ソーシャル・コミュニケーションを評価するためにマウスの超音波発声を記録

要約

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

要約

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

概要

神経精神障害の患者は通常、社会的コミュニケーションの欠損を表示する（ 例えば 、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、またはアルツハイマー病患者^）1。遺伝子操作されたマウスは、より多くのであり、より頻繁に、これらの障害²の遺伝的原因をモデル化するために使用されます。これらのマウスモデルにおいて、社会的コミュニケーションを研究することは、非定型社会的機能不全につながる遺伝子変異のメカニズムを理解するための、新しい治療法をテストするために高い関心があります。マウスは社会的動物であり、嗅覚、触覚、視覚と音響信号を使用して、お互いに通信するので、彼らは社会的コミュニケーションを評価するのに適したモデルです。

マウス超音波発声は、今現在^、3,4声帯通信障害の遺伝的基盤をモデル化するためのプロキシとして使用されている（しかし、この種で発声学習の存在は、最近の研究はにargU場合であっても^、5,6をまだ議論されて発声学習^7）の不在のための電子。実験用マウスは、（参照して見直さ^8）、同性社会的相互作用では、男女の社会の性的相互作用に、母子の関係の中での超音波発声を放出することが見出されていると若年若年社会的相互作用^9インチ仔マウスは、ダムや同腹子¹⁰から分離された生活の最初の2週間の間に分離・コールを発します。男性は時発情メス（または彼女からの尿の合図^）11,12の存在下で超音波発声を発します。同性^13,14の未知の同種と相互作用する場合、男性と女性は、超音波発声を放ちます。組織とこれらの発声の機能は完全には明らかではなく、さらなる調査が必要です。機能面での現在の知識は、子犬の分離・コール、成人男性vocalizatに向け成人女性の近接の円滑化を聞いた母親における検索行動の誘発に限定されていますイオン¹⁵と成人女性発声^16を聞い成人男性の増加探索行動。

精神神経疾患のマウスモデルでボーカル通信の異常を特徴づけることは、実験条件の主要な貢献を除外するために標準化された条件で実施されるべきです。同時に社会的相互作用や神経生物学の研究の評価と組み合わせたこのような特徴付けは、様々な遺伝的モデルでマウスの超音波通信の異なる側面への遺伝的寄与に関する知識を向上させる必要があります。長期的に、それは、ヒトにおける社会的コミュニケーションのいくつかの神経生物学的基盤の更なる光を与える必要があります。我々は現在、確実に、実験室でのオスとメスのマウスの両方のために開発中および成人期に超音波発声を引き出すために、単純なプロトコルを提供することを目指しています。このようなプロトコルは、より確実ultrを比較するために記録の標準化を容易にする必要があります株と研究所間asonic発声の排出量。また、マウスの超音波発声の録音との経験を有していない実験室で、このような記録の設定アップを促進すべきです。また、社会的な障害でだけでなく、超音波発声の排出の状況に重要な情報を得るために、成体マウスにおける社会的相互作用の間に同時に収集され、詳細な行動データを用いて超音波発声のデータを結合するために、現在の可能性を強調表示します。このような分析は、マウスの超音波発声の組織と機能に新たな光を当てるます。最後に、我々はまた、mouseTubeデータベース （http://mousetube.pasteur.fr）上の全体の科学界で超音波発声の録音を共有する可能性をアドバタイズします。録音データへのオープンアクセスは、科学者たちは、他のラボに記録されている超音波発声で自分のデータを比較できるようにすることで、マウスの超音波通信に関する知識を高める必要があります（類似のまたは異なる株/プロトコルと）ratories、および/または異なる条件下で記録されたファイルとその分析方法に挑戦します。

プロトコル

倫理の声明：動物を対象とする手順はパスツール研究所、パリでComitéドールEthiqueアン実験ANIMALE（CETEA）のn°89によって承認されています。

