450
Compact Anesthetic system	Vet-Tech	AN001B
Medical O2	BOC	101-F
Aldasorbers		Vet -Tech	AN006A