마우스에서 관절염 통증의 Monoiodoacetate 모델

요약

골관절염 (OA) 또는 퇴행성 관절 질환, 부분적으로 만 가능한 진통제 통증 제어 유지와 관련된 쇠약 상태이다. 동물 모델은 OA 관련 통증 메커니즘에 대한 이해를 향상시키기 위해 개발되고있다. 여기에서 우리는 마우스의 OA 통증의 monoiodoacetate 모델에 대한 방법을 설명합니다.

초록

골관절염 (OA) 환자의 주요 증상은 통증 경로 내 주변뿐만 아니라 중앙 변화에 의해 유발되는 통증이다. 이러한 NSAIDS 또는 아편과 같은 OA 통증에 대한 현재의 치료는 어느 쪽도 충분히 효과도 해로운 부작용없는 없습니다. OA 동물 모델은 OA 관련 통증 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 치료를위한 신규 약물 표적을 정의하기 위해 개발되고있다. 현재 설치류에서 OA의 가능한 모델은 하나의 무릎 관절에 수술 및 화학 개입을 포함한다. monoiodoacetate (MIA) 모델 쥐 모두에서 OA에 공동 혼란을 모델링하기위한 표준이되었습니다. 래트에서 수행하기 쉬운 모델은, 사지 동측 급격한 통증과 같은 반응, 상이한 투여 량의 주입에 의해 제어 될 수있는 수준을 유도하는 무릎 관절에 MIA 주사를 포함한다. MIA의 관절 내 주입 glycer 억제하여 연골 세포의 해당 작용을 방해알데하이드 -3- 인산 탈수소 효소 및 연골 세포 사멸, 신생 혈관, 연골 하골 괴사 붕괴의 결과뿐만 아니라, 염증. 관절 연골 및 뼈 파괴의 형태 학적 변화는 환자의 병리의 일부 측면을 반영한다. 관절 손상과 함께, MIA 분사를 유도는 측정 가능하고 정량화 할 수있는 동측 뒷발과 체중 베어링 적자에 기계적인 감도를 언급했다. 이러한 행동 변화하여 OA 통증의 유용한 관련 전임상 모델로 무릎에 MIA 주입의 유효성을 검사, 환자 집단에 의해보고 된 증상의 일부 유사합니다.

이 문서의 목적은 일관되고 안정적​​인 녹음을 제공하기 위해 필요한 조치를 강조하는 마음으로 내 관절 MIA의 주사 및 과민 반응의 관련 개발의 행동 레코딩의 방법을 설명하는 것입니다.

서문

임상 적, 골관절염 (OA) 또는 퇴행성 관절 질환, 관절 연골, 및 관절 주위 조직의 경미한 염증 및 골극 및 골 낭종 때로는 형성의 진보적 인 손실을 특징으로하는 고통스럽고 쇠약 상태입니다. OA 환자는 지속적인 통증 ¹ 표시가 관절염 관절 ^2-4 압력과 유해 자극에 감도를 증가보고합니다. 현재 사용 가능한 치료 방법 및 진통제가 성공 ⁽⁵⁾ 어느 정도로,이 조건과 관련된 통증을 완화하는 처방과 OA에 대한 치료가 없습니다. 그러나, OA 통증은 OA의 임상 적 문제 및 동물 모델은 OA 관련 통증 메커니즘에 대한 우리의 이해를 개선하고 치료에 대한 새로운 목표를 공개하도록 개발되고있다 남아있다.

다른 특성 ⁶ 사용할 수 OA 여러 동물 모델이 있습니다. 이러한 전방으로 수술 방법,십자 인대 절개가 이용 될 수있다. 그러나 숙련 수술 적 치료를 포함하고, 내측에 메 니스 커스 (DMM)의 불안정화가 마우스에 사용되는 동안 주로 래트에서 수행된다. OA의 자발적인 개발 기니 돼지와 자발적인 공동 변성은 나이 ^{7, 8의} 3 ~ 16 개월 C57 블랙 마우스에서보고되었다 발생합니다. 자발적인 OA 모델 상태를 유도하는 개입을 포함하지 않지만,이 고유의 변동을 가지고, 같은 큰 숫자를 발생하고 ^{9,10 비용.} 화학적으로 유도 된 모델은, 다른 한편으로는, 수술 모델보다 덜 침습적 인 과정이 필요하며, 예로서, 쉽게 구현되고 다른 단계에서 OA 병변의 조사를 허용한다. 이 모델은 공동 공간을 벗어날 경우 독성이있을 수 있습니다 항염증제, 면역 독소, 콜라게나 제, 파파인, 또는 monoiodoacetate의 무릎, 단일 주사를 포함한다. OA의 모든 화학 모델로, MIA는 하나 가장 자주 사용되는, 파이다이 모델 MIA 투여 ^11-15를 변경하여 채점 할 수있는 재현성 강력하고 신속한 통증 같은 표현형을 생성 rticularly로 통증을 치료하는 약물 제제의 효능을 테스트한다.