1.動物の準備

1. 子犬の分離通話を記録するには、関心のマウス系統から妊娠した雌を得ます。注：ロバスト制御動物を得るために、野生型、ヘテロ接合およびノックアウト仔を含む少なくとも10リットルを得るために、ヘテロ接合の雄と雌の繁殖。
2. 同性間の相互作用の間に発声を記録するために、成体マウスの2種類を取得します。
   1. （アカウントに個体間変動を取るために）関心の株からの試験マウスとして、少なくとも12人の男性または各遺伝子型の女性12名を取得します。注：このプロトコルは、大人のためによく適応しているが、それは実験⁹の前に減少し、分離時間で、少年に調整することができます。このテストでは、男性または女性のために動作します。ただし、テストの男性を避けますオス - オスの社会的相互作用試験で明らかに攻撃的な表現型を示すマウス株からの。
   2. 親和相互作用の量を最大にするために、実験前に試験動物を隔離します。家は彼らの社会的モチベーションを高めるために3日間3週間（最小^14,17に積極的な相互作用を低減するため）と女性（E.エー、未発表データ）ごとに個別に男性が。
   3. （ 例えば、マウスを相互作用として、3.1.3を参照してください）新しいニューカマーとしてそれらを使用する試験株の遺伝的背景の株の代表から男性または女性を取得します。例えば、研究されている変異株は、C57BL / 6Jバックグラウンドで生成された場合、新たなニューカマーとしてC57BL / 6Jマウスを使用します。これらのマウスの各々は、新しいコーナーとしてより1日2回使用されないように、必要な動物の数を計算します。グループでそれらを収容します。
3. 発情期の雌の存在下で男性の発声を記録するために、成体マウスの2種類を取得します。
   1. リットルで入手興味のある株の各遺伝子型から東に12性的に成熟した雄は（アカウント個体間変動を考慮に入れるため）。男性は前に雌と経験を持っていたことがない場合は、個別のケージに入れて超音波発声^6を放出するように彼らのモチベーションを高めるために、試験前に女性の2日間で1夜を過ごすそれらを残す：注意してください。
   2. 記録された男性のバックグラウンド株からの性的に成熟した雌を入手します。例えば、変異型男性が検討されている場合は、C57BL / 6Jメスを使用し、C57BL / 6Jバックグラウンド上に生成されています。これらのマウスの各々が複数の1日3回使用されないように、必要とされる女性の数を計算します。グループでそれらを収容します。

2.パップアイソレーションコール

1. パップ識別
   1. 三日誕生の予測日前に、妊娠した雌を分離します。
   2. 出産のため、女性毎朝と毎晩を確認してください。 P0として誕生の日に注意してください。
   3. （0.3ミリメートルX 13ミリメートル[30 G½ "]針でペースト緑タトゥーの皮下注射）長期的な足の入れ墨を使用して、P1で子犬を識別します。マークされた1、2、3または4つの足でコードを作成します。のようにして最小限の子犬を妨害し、できるだけ早く巣にそれらを戻すために、可能な限り迅速に。
2. 録音パップ分離コールにケージを設定します。
   1. 自作防音室（ 図1A）または単純な発泡スチロールの箱のどちらかを使用します。各記録のための温度を監視するために、箱の中に温度計を配置します。温度は18℃〜22℃の間に残っていることを確認してください。
   2. （ボックスの上部の穴を通って）上部にマイクを置きます。マイクの膜は12〜15センチメートル子犬が横たわりますボックスの下部より上にあるように、マイクの高さを調整します。コンピュータにサウンドカードにマイク、サウンドカードを接続します。
   3. 荘のゲインを調整するにはNDカード、実験に使用されることはありません子犬と記録トライアルを実施しています。実験（2.3.1を参照）と同様の条件で子犬を置きます。ドアを閉める。それが最大値になるように、サウンドカードのゲインを調整します（発声のための可能な最大振幅を持っている）が、過負荷を与えず（記録ソフトでライブスペクトログラム表示で確認してください）​​。
      注：コールの大部分の振幅は可能な限り高いレベルで維持されている場合、いくつかのコールが過負荷になる可能性があります。
   4. 各記録セッションのゲインレベルを登録し、仔/リットル/セッション間でそれを変更しないでください。ゲインレベルの変動は、不正確な呼び出し検出と自動検出し、測定を（5.4から5.1を参照）を用いた解析で同じ閾値と音響変数対策につながります。

図1：アイソレーションを記録するための設定は、仔マウスと超音波発声のスペクトログラムから呼び出す子犬分離通話を記録するために自作防音室の（A）の例。。現在のコールタイプの分類に使用されるさまざまなコールタイプの（B）スペクトログラム。表1に説明を参照してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3. 子犬の分離の記録は2日ごとに呼び出して行います。夜に生まれた仔のために午前中にレコーディングを行い、年齢差の半日と同じ年齢のクラスの子で分類を回避するために、日中に生まれ子犬のために午後インチこれは非常に若い段階P2とP4のために最も顕著です。
   1. リターの1子犬を取ります。エタノール10％で洗浄し、乾燥したプラスチック製の受信者に早く、軽く、できるだけそれを置きます（直径：9cm;高さ：10 cmマイクがカバーするエリア）から逃げるの古い子犬を防ぐために。ちょうどマイクの下に受信者を置きます。
   2. 迅速かつ静かにできるだけボックスを閉じます。記録ソフトウェアの子犬超音波発声の録音を開始します（16ビットフォーマットは、300 kHzのサンプリング周波数は、高品質で150 kHzまでの音の振幅を捕捉します）。
   3. 記録の所要時間は（5分まで）が経過した後に、録画を停止します。箱の外に子犬を取ります。子犬の足の入れ墨を書き留めます。
   4. プローブ温度計と子犬の腋窩温度を取ります。マークより簡単に臭いレスペン（水性インク）、認識すると小さな点とその背中に子犬次のいずれかが選択され、新しいものがあるたびに、すべての子犬を操作避けるために、巣の中既に記録仔選ばれました。巣に子犬を元に戻します。
   5. 10％のエタノールでその底部を覆っているプラ​​スチック製の受信者とプラスチックを洗い、よく乾かし内部次の子犬を入れてください。
   6. ごみの次の子犬を選択し、2.3を繰り返します。
4. 可能にするために1時間の残りの期間の後に（ ら ¹⁹ Eyのシュマイサーら ¹⁸内とのメソッドのセクションを参照してください減少試験電池の詳細については）体重、運動協調性、負の走地性、および発生マークをチェック子犬は、超音波発声の排気エミッション後に回復します。このようなChadman ら ²⁰とScattoni ら^。21のように完全な発達テスト用電池が行われた場合、動物の別のコホートを使用してください。
5. 生活の最初の2週間を通して子犬ボーカル行動と発達を特徴づけるためにこれらの記録をP2とP12との間に2日ごとに繰り返します。

