Запись мыши Ультразвуковые вокализации для оценки социальной коммуникации

Резюме

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Аннотация

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Введение

У пациентов с нервно - психических расстройств обычно отображают дефицита в социальной коммуникации (например, пациенты с расстройствами аутистического спектра, шизофрении или болезни Альцгеймера) ^1. Генно - инженерные мыши все чаще и чаще используются для моделирования генетических причин этих расстройств ^2. Изучение социальной коммуникации в этих мышиных моделях представляет большой интерес для понимания механизмов генетических мутаций, приводящих к атипичным социальных дисфункций и для тестирования новых методов лечения. Поскольку мыши являются социальными животными и общаться друг с другими, используя обонятельные, тактильные, визуальные и акустические сигналы, они являются подходящими моделями для оценки социальной коммуникации.

Mouse ультразвуковые вокализации в настоящее время в настоящее время используется в качестве прокси - сервера для моделирования генетических основ вокальной дефицитов связи ^3,4 (но существование вокального обучения у этого вида все еще ​​обсуждается ^5,6, даже если большинство недавних исследований arguе за отсутствие вокального обучения ^7). Лабораторных мышей были обнаружены испускать ультразвуковые вокализации в мать-ребенок отношений, в между мужчинами и женщинами социально-сексуального взаимодействия, однополые социальных взаимодействий (обзор в ссылке ⁸⁾ , а также в отношении несовершеннолетних, в отношении несовершеннолетних социальных взаимодействий ^9. Щенками мыши испускают вызовы изоляции в течение первых двух недель жизни , когда изолированы от плотины и однопометные ^10. Самцы испускают ультразвуковые вокализации , когда в присутствии течки самки (или мочеполовых киев от нее) ^11,12. Самцы и самки испускают ультразвуковые вокализации при взаимодействии с неизвестным конспецифичный того же пола ^13,14. Организация и функции этих вокализации не вполне ясны и требуют дальнейшего изучения. Современные знания о функциональном аспекте ограничена из-поисковых процессе индукции поведения у матерей слуха изоляции щенком вызовов, облегчение близости взрослых самок по отношению к взрослых мужчин vocalizatИоны ¹⁵ и повышенная исследовательское поведение взрослых самцов слуха взрослых самок вокализации ^16.

Характеризуя отклонения в вокальной коммуникации в мышиных моделях психоневрологических расстройств, должны проводиться в стандартных условиях, чтобы исключить значительный вклад экспериментальных условий. Такие характеризации, в сочетании с оценкой одновременных социальных взаимодействий и нейробиологических исследований, в различных генетических моделей должны улучшить наши знания о генетическом вкладе в различные аспекты мыши ультразвуковой связи. В течение длительного срока, он должен дать дополнительный свет на некоторых нейробиологических основах социальной коммуникации в организме человека. В настоящее время мы нацелены на предоставление простых протоколов, чтобы надежно выявить ультразвуковые вокализации в процессе развития и в зрелом возрасте как для самцов и самок мышей в лабораторных условиях. Такие протоколы должны облегчить стандартизацию записей более надежно сравнить UltrAsonic выбросы вокализация между штаммами и лабораторий. Это также должно способствовать создание таких записей в лабораториях, не имеющих опыта работы с мышью ультразвуковых вокализации записей. Мы также выделить текущую возможность объединить ультразвуковые данные вокализации с подробными поведенческими данными, собранными одновременно во время социальных взаимодействий у взрослых мышей, чтобы получить важную информацию о социальных нарушений, а также о контексте эмиссии ультразвуковых вокализации. Такой анализ позволит пролить новый свет на организацию и функции мыши ультразвуковых вокализации. Наконец, мы также рекламировать возможность обмениваться записями ультразвуковых вокализации со всем научным сообществом на базе mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Открытый доступ к записи данных аудио должны повысить знания о мыши ультразвуковой связи, позволяя ученым сравнить свои собственные данные с ультразвуковыми вокализации, записанные в других Laboratories (с одинаковыми или различными штаммами / протоколов), и / или оспаривать их методы анализа с файлами, записанными в различных условиях.

протокол

Заявление по этике: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Comite d'Ethique ан экспериментирования Animale (CETEA) п ° 89 в Институте Пастера в Париже.