설치류에서 MIA의 관절 내 주입은 OA 병변 분석 및 정량화 할 수있다 기능 장애를 재생한다. MIA 셀룰러 해당 작용을 방해하고 결국 세포 사멸 ^{(16, 17)의} 결과로, 글리 세르 알데히드 -3- 포스파타제의 억제제이다. MIA의 관절 내 주입은 ^{18, 19을} 골극 뼈의 모양으로 연골의 변성 및 후속 연골 하골의 변화를 선도, 연골 세포의 세포 사멸됩니다.

쥐에서 MIA의 유틸리티 ⁽²⁰⁾ 이전에 설명한 바와 같이이 모델이 점점 녹 - 아웃 마우스의 가용성을 사용하고,이 논문에서 우리는 쥐 MIA에 의한 OA의 방법론에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 injec하는 절차를 설명매우 작은 무릎에 볼륨 및 뒷다리에 유해하고 비 - 유해 자극에 감도를 측정하기위한 방법을 기.

방법론의 붕괴는 변동을 감소시키는 데 도움과 같은 연구에 필요한 동물의 수를 모델을 수정하고 감소시킨다.

프로토콜

동물 주제와 관련된 절차 킹스 칼리지 런던에서 윤리위원회의 승인과 영국 홈 오피스 규칙에 따라 있습니다되었습니다 (동물 과학적인 절차는 1986 법).

무릎 Monoiodoacetate의 1. 관절 내 주입

1. 하우스 8 -. 음식과 임의 량의 물과 12 시간 조명 / 어두운주기에 따라 5 그룹에서 10 주령 마우스 (오전 7시시에 점등) 이전에 실험을 시작하기 마우스 1 주일 동안 순응하자.
2. 랜덤과 코드 등 5. 동물 수의 그룹 케이지 쥐 치료에 실험을 멀게 할 수 있습니다. 임의의 매개 변수로 체중을 사용합니다.
3. 분사의 날, 갓 원하는 농도로 멸균 생리 식염수 (0.9 % 염화나트륨)의 monoiodoacetate의 솔루션을 준비합니다. 제어 쥐의 별도 그룹에 주사에 대한 멸균 생리 식염수를 사용합니다. MIA의 최고 권장 용량은 10 ㎕의 1 밀리그램이다.
   주의 : Monoiodoacetate은 버전입니다독성 Y. 따라서, 분말을 처리하고, 용액을 제조 할 때 장갑 및 마스크를 착용하는 것이 권장된다. 이 솔루션은 멸균 0.22 μm의 필터로 여과한다.
4. 제 _O이 혼합물에 2 % 이소 플루 란을 전달 챔버 내에 배치하여 마취 트롤리를 사용하여 마우스를 마취 또한 2 % 이소 플루-O ₂ 혼합물을 제공 노즈 콘 부분에 마우스를 전송 한 후 (속도 1.5 L / min의 유량) 및 와 같은 주사 동안 마취를 유지한다. 마취하면서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 놓습니다. 주입 절차를 수행하는 동안 수술 가운, 장갑, 마스크를 착용 할 것.
5. 뒷 발에 핀치 자극에 대한 반응의 동물의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다.
6. 동물 마취되면, 그 뒷면에 배치합니다. 트림과 알코올로 무릎 관절을 둘러싸고있는 영역을 닦습니다. 포비돈 요오드 클로르헥시딘도 F 사용될 수있다또는 소독. 슬개 건 (슬개골 울부 짖는 소리 흰색 선)이 표시 될 것입니다.
7. , 주사 부위를 안정화 무릎 관절과 발목 관절의 전방 표면 위의 엄지 손가락 아래에 집게 손가락을 배치하여, 절곡 위치에서 여전히 무릎을 유지하기 위해서는. 공동 환경 설정이 필요하지 않습니다.
8. 이 슬개골 아래의 격차를 찾을 때까지 주입의 정확한 위치를 찾으려면 수평 무릎 (않도록 끝으로 피부를 관통하지 않기)을 따라 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 실행합니다. 지역을 표시 한 다음 바늘을 들어 올려 주입 수직 주사기하는 부드러운 압력을 적용합니다. 경골에 수직, 슬개 건을 통해 표시된 지역에 바늘을 삽입합니다. 어떤 저항을 느끼지해야합니다.
   1. 가이드로 엄지 손가락을 사용하여 항목의 사이트에 피상적 주입. 주입 후, 용액의 균일 한 분포를 보장하는 무릎 마사지. 날카로운 즉시 바늘을 폐기의 빈입니다.
   2. 다시 가열 매트에 깨끗한 집 케이지에 마우스를 배치하고 복구 할 수 있습니다. 그들은 흉골 드러 누움을 되 찾는 그들에 의해 측정에 적합 의식을 되 찾을 때까지 동물에 일정한 경계를 유지합니다. 동물이 회복되면, 자신의 케이지로 돌아갑니다.
      참고 : 염료를 사용하고 즉각적인 사후 해부 사출의 정확한 위치 파악을 확인하기 위해 수행 우수 사례 및 교육 목적을 위해 좋습니다.

기계 과민 2. 측정 (이질통)

참고 : 정적 기계적 인출 임계 값은 뒷발의 발바닥 표면에 본 프레이 모발을 적용하여 평가된다.

1. 행동 방으로 마우스를 가져오고 무제한 동물은 와이어 메쉬 그리드 꼭대기 아크릴 칸막이 (8cm X 5cm X 10cm)에 순응 할 수 있습니다.
   1. 본 프레이 헤어 응용 프로그램 두 가지 일 전에 순서의 칸막이로 처리하고 2 시간의 습관화하여 기차 마우스프레이 머리카락의 응용 프로그램 중 스트레스와 보행을 제한합니다. 시험 날, 60 분까지 시험을하기 전에의 칸막이에 동물을 길들. 모든 행동 실험 중에 가운, 장갑 및 마스크를 착용 할 것.
2. 섬유 굴곡부까지 뒷발의 발바닥 표면에 대한 보정 본 프레이 머리카락 (제조 회사에 의해 보정하고 그램 (g로 표현되는 힘의 레벨을 정의 발휘 증가 직경)의가요 성 나일론 섬유)를 적용한다. 테스트 기간 동안 0.008, 0.02, 0.04, 0.07, 0.16, 0.4, 0.6, 1.0 g 섬유를 사용합니다.
   1. 3 초 동안 장소에서 각각의 머리를 잡고 또는 발 철회 될 때까지, 후자는 긍정적 인 반응을 정의. 철수 응답 X로 표시 및 응답의 O 부재 : 0.07 g의 자극 강도로 시작하여, "업 - 다운 ^{방법"(21)에} 따라 머리카락을 적용합니다. 응답이 검출 될 때까지, 1g (컷오프 힘)까지 힘의 오름차순으로 적용한다.
   2. 반복하여 발을 다시 테스트움츠림을 나타낸 것 아래에 힘을 가하는 필라멘트부터 시작하여, 단계 2.2.1.
   3. 더 인출이 발생하지 때까지, 힘을 내림차순으로, 순차적으로 나머지 필라멘트를 적용합니다. 다시 신청 응답이 관찰 될 때까지 오름차순 필라멘트. 여섯 응답 시퀀스 ^값을 표 ^21를 참조하여, 'K'값을 획득하기 위해 (예 OXOXOX)을 얻을 때까지 계속한다.
   4. g 50 % 발 움츠림 임계 같은 발 움츠림 값을 표현한다. 식 ^{(10 XR + K의 δ를])} / 사용 XR = 마지막 (로그 단위) 시퀀스에 사용 프레이 필라멘트, K = 표 값의 값 및 δ =이 섬유 사이의 힘의 차이를 의미 만. 응답이 검출되지 않은 경우, 1g의 ^{21, 22의} 최대 반응을 사용한다.
3. (2.2.1-2.2.4) 전술 한 절차에 따라, MIA의 injectio 전에 양쪽 뒷발의 기계적 한계를 평가기본 값으로 N. 주입 후, 기계적 이질통의 개발을 확인하기 MIA 후 몇 주 동안 규칙적인 간격 일 동측과 반대측 발의 임계 값을 평가한다.
   참고 : 예를 들어, 우리가 측정 한계 값을보고 0, 3, 5, 7, 10, MIA 주사 후 14, 21, 28 일입니다. 그들은 0.1 g 이하로 응답을 표시 할 때 동물 이질 통증 여겨진다. 1g 범위 - 정상 응답은 0.6에 속하는.

무게 베어링 적자 3. 측정

주 : 중량 변화는 중량 incapacitance 시험기를 사용하여 측정되는 베어링.

1. 장치에 플렉시 챔버에 걸어 유지 상자에 앉아 각 마우스를 훈련. , 유지 상자의 전면에 마우스를 놓고 45 ° 입구를 들어, 마우스가에서 도보 상자를 닫습니다 할 수 있습니다. 그들이 앉아있는 자세를 채택 할 때까지 동물이 자유롭게 이동할 수 있습니다. 이 훈련은 적어도 두 개의 일이 소요과 동물이 아직되지 리터 것을 보장상기 챔버의 양측에 eaning. (또는 장비의 지시에 따라) 100 g을 체크 무게 사용하기 전에 악기를 보정합니다.
   1. 각 뒷발 해당 기록 패드 ^(11)에 배치되어 있는지 확인합니다. 각 측정의 기간은 제조업체의 지침에 따라, 1 초 걸립니다.
2. 각 기록 세션 기록 패드로부터 각 뒷발에 부담 중량의 3 회 측정을 수집하고 동측과 반대측 발 부담 중량의 차이를 계산하기 위해 평균값을 사용한다. 그램의 반대편과 동측 발 사이의 차이로 명시 값.
3. 기본 값으로 MIA 주입하기 전에 체중 베어링 변화를 평가합니다. 그 후, 몇 주 동안 규칙적인 간격으로 반복 평가 게이트 변화 현상을 확인하기 위해. 예를 들어, 우리는 측정 한계를보고 0, 3, 5, 7, 10, MIA 주사 후 14, 21, 28 일입니다.
   참고 : 정상 체중 (B)를50 %의 이어링 값은 동측 및 반대측 사지에서 동일 무게 분포를 나타냅니다. 동물 과민 디스플레이 약 45 %의 변화를 베어링 무게 고려했다. 모두 종점은 다른 영향을 기계적 한계 중량 베어링 적자의 측정은 동일한 마우스에서 수행 될 수있다. 약리학 적 평가를 위해, 각 그룹의 동물은 사용되는 화합물의 약동학 적 프로파일에 맞추어 투여 후에 설정 시간에 테스트되어야한다.

결과

온 세트는 용량 의존적 ²³ 있지만, 마우스 무릎 관절를 유도 1 mg의 MIA 최대 4 주 동안 적자 베어링 기계 동측 뒷 발에 과민 반응 (이질통)와 무게를 언급 - 우리는 최근 0.5의 주입이 있다고보고있다.

도 1에보고 된 데이터는 무릎 주입 선량의 범위 다음 동측 뒷발의 MIA 유도 기계적 과민증의 시간 과정의 일례를 구성한다. 즉, MIA (0.5 밀리그램 / 마우스)의 가장 낮은 투여 량은 10 일째에 생리 식염수의 주입에 비교하여 임계 값의 50 % 감소를 유도하고, 임계 값은 주사 후 28 일째에 의해 식염수 컨트롤 이들의 70 %로 감소 하였다. MIA의 0.75 mg을 중간 용량은 하루 10 식염수 제어 임계 값보다 80 % 낮았다 1 mg의 MIA의 최고 용량은 기호 관련이 하루 28까지 낮은 남아 임계 값의 점진적인 감소 결과5 일에 임계 값에 ificant 드롭하고 28 일까지 지속 된 10 일에 추가 감소.

도 2에보고 된 데이터는 무릎 관절 MIA 주사와 관련된 중량 변화 베어링의 예를 제공한다. 0.5 mg의 MIA 용량이 연구의 28 일 기간에 걸쳐 베어링 무게에 상당한 변화를 유도하지 않은 상태에서 실험 세트에서, 0.75 mg의 MIA의 용량은 하루 10에서 동측 발 부담 중량의 상당한 감소 결과 이후. 특히, 체중 베어링 비대칭 연구 ⁽²³⁾ 사이의 변수와 일치하지 않는 결과가 발생할 수 있습니다 MIA의 0.75 밀리그램과 관련. 대신에, 1 mg의 MIA의 용량은 일반적으로 비대칭도 2의 데이터 베어링 재현 중량 보여 관찰 기간이 끝날 때까지 3 일에서 동측 뒷발에 부담 중량의 상당한 감소를 유도한다. 예상을 SalI으로NE-처리 된 동물은 변화 베어링에는 중량 없었다.

그림 1. 개발 기계의 이질통 포스트 MIA 주입. 동측 및 반대측 뒷발의 발 탈퇴 임계 값은 전 MIA (0.5, 0.75, 및 1 ㎎ / 마우스) 및 식염수 (0.9 % 염화나트륨)의 주사 후 평가, N = 8했다 - 10 마우스 / 그룹. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <식염수 투여군에 비해 0.001; 학생 뉴먼 - Keuls 다음 양방향 반복 측정 ANOVA 사후 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

무게 베어링 적자 그림 2. 개발의 포스트 MIA 주입. 두 뒷다리 사이의 체중 분포의 변화는 다음과 같이 계산 하였다 [* 100 (무게가 동측 및 반대측 발에 부담 중량의 동측 발 / 합계 부담)] 전 MIA 주입 (후 평가 하였다 0.5, 0.75, 1 밀리그램 / 마우스) 및 식염수 (0.9 % NaCl을), n은 8-10 마우스 / 그룹. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 식염수 처리 군 대. 학생 뉴먼 - Keuls 다음 양방향 반복 측정 ANOVA 사후 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

With this methodology, we describe a preferred method for inducing OA-like pain in the mouse by an intra-articular injection of MIA in a knee joint and assessment of sensitivity to non-noxious and noxious stimuli in the hind limbs. MIA injection is associated with persistent pain behavior, namely altered hind limb weight bearing and development of referred mechanical hypersensitivity (allodynia). Such static measurements can be complemented by gait analysis on a treadmill or by catwalk analysis in freely moving animals. MIA models are responsive to conventional pain-relieving therapies ²⁴, indicating that they may be useful for discerning therapeutic approaches. While the injection of MIA is not technically difficult, the joint capsule can be pierced during the injection, resulting in leakage of MIA outside the capsule, and subsequent failure to induce toxicity of chondrocytes. Indeed, systemic injection of MIA can be fatal in rodents and possible effects of MIA on tissues and cells other than chondrocytes may confound results, besides being undesirable. As such, it must be stressed that great care needs to be given to the injection of the MIA, as it is a critical component of the model, and confidence needs to be given that the injection occurs into the articular space. This protocol helps to achieve that.

The protocols described here aim to ensure the animals provide consistent pain-like responses throughout the test period. Also, they allow adjustment of disease severity by altering the dose of MIA used to induce the pathology ^15,23. The rapid induction of both disease state and pain-like behavior allow timely evaluation of pain-modifying compounds. This is advantageous over existing surgical and spontaneously developing models of OA, which can take a longer period of time to develop hypersensitivity. Also, particularly for the spontaneous models, the disease pathology does not manifest in all animals (approximately 20 - 80% ⁷), whereas the MIA model is associated with significant incidence of responders. Furthermore, spontaneous models are not suitable for measurements of changes in weight bearing, as OA develops in both knees. When considering behavioral measurements, the animals need to be kept calm and relaxed during the assessments. This is achieved, as detailed in the protocol, by early training before recording measurements and by repetitive handling, which allows animals to become familiar with the experimenter. A key point to reduce stress is to use the same experimenter for the behavioral test throughout, as constant changing will induce the issues previously mentioned. Like any model, the MIA model of OA bears limitations, such as the rapidity of joint disruption, which does not resemble the slow development of OA pathology in patients. One way to overcome this issue would be to complement this model with a surgical model of OA. The use of the MIA chemical model in compound development allows for the use of preventative and therapeutic protocols over the development and maintenance of OA-like pain. Finally, the MIA model would complement studies of phenotypical traits of knock-out mice, helping to further understand the OA disease.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monoiodoacetate	Sigma-Aldrich	I-2512-25G	≥ 98% purity
0.9% Saline	Mini-Plasco basic	365 4840
Isoflurane	Merial	DNI 4090/1
26 G Needle	Fisher Scientific	12947606
50 μl Hamilton Syringe	Sigma-Aldrich	20701
Von Frey Hairs	Linton Instruments	NC 122775-99
Incapacitance tester	Linton Instruments		Delivery on Request
Testing Cage Rack	Ugo Basile	37450
Compact Anesthetic system	Vet-Tech	AN001B
Medical O2	BOC	101-F
Aldasorbers		Vet -Tech	AN006A