3.超音波発声同性ソーシャルインタラクション中

1. 発声レコーディング
   1. テストケージを準備（50×25センチメートル×30 Cメートル^3;プレキシグラスは、100ルクス[低強度の白色光]）、石鹸水で洗浄、乾燥し、防音室で2センチメートル新鮮な寝具を充填しました。
      1. ケージのすべてのコーナーから放出された発声を記録することができるようにマイクを置きます。テストケージ（ケージのか、三脚上のいずれか）の隅にマイクを修正し、ケージの表面全体を覆​​うように、角度マイク・ケージの底を調整します。
         注：超音波は非常に指向しています。
      2. テストケージの表面全体をキャプチャするために防音室の上部にビデオカメラを置きます。
         注：マイクはビデオでテストケージの隅に隠れていないか確認してください。
      3. テストの前に、予備の男性とそれ以降の実験に使用されない予備の女性とサウンドカードのゲインを調整します。記録チャンバー内の試験ケージにこれらの動物を入れてください。記録された発声の振幅を最大化するために、サウンドカードのゲインレベルを調整府tは録音ソフトウェアでライブスペクトログラム表示で見られるように過負荷を最小限に抑えることができます。
         注：ゲインはマイクと発声動物との間の距離に依存します。
   2. 新鮮な寝具上のテストケージに、（それは「乗員」と呼ばれるオスまたはメス）を試験するために動物を紹介します。 3.1.3で導入された未知の同種のためにその関心を最大化するために20分間、防音室での試験ケージに慣らすことにしておきます。
   3. この馴化時間の後、対話のための第²の動物を紹介する（後でそれらを識別するために、男性または女性、乗員と同じ性別が、異なる耳マーク/足のタトゥー、それは「新しいカマー」と呼ぶことにします）。
      1. テストケージに新コーナーの導入をキャプチャするとビデオ（150高品質でkHzまでの音の振幅を捕捉するために16ビット形式、300 kHzのサンプリング周波数）の超音波発声の記録を開始します。 uの記録を開始ケージの探査と社会的相互作用の間に発声発光のベースラインレベルとの比較が必要な場合に慣れ（単独乗員）中ltrasonic発声。
      2. 時間時計の新コーナーマウスの後肢が地面に触れ正確に（マイクの近くに「BIP」音）を押すことにより、手動/視覚的にオーディオとビデオの録画を同期します。
      3. （例えば4分、十分な超音波発声を収集するのに十分な期間にわたって）所望の時間に相互作用2匹の動物を残します。
   4. それぞれのホームケージに戻って、乗員と新コーナ​​ーを置きます。テストケージから使用寝具を空にし、石鹸水で洗浄し、ペーパータオルでそれを乾燥させます。新鮮な寝具を入れて、次のテストのための防音室の中に戻って置きます。