1. Подготовка животных

1. Для записи вызовов изоляции щенком, получить беременных самок от штамма мыши интереса. Примечание: Порода гетерозиготных самцов и самок, чтобы получить по крайней мере 10 пометов, включая дикого типа, гетерозиготных и выбивание щенкам для получения надежных контрольных животных.
2. Получить две категории взрослых мышей для записи вокализации во время однополые взаимодействий.
   1. Получите по крайней мере 12 мужчин и 12 женщин каждого генотипа в качестве тест-мышей от штамма интерес (учитывать между индивидуальной изменчивости). Примечание: Этот протокол хорошо приспособлены для взрослых, но она может быть скорректирована к несовершеннолетним, с уменьшенным временем изоляции до эксперимента ^9. Этот тест работает для мужчин или женщин. Тем не менее, во избежание тестирования мужчинаs от линий мышей, которые показывают четкую агрессивную фенотип в тесте социального взаимодействия между мужчинами.
   2. Для того, чтобы максимизировать количество аффилиативные взаимодействий, изолировать тестируемых животных до экспериментов. Дом мужчины индивидуально в течение 3 недель (для уменьшения агрессивных взаимодействий до минимума ^14,17) и самок в течение 3 дней (E. Е.Ю., неопубликованные данные) , чтобы повысить уровень их социальной мотивации.
   3. Получение самцов или самок из штаммов представителя генетического фона тестируемого штамма , чтобы использовать их в качестве новоприбывших (например, как взаимодействующих мышей, см 3.1.3). Например, если мутантный штамм исследуемый сгенерирован на C57BL / 6J фоне, используют C57BL / 6J мышей, пришельцами. Подсчитайте число животных, необходимых таким образом, чтобы каждый из этих мышей не используется более чем в 2 раза в день в качестве Неё. Дом их в группы.
3. Получить две категории взрослых мышей мужского пола для записи вокализации в присутствии течки самки.
   1. Получить в лвосток 12 половозрелых самцов от каждого генотипа штамма интерес (учитывать между индивидуальной изменчивости). Примечание: Если мужчины никогда не имели опыта работы с женщинами и прежде, поместить их в отдельные клетки и оставить их провести одну ночь с женщиной два дня до того , как тест , чтобы повысить их мотивацию к испускают ультразвуковые вокализации ^6.
   2. Получение половозрелых самок от фонового штамма зарегистрированных самцов. Например, если мутантные самцы исследуемый были сгенерированы на C57BL / 6J фоне, используют C57BL / 6J самок. Подсчитайте число женщин необходимо для того, чтобы каждый из этих мышей не используется более чем в 3 раза в день. Дом их в группы.

2. Pup Изоляция вызовов

1. Прожектор Идентификация
   1. За три дня до предполагаемого дня рождения, изолировать беременных самок.
   2. Проверьте самок при рождении каждое утро и каждый вечер. Обратите внимание на день рождения, как P0.
   3. Определение щенкам в P1, используя продолжительную лапу татуировки (подкожной инъекции зеленой татуировки паста с 0,3 мм х 13 мм [30 G ½ "] игла). Создайте код с одним, двумя, тремя или четырьмя лапами, помеченных. Будьте как можно быстрее, чтобы минимально мешать щенкам, и положил их обратно в гнездо как можно скорее.
2. Настройка клетке Запись ПУП Изоляция вызовов.
   1. Используйте либо самодельный сурдокамеры (рис 1А) или простой пенопластовую коробку. Поместите термометр внутри коробки для контроля температуры для каждой записи. Убедитесь, что температура остается в пределах от 18 ° С до 22 ° С.
   2. Поместите микрофон в верхней части (через отверстие в верхней части окна). Отрегулируйте высоту микрофона так, что мембрана микрофона составляет 12-15 см выше нижней части окна, где щенок будет лежать. Подключите микрофон к звуковой карте, а также звуковую карту к компьютеру.
   3. Для регулировки усиления СОУй карты, провести пробную запись с щенком, который не будет использоваться в эксперименте. Поместите щенка в тех же условиях, как и в эксперименте (см 2.3.1). Закрой дверь. Отрегулируйте усиление на звуковой карте, так что она находится на максимальном значении (чтобы иметь самую высокую амплитуду возможного для вокализации), но без перегрузки (проверьте на живом дисплее спектрограммы на программное обеспечение для записи).
      Примечание: Несколько вызовов может быть перегружен, если амплитуда большинства вызовов сохраняется на самом высоком возможном уровне.
   4. Зарегистрируйте уровень усиления для каждого сеанса записи и не изменяют его между пометов щенков / / сеансов. Различия в уровнях усиления может привести к неточному обнаружению вызовов и акустических переменных мер с теми же пороговых значений в анализе с использованием автоматического обнаружения и измерения (см 5.1 до 5.4).

Рисунок 1: Настройка для записи изоляции звонков от мышат мыши и спектрограммы ультразвуковых вокализации (А) Пример самодельного звуконепроницаемой камере для записи звонков изоляции щенком.. (Б) спектрограмм различных типов вызовов , используемых в настоящем типа вызова классификации; смотрите описание в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Провести запись изоляции детенышей называет каждые два дня. Проведение записи по утрам для щенков, рожденных в ночное время, а во второй половине дня для щенков, рожденных в течение дня, чтобы избежать категоризацию в одних и тех же щенков класса возраста с половиной дня разница в возрасте. Это наиболее заметно для самых маленьких этапов P2 и P4.
   1. Возьмите одну щенка в помете. Поместите его, как быстро и аккуратно, насколько это возможно в полиэтиленовом реципиенту промывают этанолом 10% и сушили (диаметр: 9см; Высота: 10 см, чтобы предотвратить старые щенков от побега из района, охваченного микрофона). Помещенный получателю только под микрофон.
   2. Закройте окно, как быстро и бесшумно, как это возможно. Начните запись тюлененок ультразвуковых вокализации в программном обеспечении для записи (16-битный формат, кГц частота дискретизации 300 для захвата звука амплитудой до 150 кГц с высоким качеством).
   3. После того, как требуемое время записи истекло (до 5 мин), остановите запись. Возьмите щенка из коробки. Запишите лапу татуировки щенком.
   4. Возьмите температуру в подмышечной впадине детеныша с зондом-термометра. Марк щенку на спине с крошечной точкой с запахом менее ручкой (вода чернила), чтобы распознавать более легко уже записанные щенками в гнезде, когда выбирается следующий и избегать манипулирования всех щенков каждый раз, когда создается новый выбрали. Положите щенка обратно в гнездо.
   5. Мойте пластмассовую получателя и пластиковое покрытие его дно с 10% -ным этанолом и высушить его хорошоПеред вводом следующего щенка внутри.
   6. Выберите следующий щенка в помете и повторите 2.3.
4. Проверьте вес тела, координацию движений, отрицательные geotaxis и знаки развития (для деталей уменьшенного испытательной батареи смотрите разделы методов в Шмайссера и др. ¹⁸ и в Е- и др. ¹⁹⁾ после того, как период покоя 1 часа , чтобы дать щенкам, чтобы восстановиться после утомительного излучения ультразвуковых вокализации. Используйте другой когорте животных , если полный развития тест батареи , например, в Chadman и др. ²⁰ и Scattoni и др. ²¹ проводится.
5. Повторите эти записи каждые два дня между Р2 и Р12, чтобы охарактеризовать щенка вокальную поведение и развитие на протяжении первых двух недель жизни.

3. Ультразвуковая Вокализации во время Однополые социальных взаимодействий

1. вокализации Записи
   1. Подготовьте тестовую клетку (50 х 25 см х 30 грм ^3; Оргстекло, 100 люкс [низкой интенсивности белый свет]) очищается мыльной водой, сушат и заполнен 2 см свежего постельного белья в звуконепроницаемой камере.
      1. Поместите микрофон так, чтобы вокализации, вылетающие из всех углов клетки могут быть записаны. Закрепите микрофон в углу тестовой клетки (или на клетке или на штативе) и отрегулировать угол наклона микрофона дно клетки, чтобы покрыть всю поверхность Кейджа.
         Примечание: Ультразвук очень направлениях.
      2. Поместите видеокамеру на верхней части сурдокамере, чтобы захватить всю поверхность клетки для испытаний.
         Примечание: Убедитесь, что микрофон не скрывает угол испытательной клетки на видео.
      3. Перед тестированием регулировки усиления звуковой карты с запасным мужского и женского пола запасной, который не будет использоваться в эксперименте позже. Помещенный этих животных в тестируемой клетке в регистрирующей камере. Отрегулируйте уровень усиления на звуковой карте, чтобы максимально увеличить амплитуду регистрируемых вокализации бушельт к минимуму перегрузки, как показано на живом дисплее спектрограммы на программное обеспечение для записи.
         Примечание: Выигрыш зависит от расстояния между микрофоном и вокализации животных.
   2. Представьте животное быть испытанным (мужского или женского пола, она будет называться «оккупант») в испытательной клетке на свежее постельное белье. Оставьте его приучить к испытательному клетке в звуконепроницаемой камере в течение 20 мин, чтобы максимизировать свой интерес к неизвестному конспецифичный введенной в 3.1.3.
   3. По истечении этого времени привыкания, ввести 2 - ^е животное для взаимодействия (мужского или женского пола, того же пола , как водителя и пассажиров, но различные знаки уха / лапа татуировки , чтобы идентифицировать их позже, она будет называться «новый пришелец»).
      1. Начало записи ультразвуковые вокализации (16-битный формат, частота дискретизации 300 кГц для захвата звука амплитудой до 150 кГц с высоким качеством), а также видео, чтобы захватить введение нового Неё в испытательной клетке. Начало записи и-ltrasonic вокализации во время привыкания (отдельно) водителя и пассажиров, если сравнение между исходным уровнем выбросов вокализации во время исследования клетки и социального взаимодействия необходимо.
      2. Синхронизация вручную / визуально аудио- и видеозаписи, нажав на время часы ( "бип" звук у микрофона) точно, когда задние лапы Неё мыши касаться земли.
      3. Оставьте два животных взаимодействуют в течение желаемого времени (например, 4 мин, времени, достаточного для сбора достаточного количества ультразвуковых вокализации).
   4. Помещенный пассажиром и Неё обратно в их домашние клетки. Пустые использованные постельные принадлежности из испытательной клетки, промойте его мыльной водой и высушить бумажным полотенцем. Положите свежее постельное белье и поместить его обратно в звуконепроницаемой камере для следующего испытания.

4. Мужской Вокализации при взаимодействии с течки Женский

1. Рано утром на следующий день тестированиямужчины, возьмите влагалищные мазки из каждой самки, чтобы определить их половой статус в рамках цикла течки.
   1. Держите самку за хвост и поддерживать ее на клетку сетки. Используйте пипетку , чтобы промыть влагалище несколько раз с помощью 20 мкл PBS (то есть, впрыснуть и вспомнить те же 20 мкл PBS в несколько раз). Вспоминайте в 20 мкл PBS с тем же наконечником пипетки. Использование стерильных PBS, чтобы избежать какой-либо инфекции, если женщины должны быть проверены в течение нескольких дней подряд.
   2. Распространение PBS, содержащий суспензию вагинальных клеток на слайде. Поместите четыре образца на одном слайде (выявить лиц на стороне затвора с карандашом). Пусть слайды высохнуть перед проведением окрашивания.
   3. Продолжается работа по лаборатории вытяжкой.
      1. Приготовьте одну ванну из чистого мае-Грюнвальд, одну ванну из раствора фосфатного буфера (0,1 М) и одну ванну Гимза R (1/20 в фосфатном буферном растворе).
      2. Поместите слайды в ванну с чистой мае-Грюнвальд в течение 3 мин, а затемпромыть их в ванну с раствором фосфатного буфера в течение 1 мин и, наконец, перевести их в течение 10 мин в ванне Гимза R (1/20 в фосфатном буферном растворе).
      3. После этого промойте слайды снова в ванну с раствором фосфатного буфера в течение 10 сек и дайте им высохнуть.
   4. Изучите окрашенные слайды под микроскопом. Женщины, которые могут быть использованы в течение дня те, чьи образцы присутствуют только крупные ороговевшие эпителиальные клетки (без ядра, окрашенных в синий, полная течки).
2. Помещенный самцов в испытательной камере, по меньшей мере 30 мин перед тестированием их.
3. вокализации Записи
   1. Повторите 3.1 в случае необходимости.
   2. Представьте мужчину, подлежащий испытанию (на свежее постельное белье). Оставьте его привыкания к испытательной клетке в звуконепроницаемой камере в течение 10 мин.
   3. По истечении этого времени привыкания, ввести самку в период течки (среди них, выбранных из окрашивания).
      1. Начало записи ультразвуковых вокализации и видеозахватить введение самку в каждой испытательной клетке. Начало записи ультразвуковых вокализации во время привыкания (мужчины только), если сравнение между исходным уровнем выбросов вокализации во время исследования клетки и социального взаимодействия необходимо.
      2. Синхронизация вручную / визуально аудио- и видеозаписи, нажав на время часы ( "бип" звук у микрофона) точно, когда задние лапы самки мыши касаются земли.
      3. Оставьте два животных взаимодействуют в течение желаемого времени (например, 4 мин, времени, достаточного для сбора достаточного количества ультразвуковых вокализации).
   4. Помещенный мужчину и женщину обратно в их домашние клетки. Пустые использованные постельные принадлежности из испытательной клетки, промойте его мыльной водой и высушить бумажным полотенцем. Положите свежее постельное белье и поместить его обратно в звуконепроницаемой камере для следующего испытания.
      Примечание: оптимально использовать каждый течки женского пола только один раз каждый день (но при необходимости он можетможно использовать до 3-х раз в тот же день, но не подряд).

5. Переменные, чтобы быть извлечено

1. Подготовка звуковых файлов для анализа. Примечание: Приведенная ниже процедура является специфичным для ViSoft SASLab Pro и может меняться в зависимости от используемого программного обеспечения.
   1. Вырезать файлы таким образом, что они начинают именно в "БИП" того времени часов, и заканчивается после требуемой продолжительности (5 мин для щенков записей, 4 мин для взрослых записей).
   2. Фильтр из амплитуды при 30 кГц с использованием фильтра верхних частот (Edit> Фильтр> Фильтр FIR Time Domain; High Pass с частотой 30 кГц отрезана). Использование пакетной обработки для фильтрации всех файлов, представляющих интерес (Действия> Пакетная обработка> КИХ-фильтра).
   3. Определите каждый ультразвуковой вокализации, помечая их с программным обеспечением.
      1. Использование автоматического обнаружения для записей (тюлененок Tools> Наклейки> Создать раздел этикетки от формы волны событий). Отрегулируйте порог, время удержания и маржа пили наиболее точное обнаружение. Вручную проверить обнаружение и настроить ярлыки, если это необходимо (рекомендуется).
      2. Использование визуального обнаружения (ручной вставки меток) для взрослых записей с фонового шума (выберите вокализации, нажмите право, и вставьте раздел этикетку с маркером).
   4. Создание спектрограммы. Активировать автоматические измерения параметров (Инструменты> Автоматическое измерение параметров> Автоматическое измерение параметров Настройка).
   5. Установите флажок "Включить функцию автоматического измерения", то "Compute параметры из всей спектрограммы", и "Автоматическое обновление" коробки. Выберите "разделение элемент": в интерактивном режиме (раздел метки).
   6. Флажки для расчета требуемых временных параметров (длительность элемента, интервал, Start / время окончания) и параметров спектра на основе (пиковая частота), а также расположение измерений (начало элемента, Конец элемента, среднее, Макс, мин) ,
   7. Скопируйте измерения и вставьтем в таблице.
      Примечание: Для получения записей, проведенных со взрослыми, измерения параметров спектра на основе может оказаться невозможным из-за фонового шума. С помощью ручного измерения пиковой частоты, нажав на различных частотных значений непосредственно на спектрограммы и вставляя значения вручную в таблице.
2. Определить скорость вызова, то есть, количество звонков в минуту, сначала определяют количество вокализации , испускаемых (общее количество меток). Затем рассчитывают скорость вызова путем деления общего количества вокализации, записанных на продолжительность (в минутах) файла.
3. Определить временную организацию, то есть распределение временных интервалов между вызовами , чтобы определить организацию последовательности.
   1. Расчет интервалов времени между концом вокализации п и началом вокализации п + 1, используя старт / время окончания каждого ярлыка.
   2. Установить плотность распределения временных интервалов между UltrasonIC вокализации.
4. Определить репертуар вызова, то есть, определяют типы вызовов , присутствующие в записи. Используйте пример классификации , представленной в таблице 1 и на рисунке 1В.
   1. При маркировке каждой вокализации в 5.1.3, напишите название типа вызова на этикетке.
   2. Вычислить точное число и доля каждого типа вызовов для создания вокального репертуара.
5. Определить акустические характеристики для каждого вокализации, то есть, продолжительность пиковой частоты (т.е. частота с наибольшей амплитудой) в начале и в конце вызова, максимальный и минимальный пик частоты и среднее значение частоты , если автоматическое измерение возможно (Фиг.1В) ,
   1. Используйте функцию автоматического измерения параметров в программном обеспечении для измерения автоматически длительность, пиковые частотные характеристики (например, начало, конец, среднее, максимальное, минимальное) в тюлененок записей.
   2. Используйте длительность метки как продолжительность вокализации для взрослых записей. Мера вручную в окне спектрограммы частотные характеристики пиков (например, начало, конец, максимум, минимум).
6. Пара данные ультразвуковые вокализации и данные социального взаимодействия (MiceProfiler плагин от ICY платформы ^22).
   1. Убедитесь в том, чтобы синхронизировать как можно более точно аудио и видеозаписи, как описано в протоколе.
   2. Кодировать видео социального взаимодействия с помощью мышей Profiler Tracker плагин от ICY платформы , как описано в де Шомон и др. ^22. Начать отслеживание точно, когда задние лапы животного, введенного коснуться земли.
   3. Загрузить кодированный видео файл и его соответствующий файл XML (сгенерированный Mice Profiler Tracker) в мышиной Профили Video Label Maker плагин от ICY платформы , как описано в де Шомон и дри др. ^22.
      Примечание: Мыши Профили Video Label Maker плагин автоматически свяжет видеофайл и текстовый файл , созданный из анализа звукового файла , если они имеют одинаковые имена (см: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) ,
   4. После проверки, что масштаб мыши правильно, нажмите кнопку "Создать" USV статистику для каждого файла, чтобы получить число и доля вокализации, испускаемых при каждом социальном событии в виде отдельного файла.

6. Загрузка файлов в базе данных mouseTube

1. Убедитесь, что файлы находятся на сервере хранения данных, которые могут быть доступны из-за пределов учреждения.
   Примечание: Серверы, размещенные в некоторых учреждениях с высоким уровнем безопасности потребуется конкретную конфигурацию, чтобы быть доступными для людей, подключающихся из-за пределов учреждения.
2. Перейти на сайт mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Войти (используются для входа вй пароль приписываются каждому пользователю администратором).
3. Проверьте , существует ли штамм мыши записаны уже в базе данных mouseTube, нажав на кнопку "деформациях". Если нет, попросите администраторов, чтобы создать его.
4. Создание предметов с использованием «Субъекты> Создать" кнопку. Введите идентификационные коды животных, записанных. Собирают их в группы, чтобы облегчить последующего извлечения данных.
5. Введите описание протокола, используемого для записи ультразвуковых вокализации с использованием "Протоколы> Создать" кнопку.
6. Создание эксперимента для каждой записи сессии с использованием «Эксперименты> Создать" кнопку. Укажите протокол, группа лиц, которые были записаны, аппаратное и программное обеспечение, используемое и их конкретные особенности.
   Примечание: Эксперимент собирает все метаданные, соответствующие вокализации файлов.
7. Создать ссылку на вокализации файлы с помощью "Vocalisations> Создать & #34; Кнопка. Выберите эксперимент в списке. Скопируйте и вставьте URL файла вокализации (данная ссылка начинается с HTTP: // ...) в соответствующее поле "Файлы на ссылку" столбец. Проверка записи, нажав на кнопку "Создать связь между mouseTube и файлами".
   Примечание: Не требуется, чтобы заполнить каждую коробку для каждого файла, в то же время.
8. При необходимости изменить ссылки, введенные в любой момент, и добавить детали в разделе "Примечания". Не стесняйтесь писать заметки, чтобы дать более подробную информацию. Например, если ссылка к видео-файл, который был записан одновременно с аудиофайле был введен, это может быть указано в разделе "Примечания".

Результаты

С настоящими протоколами, мы охарактеризовали вокальную поведение мышей , лишенных ProSAP1 / Shank2, ген , связанный с расстройствами аутистического спектра (ASD) ^23-25. ASD характеризуются дефицитом в социальной коммуникации и стереотипных поведения ^1. Наши Shank2 ^{- / -} мыши отображается гиперактивность, повышенную тревожность и атипичную голосовое сообщение ^18,26. Действительно, мы отметили , что Shank2 ^{- / -} мышей проявляли нетипичную профиль развития в скорости их эмиссии изоляции щенком вызовов по сравнению с типичным перевернутой U-образной кривой в их однопометные дикого типа Shank2 ^{-. / -} Мышей проявляли повышенную скорость вызова при P4 и снижение скорости вызова при Р6 по сравнению с их однопометные дикого типа (рисунок 2). Мы также наблюдали снижение частоты вызова в женских взаимодействиях вовлечение Shank2 ^{- / -} женщина в comparisoп с взаимодействия с участием дикого типа однопометница (рисунок 2). Мы изучили репертуар 5 различных категорий вызовов. Оказалось , чтобы отличаться между щенками (например , здесь P2, Р6 и Р10) и взрослых (рисунок 3). Генотип связанные различия были существенны в основном в зрелом возрасте. В ходе социальных взаимодействий с участием взрослых Shank2 ^{- / -} мужчины или женщины с C57BL / 6N самки, более короткие звонки и неструктурированные звонки были записаны по сравнению с их взаимодействий с участием однопометными дикого типа (Рисунок 3D и Е). Менее сложные вызовы и частотные скачки вызовы также были записаны во время взаимодействия с C57BL / 6N женщина с участием взрослых Shank2 ^{- / -} самок по сравнению с взаимодействия с участием Shank2 ^{+ / +} самок (рис 3e). Наконец, мы также измеряли вручную акустические переменные. Там не было никаких существенных генотип связанных разница дюРазвитие кольца. В отличие от этого , длительность вызовов , записанных во время взаимодействия с участием взрослых Shank2 ^{- / -} самки были короче , чем тех , которые записаны во время взаимодействия с участием их однопометными дикого типа (рис 4а). Мы также отметили , что пик частоты ультразвуковых вокализации увеличилась в процессе развития крысят без существенной разницы ²⁶ генотипа связанных. В ходе взаимодействия с участием Shank2 ^{- / -} мужчины или женщины с C57BL / 6N самки, ультразвуковые вокализации был более низкий пиковой частоты по сравнению с вызовами , зарегистрированных в ходе взаимодействия с участием их однопометными дикого типа (рис 4В).

Кроме того, настоящий Протокол также позволил изучить контекст испускания ультразвуковых вокализации путем объединения данных из аудиозаписей с поведенческими данными , извлеченными из MiceProfiler (ICY программного обеспечения, Институт Pastевро, Париж). Например, у самок-женского взаимодействия, большинство ультразвуковых вокализации были выброшены, когда животные находились в контакте и более конкретно пассажиром нюхают-генитальный АНО региона Неё, либо, по крайней мере жилец быть за Неё. Мыши также выделяется много ультразвуковых вокализации , когда пассажир подошел к Неё (рисунок 5, верхняя панель). Менее вокализации были зарегистрированы , когда пассажир Shank2 ^{- / -} мышей были в физическом контакте с Неё (например, нюхают-генитальный АНО область Неё) , чем когда пассажир был дикого типа мыши. Менее вокализации были вызваны , когда жилец за Неё был Shank2 ^{- / -} мыши , чем когда он был дикого типа мыши. Больше вокализации были также зарегистрированы , когда новый пришелец был в поле зрения водителя и пассажиров мыши, и тем более в дикого типов , чем у мутантов (рис 5, нижняя панель).

s = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-странице = "1">
Рис . 2: скорость эмиссии ультразвуковых вокализации во время развития и у взрослых самцов и самок Shank2 ^{- / -} мышей и однопометные дикого типа скорость мышат Позвоните (каждые два дня от P2 до P12, п = 18-19 Shank2 ^{+ / +,} п = 15-16 Shank2 ^{- / -)} и взрослых во время мужской течки самок взаимодействий (п = 15 Shank2 ^{+ / +,} п = 16 Shank2 ^{- / -)} , так и женщины женские взаимодействия (п = 15 Shank2 ^{+ / +,} п = 13 Shank2 ^{- / -)} у мышей дикого типа (левая панель) и Shank2 ^{- / -} мыши (правая панель). Данные представлены как среднее +/- SEM и отдельные точки (непарность Вилкоксона тесты: * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001).ge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: Вокальный репертуар Shank2 ^{- / -} мышей и Однопометники дикого типа Пропорции из пяти различных типов вызовов , испускаемых P2 мышат (А; п = 20 Shank2 ^{+ / +,} п = 18 Shank2 ^{- / -),} Р6 щенками (в; п = 19 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -),} щенками P10 (C, N = 20 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -),} взрослые самцы с течки самки (D ; п = 16 Shank2 ^{+ / +,} N = 16 Shank2 ^{- / -)} и у взрослых самок с другой самкой (E, N = 15 Shank2 ^{+ / +,} п = 13 Shank2 ^{- / -)} у мышей дикого типа (слева панели) и Shank2 ^{- / -} мыши (правая панели). Данные представлены как среднее +/- SEM и отдельные точки (хи-квадрат тесты: * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 4: Акустические переменные , извлеченные из ультразвуковых вокализации в Shank2 ^{- / -} мышей и Однопометники дикого типа (А) Продолжительность всех типов вызовов посрамлены , излучаемый P2 мышат (п = 20 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -} ), Р6 щенков (п = 19 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -),} P10 щенков (n = 20 Shank2 ^{+ / +} , п = 18 Shank2 ^{- / -),} взрослые самцы с течки самки (п = 16 Shank2 ^{+ / +,} п = 16 Shank2 ^{- / -)} и взрослые самки с другой женщиной (п = 15 Shank2 ^{+ / +,} п = 13 Shank2 ^{- / -)} у мышей дикого типа (левая панель) и Shank2 ^{- / -} мыши (правая панель). (В) Максимальная частота пика измеряется на всех типах вызовов посрамлены в P2 мышат, P6 мышат, P10 щенков, взрослых мужчин с течки самки и взрослой самки с другой женщиной (такой же Ns , как описано выше). Данные представлены как среднее +/- SEM и отдельные точки (непарность Вилкоксона тесты: * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Контекст. s эмиссии мыши ультразвуковой вокализации у самок-взрослых самок социальных взаимодействий Доля ультразвуковых вокализации , испускаемый парами с участием Shank2 ^{+ / +} с C57BL / 6N мыши (п = 16, А) и пар с участием Shank2 ^{- / -} с C57BL / 6N мыши (п = 13, B) в течение следующих типов поведенческих событий (красный: водителя и пассажиров, зеленый: новый пришелец): социальные контакты, орально-оральный контакт, анально-генитальные фырканье от водителя и пассажиров мыши, ано- генитальный нюхают от Неё мыши, водителя и пассажиров за Неё, Неё за пассажиром, неподвижности пассажиром, неподвижность в Неё, подход со стороны водителя или пассажира и уйти от Неё, подход от Неё & уйти от водителя и пассажиров, захода на посадку и уйти от водителя и пассажиров, захода на посадку и уйти от Неё, жилец после нового встречному, Неё в поля зрения водителя или пассажира, водителя или пассажира в поле зрения Неё. Данные рвозмущались как среднее +/- SEM и отдельные точки (не парные тесты Вилкоксона: * р <0,05, ** р <0,01). Неопубликованные данные. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

типы вызовов	Описание
короткая	длительность ≤5 мс и диапазон частот ≤6.25 кГц
просто	длительность> 5 мс и диапазон частот ≤6.25 кГц (плоский), или частотная модуляция только в одном направлении (вверх или вниз) с частотой диапазона> 6,25 кГц
сложный	частота модуляций в более чем одном направлении и частотного диапазона> 6,25 кГц (прерывистый), или включение одного или нескольких дополнительных частот Component (гармонические или нелинейные явления, но не насыщения), но не ограничение на диапазон частот (комплекс)
частотные скачки	включение одного прыжка (одна частота скачка) или более скачков (частота прыжков, другие) частоты без временного промежутка между последовательными частотными компонентами, с (смешанный) или без шумной части в пределах чистого тона вызова
неструктурированных	нет чистого тона компонента идентифицируемым; "шумные" звонки

Таблица 1:. Характеристики пяти типов мыши ультразвуковых вокализации Примеры критериев длительности, частотный диапазон, частотные модуляции и частотных скачков , используемых для определения 5 различных типов вызовов внутри мыши ультразвуковых вокализации.

Обсуждение

Протокол, представленные здесь обеспечивает стандартизированные и надежные способы сбора мыши ультразвуковой вокализации в лаборатории. Эти очень стесненные ситуации представляют преимущество стандартизации. Они с успехом используются для сравнения штаммов или генотипов в пределах штаммов ^18,19,26,27. Как представлено в представительных результатов, эти методы позволяют идентифицировать атипичной социальной коммуникации у мышей мутировали для Shank2, ген , связанный с расстройствами аутистического спектра. Сравнения между штаммами мыши, между различными контекстами или даже между лабораториями будет вызвана наличием больших массивов данных в базе данных mouseTube. Этот инструмент должен стимулировать исследования на мышах ультразвуковых вокализации, позволяя многофакторного анализа.

Описанные здесь протоколы оптимизированы для тестирования мышей разных генотипов в пределах штамма, как это делается в большинстве исследований моделирования генетической Contribution психоневрологических расстройств. Рекомендуется экспериментально разработать каждое исследование, чтобы иметь лучшие средства управления возможно. Действительно, эффекты помет может замаскировать или искусственно раздувать генетические эффекты ^28,29. Поэтому целесообразно включать элементы управления однопометница для каждого генотипа. Поэтому размножения гетерозиготные родители должны отдавать предпочтение, так как это позволит правильно сопрягать мутантных и контрольных мышей в пределах помета. Это оправдывает лапу татуировку маркировки всех мышат (ослепленный генотипу) для отслеживания людей во время записи каждые два дня. Генотипирование делается при отъеме, взяв образцы хвоста. При записи вызовов изоляции щенком от P2, мы не рекомендуем брать образцы хвоста уже в щенками, так как эта операция включает в себя дополнительные манипуляции и стресс очень близко во времени сеанса записи.

Протоколы предлагаемых здесь, чтобы вызывать ультразвуковые вокализации у взрослых не позволяет четко идентифицировать ИРРолучатель из вокализации. Это объясняет, почему мы манипулируем мотивацию испытуемого животного. В самом деле, тест мыши изолированы и не новый пришелец и подопытных животных приучить в течение длительного времени на тест клетки во время одного пола взаимодействий. В между мужчинами и женщинами взаимодействий, введенная самка не изолирована и тест мужчины приучает за более короткое время, так как мотивация может быть выше в этом сексуальном контексте. Эти манипуляции мотивации должны максимизировать вероятность испытательной мыши, излучающего вокализации и не представил один. Для записи мужских ультразвуковых вокализации в сексуальном контексте, простой ватный тампон со свежим (т.е. не замороженного) мочи с течки самки также могут быть введены в клетке ^30. Этот метод позволяет назначение ультразвуковых вокализации в тест-мужчина с 100% уверенностью, но это не позволяет собирать какой-либо конкретной информации о фактическом социальном контексте эмиссии этих вокализации. Поэтому мы выступаем за Protocoл описано здесь (со свободно движущейся течки самки). Мы также рекомендуем всегда использовать введенную мышей из того же штамма при испытании мышей из мутантного штамма и анализировать данные в виде пары мышей вокализации. Одно недавнее исследование способствует использованию триангуляции локализовать излучатель ^31. В этом исследовании были обнаружены самки также испускают ультразвуковые вокализации во время встречи с мужчиной. Это можно объяснить тем фактом, что они были изолированы в течение, по крайней мере две недели до начала сеанса записи. Обобщение использования триангуляции предложенного в данном исследовании, следует тем не менее, позволяет идентифицировать эмиттером вокализации в большинстве случаев, если видеозаписи надлежащим образом синхронизированы.

Изолирующие звонки от мышат, записанных во время развития не нарушается фоновый шум от постельных принадлежностей. Обычно автоматический анализ работает очень хорошо, чтобы извлечь основные переменные. В противоположность этому, вокализации, записанные от взрослых гisturbed фоновым шумом от животных, движущихся в постельных принадлежностей. Автоматический анализ может потерпеть неудачу, и поэтому ручной анализ следует использовать. Тем не менее, добавив постельные принадлежности в испытательной клетке должны обеспечить условия, которые являются менее стрессовым для животных, чем голой почвы (что мыши не любят). Дальнейшие усилия в сообществе сосредоточены на совершенствовании автоматического обнаружения ультразвуковых вокализации в различных условиях, даже те, подразумевающих фоновые шумы. Например, программное обеспечение VOICE позволяет анализировать вокализации , которые были выбраны вручную для отсутствие фонового шума ^32. В этом программном обеспечении, извлечение акустических переменных происходит автоматически, но нуждается в начальный выбор вручную.

Следует отметить, что между индивидуальной изменчивости очень важна в вокальной поведении мышей. Например, частота вызовов взрослых самцов в присутствии течки самки очень распространен (рисунок 1). Мы суggest эти стандартизированные протоколы для выявления ультразвуковых вокализации уже ограничивает изменчивость, связанную с экспериментального контекста. Тем не менее, мы хотели бы отметить важность представления не только среднее значение и SEM для данных, но самое главное , отдельные точки в образцах малого размера ^33. Кроме того, весьма актуальна - если нет необходимости - для записи по меньшей мере 12 особей в каждой группе / генотипа собрать репрезентативные данные. Во многих случаях межиндивидуальную изменчивость не должна быть скрытой (как правило, это не может быть), и это может иметь большое значение для выявления лиц, несущих генетическую мутацию изученный, но не отображающие никакого атипичного фенотипа. Такие лица могут содержать сведения о компенсации, которые могли бы открыть новые пути для лечения генетических заболеваний.

В большинстве поведенческих характеристик моделей мыши для психоневрологических расстройств, вокального поведения и социальные контакты являются рассмотретьред друг от друга (например, ^{19,27,34,35).} Последние методы анализа в настоящее время обеспечивают полуавтоматическую подробную характеристику социальных событий и последовательностей событий во время взаимодействия ( с использованием MiceProfiler, например) ^36, а также возможность объединить этот анализ с данными из аудиозаписей. Основным преимуществом этого метода является то, чтобы обеспечить полное представление о социальной коммуникации в мышиных моделях ASD, чтобы более точно определить, какие аспекты социальной коммуникации затронуты. В настоящем протоколе синхронизация по-прежнему ручной, но это может быть улучшено путем активации записи видео с помощью программного обеспечения записи звука. Этот тип анализа должен стать стандартом, чтобы обеспечить более полное представление о дефицита социальной коммуникации в мышиных моделях нервно-психических расстройств. Кроме того, до сих пор, голосовые сигналы , которые в основном анализируются со стороны эмиттера (т.е. тесты построены в пользу выбросов VOческие сигналы по тестируемой мыши, как в настоящих протоколов). Основное внимание следует также теперь быть установлен на приемнике этих сигналов, чтобы лучше определить функции этих акустических сигналов. Это должно быть сделано путем оценки и поведение Неё мышей в настоящих протоколов у взрослых ( с использованием MiceProfiler, например) ^36, с помощью экспериментов воспроизведения ^16, или путем создания новых протоколов. В самом деле, настоящие протоколы обеспечивают очень стесненных ситуации, которые могут не отражать точные этологическим условия эмиссии вокализации у мышей. Спонтанное излучение ультразвуковых вокализации должны быть лучше характеризуется использованием непрерывных аудио- и видеозаписи, чтобы пролить больше света на спонтанную вокального поведения мышей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions