Method Article
A osteoartrite (OA), ou doença degenerativa das articulações, é uma condição debilitante associada a dor que permanece apenas parcialmente controlada por analgésicos disponíveis. Os modelos animais estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA. Aqui nós descrevemos a metodologia para o modelo monoiodoacetate de dor OA no mouse.
Um dos principais sintomas de pacientes com osteoartrite (OA) é a dor que é desencadeada por alterações periféricas, bem como centrais dentro das vias de dor. Os tratamentos atuais para dor OA, tais como AINEs ou opiáceos são nem suficientemente eficaz nem desprovido de efeitos colaterais prejudiciais. Modelos animais de OA estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA e definir novos alvos farmacológicos para a terapia. Actualmente modelos disponíveis de OA em roedores incluem intervenções cirúrgicas e químicas em uma articulação do joelho. O modelo monoiodoacetate (MIA) se tornou um padrão para a modelagem de interrupção conjunto em OA em ambos os ratos e camundongos. O modelo, que é mais fácil de realizar, no rato, envolve a injecção de MIA em uma articulação do joelho, que induz respostas de dor semelhante rápidas no membro ipsilateral, o nível do qual pode ser controlada por injecção de doses diferentes. injecção intra-articular de condrócitos MIA perturba glicólise através da inibição glyceraldeído desidrogenase-3-fosfatase e resulta em morte de condrócitos, neovascularização, necrose do osso subcondral e colapso, bem como a inflamação. As mudanças morfológicas da cartilagem articular e do osso interrupção são reflexo de alguns aspectos da patologia do paciente. Junto com lesões articulares, MIA induz injeção referido sensibilidade mecânica na pata traseira e peso déficits ipsilaterais de rolamento que são mensuráveis e quantificáveis. Essas mudanças de comportamento se assemelham a alguns dos sintomas relatados pela população de pacientes, validando assim a injeção de MIA no joelho como um modelo pré-clínico útil e relevante de dor OA.
O objetivo deste artigo é descrever a metodologia de injeções intra-articulares de MIA e as gravações comportamentais do desenvolvimento associado de hipersensibilidade com uma mente para destacar as medidas necessárias para dar gravações consistentes e confiáveis.
Clinicamente, a osteoartrite (OA), ou doença degenerativa das articulações, é uma condição dolorosa e debilitante caracterizada por uma perda progressiva de cartilagem articular, inflamação moderada dos tecidos em torno das articulações e algumas vezes formação de osteófitos e quistos ósseos. Os pacientes com OA relatar dor persistente 1 e exibição aumento da sensibilidade à pressão e estímulos nocivos na artrite conjunta 2-4. No momento, não há cura para a OA com abordagens e analgésicos terapêuticas disponíveis são prescritos para aliviar a dor associada com esta condição, com algum grau de sucesso 5. No entanto, dor OA continua a ser um clínicos modelos de emissão e de animais da OA estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA e divulgar novos alvos para a terapia.
Existem vários modelos animais de OA disponíveis com diferentes características 6. Os métodos cirúrgicos, como o anteriortransecção do ligamento cruzado, pode ser utilizado. No entanto, envolvem a intervenção cirúrgica hábil e são realizados principalmente no rato, enquanto que a desestabilização do menisco medial (DMM) é utilizado no ratinho. Desenvolvimento espontâneo da OA ocorre na cobaia e degeneração da articulação espontânea foi relatada em ratos pretos C57 de 3 a 16 meses de idade 7,8. Modelos OA espontâneos não envolvem qualquer intervenção para induzir a doença, mas eles têm variabilidade inerente, e, como tal, incorrer em maiores números e custa 9,10. modelos induzidas quimicamente, por outro lado, necessitam de muito menos invasiva do que os procedimentos cirúrgicos modelos, e como tal, são mais fáceis de implementar e permitem o estudo de lesões da OA em diferentes fases. Estes modelos incluem injecções únicas no joelho de agentes inflamatórios, imunotoxinas, colagenase, papaína, ou monoiodoacetate, que podem ser tóxicos se escapar do espaço da articulação. De todos os modelos químicos de OA, MIA é o mais frequentemente utilizado, particularly para testar a eficácia de agentes farmacológicos para o tratamento de dor, como este modelo gera um fenótipo reprodutível e robusto, e rápido da dor do tipo que pode ser graduada, alterando MIA dosagem 11-15.
injecção intra-articular de MIA em roedores reproduz lesões OA-like e deterioração funcional que pode ser analisada e quantificada. MIA é um inibidor da gliceraldeído-3-fosfatase, interrompendo a glicólise celular e eventualmente resultando em morte celular 16,17. Injecção intra-articular de MIA provoca a morte celular dos condrócitos, conduzindo a degeneração da cartilagem e do osso subcondral alterações subsequentes, tais como a aparência de osso osteófitos 18,19.
Como o utilitário de MIA no rato foi descrito antes de 20, neste artigo vamos nos concentrar sobre a metodologia de OA induzida por MIA em camundongos já que este modelo está sendo usado cada vez mais com a disponibilidade de ratinhos knock-out. Nós descrevemos um procedimento para a INJECção de volumes muito reduzidos para o joelho e métodos para medir a sensibilidade a estímulos nocivos e não nocivos nos membros posteriores.
A repartição da metodologia vai ajudar a reduzir a variabilidade, e como tal, o modelo de refinar e reduzir o número de animais necessários para o estudo.
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Kings College de Londres e estão em conformidade com os Regulamentos do Reino Unido Escritório Internos (Animais procedimentos científicos Act 1986).
1. injecção intra-articular de Monoiodoacetate no joelho
2. Medição da Mecânica de hipersensibilidade (alodinia)
Nota: os limiares de retirada mecânica estática são avaliadas através da aplicação de filamentos de von Frey na superfície plantar da pata traseira.
3. Medição da Déficit de suporte de peso
Nota: As alterações na capacidade de peso são medidos utilizando um testador de peso incapacitance.
Temos relatado recentemente que a injecção de 0,5-1 mg MIA nos induz conjuntos rato joelho referida hipersensibilidade mecânica (alodinia) na pata posterior ipsilateral e rolamento de peso déficits para até 4 semanas, embora latências são 23 dose-dependente.
Os dados apresentados na Figura 1 constitui um exemplo do decurso de tempo de hipersensibilidade mecânica induzida por MIA nas patas traseiras ipsilaterais na sequência de uma gama de doses injectadas no joelho. Especificamente, a dose mais baixa de MIA (0,5 mg / murganho) induziu um decréscimo de 50% de limiares em comparação com a de injecção de soro fisiológico no dia 10, e os limiares diminuiu para 70% daqueles dos controlos de solução salina por dia 28 após a injecção. A dose intermédia de 0,75 mg de MIA resultou num decréscimo gradual em limites que foram 80% inferiores aos limites de controlo de solução salina no dia 10 e manteve-se baixa até ao dia 28. A dose mais elevada de 1 mg MIA foi associado com um sinalgota ificant no limiar no dia 5 e uma redução ainda maior no dia 10, que foi mantido até ao dia 28.
Os dados apresentados na Figura 2 fornecem exemplos de mudanças de peso do rolamento que estão associados com a injecção MIA nas articulações do joelho. Neste conjunto de experiências, enquanto que a dose de 0,5 mg MIA não induziu alterações significativas no peso de rolamento durante toda a duração de 28 dias do estudo, a 0,75 mg de dose MIA resultou numa redução significativa do peso suportado pela pata ipsilateral do dia 10 em diante. Notavelmente, rolamento de peso assimetria associada com 0,75 mg de MIA pode produzir resultados variáveis e inconsistentes entre os estudos 23. Em vez disso, a dose de 1 mg MIA geralmente induz peso reprodutível rolamento assimetria e os dados na Figura 2, demonstram uma redução significativa do peso suportado na pata traseira ipsilateral do dia 3 até ao final do período de observação. Como esperado, salianimais tratados com ne não mostrou rolamento de peso mudanças.
Figura 1. Desenvolvimento de alodinia mecânica Pós MIA Injection. Limiares de retirada da pata das patas traseiras ipsilateral e contralateral foram avaliadas antes e após a injeção de MIA (0,5, 0,75 e 1 mg / mouse) e soro fisiológico (NaCl 0,9%), n = 8 - 10 ratinhos / grupo. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 versus grupo tratado com solução salina; Two-way medições repetidas ANOVA seguido de Student Newman-Keuls post hoc teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Desenvolvimento de Déficit de suporte de pesoInjeção s Pós MIA. Mudanças na distribuição de peso corporal entre os dois membros posteriores foram calculadas como [(peso suportado em ipsilateral pata / soma do peso suportado nas patas ipsilateral e contralateral) * 100] foram avaliadas antes e após a injeção de MIA ( 0,5, 0,75, e 1 mg / ratinho) e solução salina (NaCl a 0,9%), n = 8 - 10 ratos / grupo. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 versus grupo tratado com solução salina. Two-way medições repetidas ANOVA seguido de Student Newman-Keuls post hoc teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Com esta metodologia, nós descrevemos um método preferido para a indução de dor OA, como no rato por uma injecção intra-articular de MIA numa articulação do joelho e avaliação da sensibilidade a estímulos não nocivos e tóxicos nos membros posteriores. injeção de MIA está associada com o comportamento da dor persistente, ou seja alterado o peso dos membros posteriores rolamento e desenvolvimento de hipersensibilidade mecânica referido (alodinia). Tais medições estáticas podem ser complementadas por análise de marcha em uma esteira ou por análise de passarela em animais que se movem livremente. Modelos MIA são sensíveis a terapias convencionais para aliviar a dor 24, o que indica que eles podem ser úteis para discernir abordagens terapêuticas. Embora a injecção de MIA não é tecnicamente difícil, a cápsula da articulação podem ser perfuradas durante a injecção, resultando em derrame de MIA fora da cápsula, e subsequente incapacidade para induzir toxicidade dos condrócitos. Na verdade, injeção sistêmica de MIA pode ser fatal em roedores umand possíveis efeitos de MIA em tecidos que não sejam os condrócitos células podem confundir os resultados, além de ser indesejável. Como tal, deve sublinhar-se que um grande cuidado deve ser dada para a injecção de MIA, uma vez que é um componente crítico do modelo, e confiança deve ser dada a injecção ocorre para o espaço articular. Este protocolo ajuda a conseguir isso.
Os protocolos aqui descritos destinam-se a garantir que os animais proporcionam respostas de dor-like consistentes durante todo o período de teste. Além disso, eles permitem o ajuste da gravidade da doença por alteração da dose de MIA utilizado para induzir a patologia 15,23. A rápida indução de ambos estado de doença e comportamento de dor-como permitir a avaliação oportuna de compostos modificadores da dor. Isto é vantajoso em relação existente cirúrgica e espontaneamente o desenvolvimento de modelos de OA, que podem levar um longo período de tempo para se desenvolver a hipersensibilidade. Além disso, particularmente para os modelos espontâneos, a doença PatholO logia não manifestar-se em todos os animais (aproximadamente 20 - 80% 7), enquanto que o modelo de MIA está associada com incidência significativa de respondedores. Além disso, os modelos espontâneos não são adequados para medições de mudanças na sustentação de peso, como a OA desenvolve-se em ambos os joelhos. Ao considerar as medidas comportamentais, os animais devem ser mantidos calmo e relaxado durante as avaliações. Isto é conseguido, conforme detalhado no protocolo, pela formação inicial antes de medidas de gravação e pela manipulação repetitiva, que permite animais para se familiarizar com o experimentador. Um ponto chave para reduzir o stress é usar o mesmo experimentador para o teste comportamental todo, como a mudança constante irá induzir os problemas anteriormente mencionados. Como qualquer modelo, o modelo de MIA da OA traz limitações, tais como a rapidez de interrupção conjunto, que não se assemelha o lento desenvolvimento da patologia OA em pacientes. Uma maneira de superar este problema seria para complementar este modelo com um sumodelo rgical da OA. A utilização do modelo químico de MIA em desenvolvimento composto permite a utilização de protocolos preventivos e terapêuticos sobre o desenvolvimento e manutenção da dor OA semelhante. Finalmente, o modelo MIA irá complementar os estudos de características fenotípicas de ratos knock-out, ajudando a entender melhor a doença OA.
None of the authors have competing interests or conflicting interests.
JSV é apoiado por uma bolsa de colaboração para MM pela Comissão Europeia (GAN 603191-PAINCAGE).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Monoiodoacetate | Sigma-Aldrich | I-2512-25G | ≥ 98% purity |
0.9% Saline | Mini-Plasco basic | 365 4840 | |
Isoflurane | Merial | DNI 4090/1 | |
26 G Needle | Fisher Scientific | 12947606 | |
50 μl Hamilton Syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | |
Von Frey Hairs | Linton Instruments | NC 122775-99 | |
Incapacitance tester | Linton Instruments | Delivery on Request | |
Testing Cage Rack | Ugo Basile | 37450 | |
Compact Anesthetic system | Vet-Tech | AN001B | |
Medical O2 | BOC | 101-F | |
Aldasorbers | Vet -Tech | AN006A |
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