4.男性発声発情女性との相互作用の間に

1. 早朝にテストの日男性は、発情周期内での性的状態を決定するために、各女性からの膣スメアを取ります。
   1. 尾によって女性を持ち、ケージグリッド上に彼女を維持します。 20μlのPBS（ すなわち 、同じ20μlのPBSを注入し、思い出す数回）で膣数回すすぐためにピペットを使用してください。同じピペットチップで20μlのPBSを思い出し。女性が数日間連続して試験される場合、任意の感染を避けるために、滅菌PBSを使用。
   2. スライド上の膣細胞の懸濁液を含むPBSを広げます。 （鉛筆でスライド側の個人を識別）1スライド上の4つのサンプルを置きます。スライドは染色を行う前に乾燥してみましょう。
   3. 実験室ヒュームフードの下で働きます。
      1. 純粋なメイグリュンワルドの1浴、リン酸緩衝液（0.1 M）の1バス、ギムザR（リン酸緩衝液中の1月20日）の1浴を準備します。
      2. その後、3分間純粋なメイ・グリュンワルドの浴にスライドを置きます1分間、リン酸緩衝液の浴中でそれらを洗浄し、最後にギムザR（リン酸緩衝液中の1/20）の浴中で10分間移します。
      3. その後、10秒間リン酸緩衝液の浴に再びスライドをすすぎ、それらを乾燥させてください。
   4. 顕微鏡下で染色したスライドを調べます。 （;完全発情青で染色された核のない、）日中に使用することができる女性は、そのサンプルに存在する唯一の大規模な角化上皮細胞のものです。
2. それらをテストする前に試験室に少なくとも30分で男性を置きます。
3. 発声レコーディング
   1. 必要に応じて3.1を繰り返します。
   2. （新鮮な寝具に）試験されるべき男性をご紹介します。彼は10分間防音室での試験ケージに慣らすのままにします。
   3. この馴化時間の後、（染色から選択したものの中で）発情期の女性を紹介します。
      1. 超音波発声やビデオの録画を開始テストケージの女性の導入をキャプチャします。ケージの探査と社会的相互作用の間に発声発光のベースラインレベルとの比較が必要な場合は（男性単独）馴化の間に超音波発声の記録を開始します。
      2. 時間時計にメスのマウスの後肢が地面に触れ正確に（マイクの近くに「BIP」音）を押すことにより、手動/視覚的にオーディオとビデオの録画を同期します。
      3. （例えば4分、十分な超音波発声を収集するのに十分な期間にわたって）所望の時間に相互作用2匹の動物を残します。
   4. それぞれのホームケージにオスとメスを元に戻します。テストケージから使用寝具を空にし、石鹸水で洗浄し、ペーパータオルでそれを乾燥させます。新鮮な寝具を入れて、次のテストのための防音室の中に戻って置きます。
      毎日各発情期の雌を一度だけ使用することが最適である（ただし、必要であれば、それは次のことができます。注意して​​ください同じ日にではなく）の行に3回まで使用すること。

5.変数抽出します

1. 分析のためのオーディオファイルを準備します。注：以下の手順はvisoft SASLabプロに固有のものであり、使用されるソフトウェアに応じて変更されることがあります。
   1. 彼らは時間の時計の「BIP」で正確に開始し、（子犬の録音、大人の録音のための4分5分）所望の期間後に終了するようにファイルをカットします。
   2. （; 30 kHzの周波数を持つハイパスカットオフ[編集]> [フィルター]> [FIRタイムドメインフィルタ）は、ハイパスフィルタを用いて、30 kHzの下での振幅をフィルタリングします。関心（アクション]> [バッチ処理> FIRフィルタ）のすべてのファイルをフィルタリングするためにバッチ処理を使用してください。
   3. ソフトウェアでそれらを標識することにより、各超音波発声を識別します。
      1. （波形イベントからセクションラベルを作成]> [ツール]> [ラベル）子犬の録音のための自動検出を使用してください。しきい値を調整し、時間と余裕Fを保持しますまたは最も正確な検出。手動検出を確認し、（推奨）必要に応じてラベルを調整します。
      2. （、発声を選択し、右クリックして、マーカーからセクションラベルを挿入する）バックグラウンドノイズを持つ大人の記録のために視覚的検出（ラベルの手動挿入）を使用します。
   4. スペクトログラムを作成します。自動パラメータ測定値（[ツール]> [パラメータ自動測定>パラメータ自動測定の設定）を有効にします。
   5. 「有効自動測定」、「全体のスペクトログラムから計算パラメータ」、および「自動更新」チェックボックスをオンにします。対話的（セクションラベル）：「エレメントの分離」を選択します。
   6. 希望の時間的なパラメータ（要素の持続時間、間隔、開始/終了時間）とスペクトルに基づくパラメータ（ピーク周波数）、および測定値の位置（要素の開始、要素の終了、平均値、最大値、最小値）を計算するためにチェックボックスをオンにします。
   7. 測定値をコピーして貼り付けますスプレッドシートのメートル。
      注意：大人に行っ記録のために、スペクトルベースの​​パラメータの測定があるため、バックグラウンドノイズのは不可能かもしれません。スペクトログラム上で直接異なる周波数値をクリックし、テーブル内の値を手動で貼り付けることにより、ピーク周波数の手動測定を使用してください。
2. 最初の（ラベル数の合計）放出された発声の数を決定することによって、コールレート、分ごとのコールのすなわち、数を決定します。次に、ファイルの（分単位）持続時間によって記録された発声の合計数を割ることによって、コール・レートを計算します。
3. シーケンスの組織を決定するための呼び出しの間の時間間隔の時間的な組織、 すなわち 、分布を決定します。
   1. 各ラベルの開始/終了時間を使用して発声の終わりnおよび発声の開始n + 1の間の時間間隔を算出します。
   2. ウルトラ間の時間間隔の分布密度を確立しますIC発声。
4. コールのレパートリーを決定する、 すなわち、記録に存在するコールタイプを定義します。 表1および図1Bに示された分類の例を使用してください。
   1. 5.1.3に各発声を標識すると、ラベルにコールタイプの名前を書きます。
   2. ボーカルのレパートリーを構築するために正確な数と各コールタイプの割合を計算します。
5. 自動測定が可能である場合は、各発声、 すなわち、持続時間、ピーク周波数に対する音響特性を決定する（ すなわち、最大振幅の周波数）初めに、通話、最大と最小のピーク周波数の終わり、とは周波数を意味する（ 図1B） 。
   1. 自動的に時間を測定するためのソフトウェアで自動パラメータ測定機能を使用して、ピーク周波数特性（ 例えば 、開始、終了、平均値、最大値、最小値）子犬の録音インチ
   2. 大人の録音のための発声の期間として、ラベルの長さを使用してください。スペクトログラム・ウィンドウに手動で測定したピーク周波数特性（ 例えば、開始、終了、最大値、最小値）。
6. カップル超音波発声データと社会的相互作用データ（ICYプラットフォーム²²からMiceProfilerプラグイン）。
   1. プロトコールに記載されているようにできるだけ正確にオーディオおよびビデオ録画を同期することを確認します。
   2. ショーモンら ²²に記載されているようにICYプラットフォームのマウスプロファイラトラッカープラグインを使用して、社会的相互作用のビデオをエンコードします。導入された動物の後足が地面に触れたときに正確に追跡を開始します。
   3. ショーモンらに記載されているようにICYプラットフォームのマウスプロファイラビデオラベルメーカーのプラグインでエンコードされたビデオファイルと（ マウスプロファイラトラッカーによって生成された）、それに対応するxmlファイルをアップロードアル^。22。
      注：それらが同じ名前を持っている場合、マウスプロファイラビデオラベルメーカーのプラグインが自動的にビデオファイルやオーディオファイルの解析から生成されたテキストファイルをリンクします（参照：http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Makerを） 。
   4. マウスのスケールが正しいことを確認した後、数や区切りファイル内の各社会的事象の間に放出された発声の割合を得るために、ファイルごとに "USV統計の作成」をクリックしてください。

mouseTubeデータベース 6.ファイルのアップロード

1. ファイルは機関の外部からアクセス可能なストレージサーバにあることを確認します。
   注：セキュリティレベルの高いいくつかの施設でホストされているサーバーは、施設の外から接続する人々によってアクセスできるように、特定の構成が必要になります。
2. mouseTubeのウェブサイト（http://mousetube.pasteur.fr）に移動します。ログイン（ログインしますNDパスワード）は、管理者が各ユーザに帰属されます。
3. 既に記録されたマウス系統は、「株」ボタンをクリックしてmouseTubeデータベースに存在するかどうかを確認してください。ない場合は、それを作成するために、管理者に依頼してください。
4. ボタンを「作成>科目」を使用して被験者を作成します。記録された動物の識別コードを入力します。データの後の検索を容易にするためのグループでそれらを収集します。
5. ボタンを ">プロトコル作成」を用いた超音波発声を記録するために使用されるプロトコルの説明を入力します。
6. ボタンを「作成>実験」を使用して、各記録セッションのための実験を​​作成します。プロトコル、記録された個人のグループ、使用するハードウェアとソフトウェアとその特異性を指定します。
   注：この実験は、発声ファイルに対応するすべてのメタデータを収集します。
7. 「発声を使用して、発声のファイルへのリンクを作成]> [作成＆＃34;ボタン。リスト内の実験を選択します。コピーして発声ファイル（このリンクはhttpで始まる：// ...）のURLを貼り付けて、列を「リンクするファイル」の対応するフィールドに。 「mouseTubeとファイル間のリンクを作成」ボタンをクリックしてエントリを検証します。
   注：同時に、各ファイルの各ボックスを満たすために必要とされません。
8. 必要に応じて、任意の時点で入力されたリンクを変更し、「注意」の項で詳細を追加。より詳細な情報を与えるためにメモを書き留めることを躊躇しないでください。オーディオファイルと同時に記録された映像ファイルに向けてリンクが入力されている場合たとえば、これは「ノート」で指定することができます。

結果

現在のプロトコルでは、我々はProSAP1 / Shank2、自閉症スペクトラム障害^{（ASD）23-25} ​​に関連する遺伝子を欠損したマウスのボーカル挙動を特徴とします。 ASDは、社会的コミュニケーションの欠損や常同行動¹によって特徴付けられます。私たちのShank2 ^{- / -}マウスは多動、不安の増大および非定型ボーカル通信^18,26を示し^ました 。 。マウスは、それらの野生型同腹子における典型的な逆U字カーブと比較して、子犬の分離・コールのその排出率の非定型発達のプロフィールを表示Shank2 ^{- - / -}確かに、我々はShank2ことに注意^{/ -}マウスでは増加したコールレートを表示しましたP4において、それらの野生型同腹仔（ 図2）と比較してP6速度を呼び出す減少。 comparisoにメス^{- / -}我々はまた、Shank2を伴う女性の相互作用に減少したコールレートを観察しました野生型同腹子（ 図2）を含む相互作用を有するN。私たちは、5種類のコールカテゴリのレパートリーを調べました。 （P2、P6とP10ここで例えば）仔の間で異なるように思われ、大人（ 図3）。遺伝子型関連の相違点は、主に成人期に有意でした。 ^{- / -}大人Shank2伴う社会的相互作用の間、C57BL / 6Nの女性と男性または女性を、より短い通話や非構造化の呼び出しは、それらの野生型同腹仔（ 図3DおよびE）を含む相互作用と比較して記録しました。 Shank2 ^{+ / +}メス（ 図3E）を含む相互作用と比較して、女性^{- / -}それほど複雑コールと周波数は電話も大人Shank2を含むC57BL / 6Nの女性との相互作用中に記録されたジャンプします。最後に、我々はまた、手動で音響の変数を測定しました。有意な遺伝子型関連の相違デュはありませんでしたリングの開発。対照的に、成人Shank2が関与する相互作用の間に記録されたコールの継続時間は、 ^{- / -}メスは、その野生型同腹仔（ 図4A）を含む相互作用の中に記録されるものよりも短かったです。また、超音波発声のピーク周波数が重要な遺伝子型関連の相違²⁶せずに子犬の開発中に増加したことを強調しました。 Shank2が関与する相互作用の間に^{- / -} C57BL / 6Nの女性と男性または女性は、超音波発声は、それらの野生型同腹仔（ 図4B）が関与する相互作用の中に記録されたコールと比較して低いピーク周波数を持っていました。

また、本プロトコルはMiceProfiler（ICYソフトウェア、研究所過去から抽出された行動データにオーディオ録音からのデータを組み合わせることにより、超音波発声の放出の文脈を検討することができユーロ、パリ）。動物が接触し、新コーナーの肛門性器領域を盗聴より具体的には、乗員にいたとき、例えば、雌同士の相互作用で、ほとんどの超音波発声は放出された、あるいは少なくとも乗員が新コーナーの後ろにあります。乗員が新コーナー（ 図5、上パネル）に近づいた時に、マウスはまた、多くの超音波発声を発せられました。 ^{- / -}マウス乗員が野生型マウスであったときよりも（新コーナーの肛門性器領域にスニッフィング、 例えば ）新コーナーと物理的に接触していた乗員Shank2が時より少ない発声を記録しました。それは野生型マウスであった場合よりもマウス^{- / -}新コーナーの後ろに乗員がShank2をしたときに以下の発声がトリガされました。より多くの発声はまた、変異体（ 図5、下のパネル）よりも新しいコーナーが乗員マウスの視野にいたときに記録され、より多くのように野生型でました。

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図2：開発中および成体のオスとメス Shank2 における超音波発声の排出率 ^{- / -} マウスおよび野生型同腹子仔の割合呼び出します（2日毎P2からP12に、N = 18-19 Shank2 ^{+ / +、} n = 15-16 Shank2 ^{- / - ）}と成人男性発情メスの相互作用（N = 15 Shank2 ^{+ / +}の間に、N = 16 Shank2 ^{- / - ）}と雌同士の相互作用（N = 15 Shank2 ^{+ / +、N} = 13 Shank2 ^{- / - ）}は、野生型マウス（左パネル）およびShank2 ^{- / -}マウス（右パネル）。データは平均値として提示されている+/- SEM及び個々の点（非対ウィルコクソンのテスト：* p <0.05、** P <0.01、*** P <0.001）。ge.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：Shank2のボーカルレパートリー ^{- / -} マウスと野生型同腹子 P2仔によって放出された五つの異なるコール・タイプの割合（; N = 20 Shank2 ^{+ / +、N} = 18 Shank2 ^{- / - ）、P6}仔。 （B; N = 19 Shank2 ^{+ / +、N} = 18 Shank2 ^{- / - ）、P10}仔（C; N = 20 Shank2 ^{+ / +、N} = 18 Shank2 ^{- / - ）、}発情メスと成人男性（D ; nは= 16 Shank2 ^{+ / +、N} = 16 Shank2 ^{- / - ）}と成人女性、別の女性（Eであり; n = 15 Shank2 ^{+ / +、N} = 13 Shank2 ^{- / - ）}は、野生型マウス（左パネル）およびShank2で^{- / -}マウス（右のパネル）。 ：（* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001カイ二乗検定）。データは平均+/- SEMおよび個々の点として表示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：Shank2における超音波発声から抽出されたアコースティック変数 ^{- / -}すべてのコールタイプのマウスと野生型同腹子 （A）期間は、P2仔（N = 20 Shank2 ^{+ / +、N} = 18 Shank2によって放出された混乱します^{- / -} ）、P6仔（N = 19 Shank2 ^{+ / +、N} = 18 Shank2 ^{- / - ）、P10}仔（N = 20 Shank2 ^{+ / +} 、N = 18 Shank2 ^{- / - ）、}大人の発情メスとオス（N = 16 Shank2 ^{+ / +、N} = 16 Shank2 ^{- / -}別の女性との）および成体の雌（N = 15 Shank2 ^{+ / +、} n = 13 Shank2 ^-野生型マウスにおける）（左パネル）およびShank2 ^{- / - / -}マウス（右パネル）。すべてのコールタイプで測定（B）最大ピーク周波数は、別の女性（同じNsの上記のような）との発情メスと成人女性とP2仔、P6仔、P10仔、成人男性で混乱しました。データは平均として提示されている+/- SEMおよび個々の点を（非対になったウィルコクソンのテスト：* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：コンテキストメス-メスの成体の社会的相互作用におけるマウスの超音波発声の発光のC57BL / 6NマウスとShank2 ^{+ / +を}含むペアによって放出された超音波発声の割合（N = 16、A）とShank2を含むペア^{- 。/ -}とC57BL / 6Nマウス（N = 13、B）行動イ ​​ベント（赤：乗員、緑：新コーナー）：次のタイプの中に社会的接触、乗員のマウスから口-経口接触、肛門性器スニッフィング、ano-乗員の背後に新コーナーマウスからスニッフィング性器、新コーナーの後ろに乗員、新コーナー、乗員の不動、乗員からの新コーナー、アプローチの不動＆新コーナーから新コーナー、アプローチから脱出＆乗員新コーナーの視野の乗員、乗客の視野での新コーナー、新しいコーナ以下、乗員、アプローチから脱出＆乗員、アプローチから逃れる＆新コーナーからの脱出。データは、pです憤慨、平均+/- SEM及び個々の点（非対ウィルコクソン検定：* p <0.05、** P <0.01）。未発表のデータ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

コールタイプ	説明
ショート	期間≤5ミリ秒と周波数範囲≤6.25kHzの
シンプル	周波数範囲で一方向のみで期間> 5ミリ秒と周波数範囲≤6.25キロヘルツ（フラット）、または周波数変調（上方または下方）> 6.25 kHzの
複雑な	周波数の複数の方向及び周波数範囲> 6.25キロヘルツで変調（変調）、または1つ以上の追加の周波数Cの封入creationCompleteコンポーネント（高調波または非線形現象が、飽和なし）が、周波数範囲に制限なし（複雑な）
周波数ジャンプ	1ジャンプ（1周波数ジャンプ）の包含またはそれ以上のジャンプ（混合）で、連続した周波数成分間の時間差なしで周波数（周波数は、他のジャンプ）や純音コール内の任意のノイズの多い部分なし
体系化されていません	全く純粋なトーン成分の識別可能なありません。 「騒々しい」コール

表1：マウスの超音波発声の5種類の特性マウスの超音波発声内の5つの異なるコールタイプを決定するために使用される持続時間、周波数範囲、周波数変調と周波数ジャンプの基準の例。

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、実験室でマウスの超音波発声を収集するための標準化と信頼性の高い方法を提供しています。これらの非常に制約の状況は、標準化の利点を提示します。彼らは株^18,19,26,27内の株または遺伝子型を比較するのに成功して使用されています。代表的な結果に示されるように、これらの方法はShank2のために突然変異したマウスでは非定型社会的コミュニケーション、自閉症スペクトラム障害に関連する遺伝子の同定を可能にします。異なるコンテキスト間で、あるいは研究所間のマウス系統間の比較は、mouseTubeデータベース上でより大きなデータセットの利用可能性によってトリガされます。このツールは、多変量解析を可能にすることにより、マウスの超音波発声の研究を後押しする必要があります。

それは遺伝Cをモデル化研究の大部分で行われているように、ここで記載されているプロトコルは、株内の異なる遺伝子型のマウスをテストするために最適化されています神経精神障害にontribution。実験的に可能な限り最高のコントロールを持つように各研究を設計することが推奨されます。確かに、ごみの影響は、マスクまたは人工的に遺伝的影響^28,29を膨らませる可能性があります。各遺伝子型のための同腹のコントロールを含めることが賢明です。それはゴミの中に変異マウスおよび対照マウスの正確なマッチングを可能にするため、繁殖ヘテロ接合の両親は、したがって、好まれるべきです。これは、2日ごとに録音を通じて個人を追跡するために、すべての仔（遺伝子型を知らされていない）のマーキングが足の入れ墨を正当化します。ジェノタイピングは、尾のサンプルを取ることによって、離乳で行われます。上のP2から子犬の分離呼び出しを記録する場合、この操作は補助的な操作と記録セッションに時間的に非常に近いストレスを含んでいるので、我々は、子犬にすでに尾のサンプルを採取することをお勧めしません。

成人の超音波発声を引き出すためにここで提案プロトコルは、EMIの明確な同定を可能にしません。発声のtter。我々は試験動物のモチベーションを操作する理由を説明します。実際、試験マウスは単離されているといない新しいコーナーと試験動物は同性間の相互作用の間に試験ケージに長い時間のために慣らします。男女の相互作用では、導入された女性は、単離されたものではなく、テスト男性は動機は、この性的な文脈で高くなる可能性がありますので、短い時間habituates。モチベーションのこれらの操作は、発声ではなく、導入された1つを放出試験マウスの確率を最大化する必要があります。性的な文脈での男性の超音波発声を記録するには、発情期の雌の新鮮な（ すなわち 、凍結していない）尿と単純な綿棒もケージ³⁰内に導入することができます。この方法は、100％確実にテスト男性に超音波発声の割り当てを可能にするが、それはこれらの発声の排出量の実際の社会的状況に関する特定の情報を収集しないようにします。したがって、我々はprotocoを好みますlは（自由に移動発情メスで）ここで説明します。我々はまた、変異株からマウスをテストするときに常に同じ株から導入されたマウスを使用し、発声マウスのペアとしてデータを分析することをお勧めします。一つの最近の研究では、エミッタ^31をローカライズするために三角測量の使用を推進しています。この研究では、女性も男性との遭遇時に超音波発声を放出することが見出されました。これは、記録セッションの前に少なくとも2週間のために単離されたという事実によって説明されるかもしれません。ビデオ録画が適切に同期される場合は、この研究で提案した三角測量の利用の一般化は、それにもかかわらず、ほとんどの場合、発声のエミッタの同定を可能にする必要があります。

開発中に記録された仔マウスからの単離・コールは、寝具からのバックグラウンドノイズによって妨害されていません。通常、自動分析が主な変数を抽出するために非常によく動作します。これとは対照的に、大人から記録された発声がdであります寝具に移動する動物からのバックグラウンドノイズによってisturbed。自動解析が失敗する可能性がありますので、手動分析を使用する必要があります。それにもかかわらず、試験ケージに寝具を追加すると（マウスは好きではないこと）裸地よりも動物にとってストレスの少ないな条件を提供する必要があります。コミュニティのさらなる努力があっても、バックグラウンドノイズを暗示しているものを、様々な条件下での超音波発声の自動検出を向上させることに集中しています。例えば、音声ソフトウェアを手動で背景雑音³²が存在しないために選択された発声を分析することを可能にします。このソフトウェアでは、音響変数の抽出は自動ですが、初期手動で選択する必要があります。

個体間変動が、マウスのボーカル動作において非常に重要であることに留意すべきです。例えば、発情期の雌の存在下で、成人男性のコールレートは非常に（ 図1）が配布されます。私たちのsu実験的コンテキストに関連する変動を制限するために、すでに超音波発声を引き出すために、これらの標準化されたプロトコルをggest。それにもかかわらず、我々はデータの平均値及びSEMないだけを提示することの重要性を指摘したいと思いますが、小さなサイズ³³のサンプルの中で最も重要なのは個々の点。代表的なデータを収集するために、各グループ/遺伝子型の少なくとも12個体を記録するために - そうでない場合は、必要な - それはまた、非常に関連性があります。多くの場合、個体間変動は、（通常はそれをすることはできません）隠されるべきではない、それは任意の非定型表現型を示す研究の遺伝的変異を保有するではなく、個人を識別するために非常に重要であるかもしれません。このような個体は、遺伝性疾患の治療のための新しい経路を開くことがあります補償、についての手がかりを提供することができます。

精神神経疾患、ボーカルの行動や社会的接触のためのマウスモデルのほとんどの行動の特徴付けで検討されていますエド離れて（ 例えば ^{、19,27,34,35）。}最近の分析方法は今（例えばMiceProfilerを使用して）相互作用^36、ならびにオーディオ録音からのデータと、この分析を組み合わせる可能性の間に社会的なイベントとイベントのシーケンスの半自動詳細な特徴づけを提供しています。この方法の主な利点は、より正確に社会的コミュニケーションの側面が影響を受けているかを識別するために、ASDのマウスモデルにおいて、社会的コミュニケーションの包括的なビューを提供することにあります。現在のプロトコルでは、同期はまだマニュアルですが、これはオーディオ録音ソフトウェアを介してビデオ録画をトリガすることによって改善することができます。分析のこのタイプは、精神神経疾患のマウスモデルにおけるソーシャルコミュニケーション障害のより包括的なビューを提供するための標準となるべきです。また、今までの、ボーカル信号は主にエミッタ側から分析している（ すなわち 、テストはVOの排出量を優先するように構築されていますテストしたマウスによるCAL信号は、本プロトコルのように）。焦点は、今も、より良いこれらの音響信号の機能を識別するために、これらの信号の受信機に設定する必要があります。これはまた、（例えばMiceProfilerを使用して）、成人に存在するプロトコルで新しいコーナーマウス³⁶の動作を評価することによって、再生実験^16を使用して、または新しいプロトコルを設定することによって行われるべきです。実際、本プロトコルは、マウスでの発声放射の正確な動物行動学の条件を反映していない可能性があり、非常に制約された状況を提供します。超音波発声の自然放出は、マウスの自発的なボーカルの行動に、より多くの光を当てるために連続的なオーディオおよびビデオ録画を使用して、より良い特徴づけする必要があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions