마우스 초음파 발성을 녹화 사회 커뮤니케이션을 평가하는

요약

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

초록

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

서문

신경 정신 장애 환자는 일반적으로 사회적 의사 소통의 적자를 표시합니다 (예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애, 정신 분열증, 또는 알츠하이머 질환 환자) ^1. 유전자 변형 마우스는 더 빈번하게 설계되어 이들 ^두 질환의 유전 적 원인을 모델링하는데 사용. 이 마우스 모델에서 사회적 커뮤니케이션을 공부하는 것은 전형적인 사회적 기능 장애로 이어지는 유전 적 돌연변이의 메커니즘을 이해하기위한 새로운 치료법을 테스트하기 위해 높은 관심이다. 마우스는 사회적 동물이며, 후각, 촉각, 시각 및 음향 신호를 사용하여 각 다른 사람들과 의사 소통을하기 때문에, 사회적 의사 소통을 평가하기에 적합한 모델입니다.

마우스의 초음파 발성 지금 현재 가장 최근의 연구는 argu 경우에도 음성 통신 적자 ^3,4 (하지만 여전히 ^5,6 논의되는이 종 보컬 학습의 존재의 유전 적 기초를 모델링하기위한 프록시로 사용보컬 학습 ^7)의 부재에 대한 전자. 실험실 마우스 (참조 검토 ⁸⁾ 동성 사회적 상호 작용에서, 남성 - 여성의 사회 - 성적 상호 작용, 어머니 - 유아 관계에서 초음파 발성을 방출하는 것으로 밝혀졌다 청소년 - 청소년의 사회적 상호 작용 ^9인치 댐과 한배 새끼 ^{(10)로부터} 분리 할 때 마우스 새끼는 삶의 처음 두 주 동안 격리 통화를 방출한다. 남성은 때 ^{11, 12} (그녀의 나 소변 큐)는 발정 여성의 존재에 초음파 발성을 방출한다. 동성 ^{(13, 14)의} 알 수없는 conspecific와 상호 작용할 때 남성과 여성은 초음파 발성을 방출한다. 조직 이러한 발성의 기능이 완전히 명확하지 않다 추가 조사가 필요합니다. 기능 측면에서 현재의 지식은 강아지 격리 전화, 성인 남성 vocalizat 방향으로 성인 여성의 근접의 촉진을 듣고 어머니의 검색 행동의 추출로 제한됩니다이온 ^(15)와 성인 여성 발성 ^(16)를 듣고 성인 남성의 증가 탐색 적 행동.

신경 정신 질환의 마우스 모델에서 음성 통신에 이상을 특성화하는 실험 조건에 큰 기여를 배제하기 위해 표준화 된 조건에서 수행되어야한다. 동시에 사회적 상호 작용 및 다양한 유전자 모델에서 신경 생물학적 연구의 평가와 함께 이러한 특성화는 마우스 초음파 통신의 다양한 측면에 대한 유전 적 기여에 대한 우리의 지식을 개선해야한다. 장기간에 걸쳐, 그것은 인간의 사회적 의사 소통의 일부 신경 생물학적 기초에 더 빛을 제공해야합니다. 우리는 현재 안정적으로 개발 과정 및 실험실에서 두 남성과 여성의 마우스에 대한 성인에서 초음파 발성을 유도하는 간단한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로하고 있습니다. 이러한 프로토콜은보다 확실하게 ultr을 비교하는 기록의 표준화를 완화한다균주 및 연구소 간의 asonic 발성 배출. 또한 마우스의 초음파 발성 녹음에 대한 사전 경험이없는 실험실에서 같은 기록의 설정까지를 용이하게한다. 또한 사회적 장애뿐 아니라 초음파 발성의 발광의 상황에 중요한 정보를 얻을 수 성인 마우스 사회적 상호 작용 동안 동시에 수집 상세한 행동 데이터와 초음파 발성 데이터를 결합하는 전류 가능성을 강조. 이러한 분석은 조직과 마우스의 초음파 발성의 기능을 새롭게 조명한다. 마지막으로, 우리는 또한 mouseTube 데이터베이스 (http://mousetube.pasteur.fr)에 전체 과학계와 초음파 발성 기록을 공유 할 수있는 가능성을 광고한다. 오디오 데이터를 기록하는 오픈 액세스 과학자 다른 라보 기록 초음파 발성으로 자신의 데이터를 비교할 수 있도록함으로써 마우스 초음파 커뮤니케이션 기술을 향상한다(유사하거나 상이한 균주 / 프로토콜) ratories, 및 / 또는 다른 조건에서 기록 된 파일을 자신의 분석 방법에 도전합니다.

프로토콜

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 파스퇴르 연구소, 파리에서 Comité 디부 Ethique 실내 실험 ANIMALE (CETEA) N ° 89에 의해 승인되었습니다.

1. 동물 준비

1. , 강아지 격리 통화를 녹음 관심 마우스 변형에서 임신 한 여성을 구하십시오. 참고 : 이형 남성과 여성은 야생형을 포함하여 최소 10 새끼를 얻기 위해 이형 품종 및 녹아웃 새끼를 강력한 제어 동물을 얻었다.
2. 동성 상호 작용하는 동안 발성을 기록하는 성인 마우스의 두 가지 범주를 얻습니다.
   1. 최소 12 명의 남성 또는 관심의 변형에서 테스트 마우스 각 유전자형의 12 여성을 구하는 (계정 간 개별 변동을 고려하기 위해). 이 프로토콜은 성인 잘 구성되어 있지만, 실험 ⁹ 전에 감소 분리 시간, 청소년으로 조절 될 수 있습니다. 이 테스트는 남성 또는 여성 작동합니다. 그러나, 테스트 남성을 피하기남성 - 남성의 사회적 상호 작용 시험에서 명확한 적극적인 표현형을 표시 마우스 계통에서의.
   2. affiliative 상호 작용의 양을 최대화하기 위해, 실험 전에 실험 동물을 격리. 집은 사회적 의욕을 높이기 위해 3 일간 삼주 (최소 ^14,17에 적극적인 상호 작용을 줄이기 위해)과 여성 (E. 어이, 게시되지 않은 데이터)에 대해 개별적으로 수컷.
   3. (3.1.3 참조, 상호 작용하는 마우스로, 예를 들어) 새로운 코너로 사용할 수있는 시험 균주의 유전 적 배경의 균주 대표에서 남성 또는 여성을 얻습니다. 연구되고 돌연변이 균주가 C57BL / 6J 배경에 생성 된 경우 예를 들어, 새로운 코너로 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다. 이 마우스는 각각 새로운 코너로 2 회 이상 하루 사용하지 않도록 필요한 동물의 수를 계산한다. 그룹에서 그들을 집.
3. 발정 여성의 존재에 남성 발성을 기록하는 성인 마우스의 두 가지 범주를 얻습니다.
   1. 리터에서 얻관심있는 균주의 각 유전자형에서 동쪽으로 12 성적으로 성숙한 남성 (계정 간 개별 변동을 고려하기 위해). 참고 : 남성 전에 여성과 경험하지 않은 경우 검사가 초음파 발성 ^(6)을 방출하는 그들의 의욕을 높이기 위해 전에, 개별 케이지에 넣어 그들을 여성 이일과 하룻밤을 보내고 둡니다.
   2. 기록 된 남성의 배경 변형에서 성적으로 성숙한 여성을 얻습니다. 돌연변이 남성이 C57BL / 6J 배경에 생성 된 연구되고있는 경우 예를 들어, C57BL / 6J 암컷을 사용합니다. 이 마우스는 각각 3 회 이상 하루 사용하지 않도록 필요한 암컷의 수를 계산한다. 그룹에서 그들을 집.

2. 강아지 격리 전화

1. 강아지 식별
   1. 사흘 출생의 예측 일 전에 임신 한 여성을 격리 할 것.
   2. 출생의 여성 매일 아침 매일 저녁을 확인합니다. P0과 같은 출생의 일을합니다.
   3. (0.3 mm X 13mm [30 G ½ "] 바늘로 붙여 넣기 녹색 문신의 피하 주사) 오래 지속 발 문신을 사용하여 P1에서 새끼를 식별합니다. 표시 1, 2, 3 또는 4 개의 발을 가진 코드를 만듭니다.로한다 빠른 가능한, 최소한 새끼를 방해하고, 가능한 한 빨리 둥지에서 그들을 다시 넣어.
2. 기록 강아지 격리 전화에 케이지를 설정합니다.
   1. 자체 제작 방음 실 (그림 1A) 또는 간단한 스티로폼 상자를 사용합니다. 각 기록의 온도를 모니터링하기 위해 상자 안에 온도계를 놓습니다. 온도가 18 ° C, 22 ° C 사이에 남아 있는지 확인합니다.
   2. (박스의 상단에 구멍을 통해) 상단에 마이크를 배치합니다. 마이크의 멤브레인은 강아지 누울 것이다 상자의 바닥 위 12~15cm이되도록 마이크로폰의 높이를 조정한다. 사운드 카드에 마이크와 컴퓨터 사운드 카드를 연결합니다.
   3. 우의 이득을 조정하려면차 카드, 실험에 적용하지 않습니다 강아지와 함께 기록 시험을 실시하고 있습니다. 실험 (2.3.1 참조)와 동일한 조건에서 강아지 넣는다. 문을 닫다. 이 최대 값이되도록하지만 과부하없이 (레코딩 소프트웨어의 실시간 스펙트로 그램 디스플레이에 확인)합니다 (발성 가능한 가장 높은 진폭을 가지고), 사운드 카드의 이득을 조정합니다.
      참고 : 통화의 대부분의 진폭이 가능한 가장 높은 수준으로 유지되는 경우 몇 통화가 과부하 될 수 있습니다.
   4. 각 레코딩 세션에 대한 게인 레벨을 등록하고 강아지 / 리터 / 세션 사이를 변경하지 마십시오. 게인 레벨의 변화는 부정확 한 통화 감지 및 자동 감지 및 측정 (5.4-5.1 참조)를 사용하여 분석에서 동일한 임계 값 음향 변수 조치로 이어질 것입니다.

그림 1 : 분리를 기록하는 설정은 마우스 새끼와 초음파 발성의 스펙트로 그램에서 호출 강아지 분리 호출을 기록하는 자기 - 방음 실 (A) 예.. 본 호출 유형 분류에 사용되는 상이한 호출 유형 (B) 스펙트로; 표에 대한 설명을 참조 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 강아지 분리의 기록은 이틀마다 호출을 실시한다. 밤에 태어난 새끼를 위해 아침에 녹음을 실시하고 나이 차이의 반나절와 같은 나이 클래스 새끼의 범주화을 방지하기 위해 하루 동안 태어난 새끼의 오후입니다. 이것은 아주 어린 단계의 P2와 P4에 가장 눈에 띈다.
   1. 쓰레기에서 한 강아지를 가져 가라. 10 % 에탄올로 세척하고 (직경 건조 플라스틱받는 사람에 신속하고 부드럽게 가능한 배치 : 9센티미터; 높이 : 10cm 마이크에 의해 커버되는 영역)에서 탈출 나이가 새끼를 방지하기 위해. 그냥 마이크에서받는 사람을 넣어.
   2. 빨리 조용히 가능한 한 상자를 닫습니다. 기록 소프트웨어 강아지 초음파 발성의 기록을 시작 (16 비트 포맷이 300 kHz의 샘플링 주파수는 고품질 150 kHz까지 사운드 진폭 캡처).
   3. 기록에 필요한 시간 (5 분까지)이 경과 한 후, 기록을 중지. 상자 밖으로 강아지를 가져 가라. 강아지의 발 문신을 기록합니다.
   4. 프로브 - 온도계와 강아지의 겨드랑이 온도를 가져 가라. 마크보다 쉽게​​ 냄새없는 펜 (물 잉크), 인식과 작은 점과의 뒷면에있는 강아지 다음 하나가 선택되고 새로운 하나가 될 때마다 모든 새끼를 조작 방지하기 위해 둥지에 이미 기록 된 새끼 선택된. 둥지에있는 강아지를 다시 넣습니다.
   5. 플라스틱받는 사람과 10 % 에탄올로 바닥을 덮고있는 플라스틱을 세척하고 잘 건조내부의 다음 강아지를 놓기 전에.
   6. 쓰레기의 다음 강아지를 선택하고 2.3를 반복합니다.
4. 수 있도록 1 시간의 휴식 기간 후에 (등. ¹⁹ 어이 Schmeisser 외. ^(18)과의 방법 섹션을 참조하십시오 감소 된 시험 전지의 자세한 내용은) 체중, 모터 조정, 부정적인 geotaxis, 발달 마크를 확인하세요 새끼는 초음파 발성의 배기 방출 후 회복. 이러한 Chadman 등. ²⁰ Scattoni 등. ^{(21)에서와} 같이 완전한 발달 테스트 배터리가 실시되는 경우 동물의 또 다른 코호트를 사용합니다.
5. 삶의 2 주에 걸쳐 P2와 P12 사이 매 2 일 강아지 보컬 행동과 개발의 특성을하려면 다음 녹음을 반복합니다.

동성 섹스 사회 상호 작용하는 동안 3. 초음파 발성

1. 발성 녹음
   1. 테스트 케이지를 준비합니다 (50 X 25cm X 30 ℃m ^3; 플렉시 유리는 100 룩스 [낮은 강도 흰색 빛), 비누 물로 세척 건조 및 방음 실에서 2cm 신선한 침구 가득합니다.
      1. 케이지의 모든 구석에서 방출 발성 기록 할 수 있도록 마이크를 놓습니다. (중 삼각대 케이지 또는에서) 테스트 케이스의 모서리에있는 마이크를 수정하고 케이지의 전체 표면을 커버하는 각도 마이크 케이지 바닥을 조정합니다.
         주 : 초음파는 매우 방향이다.
      2. 테스트 케이스의 전면을 캡처 방음 챔버의 상부에 비디오 카메라를 놓는다.
         참고 : 마이크가 비디오에 시험 케이지 구석 숨어 있지 않은지 확인합니다.
      3. 테스트하기 전에, 예비 남성 이후 실험에 사용되지 않는 여분의 여자와 사운드 카드의 이득을 조정한다. 기록 챔버 내에서 테스트 장에 동물을 넣어. 기록 발성의 진폭을 최대화하도록 사운드 카드의 이득 레벨을 조정 BUt는 기록 소프트웨어에 실시간 스펙트로 디스플레이 된 바와 같이 과부하 최소화.
         주 : 이득 마이크와 가창 동물 사이의 거리에 의존한다.
   2. 동물을 소개합니다 (남성 또는 여성;는 "거주자"라고한다) 시험 할 신선한 침대에 시험 케이지를. 이 3.1.3 도입 미지 conspecific 대한 관심이 극대화 20 분간 방음 실에서 시험 케이지 길들 떠난다.
   3. 이 습관화 시간 후, 상호 작용을위한 2 ^{차 동물} 소개 (남성 또는 여성, 탑승자와 같은 성별,하지만 서로 다른 귀 마크 / 나중에 식별하기 위해 발 문신, 그것은 "새로운-활발"라고한다).
      1. 시험 케이지의 새로운 코너의 도입을 캡처하고, 비디오 (150 고품질 kHz까지 음향 진폭을 캡처하는 16 비트 형식, 300 kHz 샘플링 주파수) 초음파 발성 기록을 시작. U 자 기록 시작케이지 탐색 및 사회적 상호 작용 동안에 발성 방출 기준 레벨 사이의 비교가 필요한 경우 습관화 (단독 점유자) 동안 ltrasonic 발성.
      2. 시간 시계에 새로운 코너 마우스의 뒷발이 땅을 터치 정확히 (마이크 근처 "BIP"소리)을 눌러 수동 / 시각적으로 오디오 및 비디오 녹음을 동기화합니다.
      3. 두 동물 (예 : 4 분, 충분히 초음파 발성를 수집하기에 충분한 기간 동안) 원하는 시간에 대한 상호 작용을 둡니다.
   4. 각각의 홈 케이지에 다시 탑승자과 새로운 코너를 넣습니다. 테스트 케이지에서 사용 된 침대를 비우기 비누 물로 씻어 종이 타월로 건조. 신선한 침구를 넣고 다음 테스트에 대한 방음 실에 다시 배치합니다.

4. 남성 발성 발정 여성과의 상호 작용 중

1. 을 테스트 이른 아침에 하루수컷은 발정주기 내에서 자신의 성적 상태를 확인하기 위해 각 여성에서 질 얼룩을.
   1. 꼬리에 의해 여성을 잡고 케이지 그리드에 그녀를 유지한다. 20 μl의 PBS와 질 여러 번 씻어 피펫을 사용하여 (즉, 주입과 같은 20 μl의 PBS 여러 번 채취). 같은 피펫 팁으로 20 μl의 PBS를 회상. 여성은 여러 가지 일 연속 테스트 할 경우 모든 감염을 방지하기 위해 멸균 PBS를 사용합니다.
   2. 슬라이드의 질 세포의 현탁액을 함유하는 PBS를 확산. 하나의 슬라이드 (연필로 슬라이드 측면의 개인 식별)에 4 개의 샘플을 넣습니다. 슬라이드가 염색을 실시하기 전에 건조 시키십시오.
   3. 실험실 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다.
      1. 순수한 5 월 그룬 왈드 중 하나 목욕, 인산염 완충 용액 (0.1 M)과 김사 R의 일 목욕 (1/20 인산염 완충 용액에서) 중 하나 목욕을 준비합니다.
      2. 다음, 3 분 동안 순수 월 - 그룬 왈드의 욕조에 슬라이드를 넣어(인산염 완충 용액에 1/20을) 김사 R의 욕실에서 10 분 동안 전송할 마지막 1 분 동안 인산염 완충 용액의 목욕을 씻어합니다.
      3. 그 후, 10 초 동안 인산염 완충 용액의 욕조에 다시 슬라이드를 세척하고 건조 할 수 있습니다.
   4. 현미경 스테인드 슬라이드를 검사합니다. 하루 동안 사용할 수있는 여성은 (; 전체 발정 파란색으로 염색 핵없이) 그 샘플을 본 유일한 큰 각질화 된 상피 세포 것들이다.
2. 를 테스트하기 전에 분 최소 30 시험 방에 남성을 넣습니다.
3. 발성 녹음
   1. 필요한 경우 3.1를 반복합니다.
   2. (신선한 침대에) 테스트 할 수있는 남성을 소개합니다. 그를 10 분 동안 방음 실에서 시험 케이지 길들 떠난다.
   3. 이 습관화 시간 후, (염색에서 선택한 것들 중) 발정에 여성을 소개합니다.
      1. 초음파 발성과 비디오 녹화를 시작합니다테스트 케이지의 여성의 도입을 촬영합니다. (남성 만) 케이지 탐색 및 사회적 상호 작용 동안에 발성 방출 기준 레벨 사이의 비교가 필요한 경우 습관화 동안 초음파 발성 기록을 시작.
      2. 시간 시계 여성 마우스의 뒷발이 땅을 터치 정확히 (마이크 근처 "BIP"소리)을 눌러 수동 / 시각적으로 오디오 및 비디오 녹음을 동기화합니다.
      3. 두 동물 (예 : 4 분, 충분히 초음파 발성를 수집하기에 충분한 기간 동안) 원하는 시간에 대한 상호 작용을 둡니다.
   4. 각각의 홈 케이지에서 남성과 여성을 다시 넣습니다. 테스트 케이지에서 사용 된 침대를 비우기 비누 물로 씻어 종이 타월로 건조. 신선한 침구를 넣고 다음 테스트에 대한 방음 실에 다시 배치합니다.
      매일 각 발정 여성에게 한 번만 사용하는 것이 최적이다 (그러나 필요한 경우가 있습니다 참고 :같은 날 아니지만) 연속으로 3 회까지 사용.

5. 변수는 추출 할

1. 분석을 위해 오디오 파일을 준비합니다. 참고 : 아래의 절차는 프로 visoft SASLab에 특정한와 소프트웨어에 따라 변경 될 수 있습니다.
   1. 그들은 시간 시계의 "BIP"에 정확히 시작되도록 파일을 잘라 원하는 기간 (강아지 녹음 5 분, 성인 레코딩을위한 4 분) 후 종료.
   2. (30 kHz의 주파수를 갖는 하이 패스 차단 편집> 필터> 타임 도메인 FIR 필터)는 고역 통과 필터를 이용하여 30 kHz에서 아래의 진폭을 필터링. 관심 (작업> 일괄 처리> FIR 필터)의 모든 파일을 필터링하는 일괄 처리를 사용합니다.
   3. 소프트웨어로 레이블을 각 초음파 발성을 확인합니다.
      1. (파형 이벤트에서 섹션 라벨 만들기> 도구> 레이블) 강아지 녹음에 대한 자동 검색을 사용합니다. 임계 값을 조정 시간과 마진 F를 개최또는 가장 정확한 검출. 수동으로 탐지를 확인하고 필요한 (권장) 경우 레이블을 조정합니다.
      2. (즉, 발성을 선택하고 마우스 오른쪽을 클릭 한 마커에서 섹션 라벨을 삽입) 배경 잡음 성인 녹음 시각적 검출 (라벨의 수동 삽입)를 사용합니다.
   4. 스펙트로 그램을 만듭니다. 자동 파라미터 측정 (도구> 자동 매개 변수 측정> 자동 매개 변수 측정 설정)을 활성화합니다.
   5. 은 "사용 자동 측정"은 "전체 스펙트로 그램에서 계산 매개 변수"및 "자동 업데이트"확인란을 선택합니다. 대화 형 (섹션 라벨) : "요소 분리"를 선택합니다.
   6. 원하는 시간 매개 변수 및 스펙트럼 기반의 매개 변수 (피크 주파수) (요소, 간격, 시작 / 종료 시간의 기간), 그리고 측정 위치 (요소의 시작, 요소의 끝, 평균, 최대, 최소)을 계산하는 확인란을 선택 .
   7. 측정을 복사하여 붙여스프레드 시트에서 m.
      참고 : 성인과 함께 실시 녹화를 들어, 스펙트럼 기반의 매개 변수를 측정하기 때문에 배경 소음 불가능할 수도 있습니다. 스펙트로 그램에서 직접 서로 다른 주파수 값을 클릭하고 테이블에 수동으로 값을 붙여 피크 주파수의 수동 측정을 사용합니다.
2. 첫번째 방출 발성의 수 (라벨의 총 수)를 결정함으로써 통화, 즉 속도, 분당 통화의 수를 결정합니다. 그리고, 파일 (분) 지속 기간에 의해 기록 발성의 총 개수를 분할함으로써 통화 요금을 계산한다.
3. 즉 시간적 조직, 조직 시퀀스를 결정하는 호출 간의 시간 간격의 분포를 결정한다.
   1. 발성 n의 단부와 각각의 레이블의 시작 / 종료 시간을 이용하여 발성 된 N + 1의 시작 사이의 시간 간격을 계산한다.
   2. 울트라 손 사이의 시간 간격의 분포 밀도를 수립IC에서 발성.
4. 즉, 통화 레퍼토리를 결정 기록에 존재하는 호출 유형을 정의합니다. 표 1 및도 1b에 제시된 분류의 예를 사용합니다.
   1. 5.1.3 각 발성 라벨링되면, 라벨의 통화 유형 이름 물품.
   2. 정확한 수와 보컬 레퍼토리를 구축하기 위해 각 호 형태의 비율을 계산한다.
5. 자동 측정이 가능한 경우에는 각 발성, 즉, 기간, 피크 주파수의 음향 특성을 결정 (즉, 최대 진폭과 주파수) 시작과 호출 최대 및 최소 피크 주파수의 단부 및 주파수를 의미한다 (도 1B) .
   1. 자동 기간, 피크 주파수 특성을 측정하는 소프트웨어에서 자동 파라미터 측정 기능을 사용하여 녹화에 강아지 (예, 말, 평균, 최대, 최소 시작).
   2. 성인 녹음을위한 발성의 기간으로 라벨의 기간을 사용합니다. 스펙트로 그램의 피크 주파수 특성 (예를 들어, 시작, 끝, 최대, 최소) 창에서 직접 측정한다.
6. 커플 초음파 발성 데이터 및 사회적 상호 작용 데이터 (얼음 플랫폼 ^(22)에서 MiceProfiler 플러그인).
   1. 가능한 한 정확하게 오디오 및 프로토콜에 설명 된대로 비디오 녹화를 동기화해야합니다.
   2. 드 쇼몽 외. ^(22)에 기술 된 바와 같이 얼음 플랫폼 생쥐 프로파일 트래커 플러그인을 사용하여 사회적 상호 작용의 영상을 인코딩한다. 도입 된 동물의 뒷발이 땅을 터치하면 정확히 추적을 시작합니다.
   3. 드 쇼몽 등의 설명에 따라 ICY 플랫폼의 마우스 프로파일 비디오 라벨 메이커 플러그인에 (마우스 프로파일 추적기에 의해 생성) 인코딩 된 비디오 파일과 해당 XML 파일을 업로드알. ^22.
      참고 : 마우스 프로파일 비디오 라벨 메이커 플러그인은 자동으로 비디오 파일과 동일한 이름이있는 경우 오디오 파일의 분석에서 생성 된 텍스트 파일을 연결합니다 (참조 : http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
   4. 마우스 규모가 올바른지 확인한 후, 수와 분리 된 파일의 각 사회 이벤트 기간 동안 방출 발성의 비율을 얻기 위해 각 파일에 대한 "만들기 USV 통계"를 클릭합니다.

mouseTube 데이터베이스 6. 파일 업로드

1. 파일이 기관 외부에서 액세스 할 수있는 스토리지 서버에 있는지 확인합니다.
   참고 : 높은 보안 수준과 일부 기관에서 호스팅 서버가 기관 외부에서 연결 사람들이 액세스 할 수 있도록 특정 구성이 필요합니다.
2. mouseTube 웹 사이트 (http://mousetube.pasteur.fr)로 이동합니다. 로그인 (로그인차 암호)은 관리자가 각 사용자에 기인한다.
3. 이미 기록 된 마우스 변형은 "긴장"버튼을 클릭하여 mouseTube 데이터베이스에 존재하는지 여부를 확인합니다. 그렇지 않은 경우를 만들려면 관리자에게 문의하십시오.
4. 버튼을 "만들기> 주제의"를 사용하여 주제를 작성합니다. 기록 된 동물의 식별 코드를 입력한다. 데이터를 나중에 검색을 용이하게하기 위해 그룹을 수집합니다.
5. 버튼을 "> 프로토콜 만들기"를를 사용하는 초음파 발성을 기록하는 데 사용되는 프로토콜의 설명을 입력합니다.
6. 버튼을 "만들기> 실험의"를 사용하여 각 기록 세션에 대한 실험을 만듭니다. 프로토콜, 하드웨어 및 소프트웨어의 사용 및 특이성이 기록되어있는 개인들의 그룹을 지정.
   참고 실험 발성 파일에 대응하는 모든 메타 데이터를 수집.
7. 은 "Vocalisations를 사용하여 발성 파일에 대한 링크 만들기> 만들기 & #(34); 단추. 목록 내에서 실험을 선택합니다. 복사하여 발성 파일의 URL을 붙여 넣기 (이 링크에 http : //로 시작 ...)의 해당 필드에 열을 "파일을 링크하는 방법"을 참조하십시오. 버튼을 클릭하여 항목의 유효성을 검사 "mouseTube와 파일 간의 링크 만들기"를 참조하십시오.
   주 : 동시에 각 파일에 대한 각 상자를 채울 필요가 없다.
8. 필요한 경우, 어떤 순간에 입력 된 링크를 수정하고 "주의 사항"절에 내용을 추가합니다. 더 자세한 정보를 제공하기 위해 메모를 작성하는 것을 망설이지 말라. 오디오 파일을 동시에 기록 된 비디오 파일을 향한 링크가 입력되어있는 경우, 예를 들어, 이것은 "정보"에 지정 될 수있다.

결과

본 프로토콜로, 우리는 ProSAP1 / Shank2, 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) ^{23 ~ 25과} 관련된 유전자가없는 쥐의 보컬 동작을 특징으로한다. ASD는 사회적 의사 소통의 적자에 박힌 행동 ^(1)을 특징으로한다. 우리의 Shank2 ^{- / -} 마우스는 과잉 행동, 증가 불안과 비정형 음성 통신 ^{18, 26을} 표시. . 마우스가 야생형 한배 새끼에 전형적인 역 U 자형 곡선과 비교 강아지 분리 호출들의 방출 속도 비정형 발달 프로파일을 표시 Shank2 ^{- - / -} 실제로, 우리는 Shank2 주목 ^{/ -} 마우스는 증가 된 호 레이트를 표시 및 P4에서 그들의 야생형 한배 새끼 (도 2)와 비교 P6에 전화 요금을 감소시켰다. ^{- / -} compariso 여성 우리는 또한 Shank2을 포함하는 여성의 상호 작용의 감소 콜금리를 관찰N 야생형 한배 새끼 (도 2)를 포함하는 상호 작용. 우리는 5 개의 다른 통화 카테고리의 레퍼토리를 조사했다. 성인 (그림 3) (여기 예 P2, P6 및 P10에 대한) 새끼 사이의 서로 다른 것으로 나타났다. 유전자형 관련 차이는 주로 성인에서 유의 하였다. ^{- / -} 성인 Shank2과 관련된 사회적 상호 작용하는 동안 C57BL / 6N 여성과 남성 또는 여성을, 더 짧은 통화 및 구조화되지 않은 통화는 야생형 한배 새끼 (그림 3D 및 E)를 포함하는 상호 작용과 비교하여 기록 하였다. Shank2 ^{+ / +} 여성 (그림 3E)을 포함하는 상호 작용에 비해 여성 ^{- / -} 덜 복잡 통화 및 주파수는 통화가 성인 Shank2을 포함하는 C57BL / 6N 여성과의 상호 작용 동안 기록 된 이동합니다. 마지막으로, 우리는 수동 음향 변수를 측정 하였다. 유의 한 유전자형과 관련된 차이 뒤 없었다링 개발. 이와는 대조적으로, 성인 Shank2 관련된 상호 작용 동안 기록 호출의 기간 ^{- / -} 여성은 그들의 야생형 한배 새끼 (도 4a)를 포함하는 상호 작용 동안 기록에 비해 짧았다. 우리는 또한 초음파 발성의 피크 주파수가 중요한 유전자형과 관련된 차이 ^(26)없이 강아지의 개발 과정에서 증가 된 것을 강조했다. Shank2 관련된 상호 작용 중 ^{- / -} C57BL / 6N 여성과 남성 또는 여성은 초음파 발성 그들의 야생형 한배 새끼 (도 4b)를 포함하는 상호 작용 동안 기록 통화에 비해 낮은 피크 주파수를 가지고 있었다.

또한, 본 프로토콜은 MiceProfiler (ICY 소프트웨어 투트 과거로부터 추출 된 행동 데이터에 오디오 녹음으로부터 데이터를 조합하여 초음파 발성의 발광의 상황을 연구 허용EUR, 파리). 동물 접촉과 새로운 코너의 항문 - 성기 영역을 스니핑 더 구체적으로 탑승자에있을 때 예를 들어, 여성 - 여성의 상호 작용에 대부분의 초음파 발성이 방출되었다, 또는 적어도 탑승자는 새로운 활발 뒤에있는. 탑승자가 새로운 코너 (그림 5, 상단 패널)에 접근 할 때 마우스는 또한 많은 초음파 발성을 방출. ^{- / -} 마우스 탑승자가 야생형 마우스 때보다 (새로운-코너의 항문 - 성기 영역을 스니핑, 예를 들어) 새로운-활발와 물리적으로 접촉했다 탑승자의 Shank2 때 적은 발성을 기록했다. 이 야생형 마우스 때보다 마우스 ^{- / -} 새로운-활발 뒤에 탑승자가 Shank2을 때 적은 발성이 발생했다. 더 많은 발성도 새로운 코너가 탑승자 마우스의 시야에있을 때 기록 하였다 더욱 그렇다 돌연변이보다 야생 - 타입 (그림 5, 낮은 패널)이다.

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그림 2 :. 개발하는 동안 성인 남성과 여성의 Shank2 초음파 발성의 방출 속도 ^{- / -} 마우스와 야생형 한배 새끼 강아지의 속도에 전화 (이틀 P2에서 P12에, N = 18 ~ 19 Shank2 ^{+ / +,} N = 15 ~ 16 Shank2 ^{- / -} 남성 발정 여성의 상호 작용 중)과 성인 (N = 15 Shank2 ^{+ / +,} N = 16 Shank2 ^{- / -)과} 여성 - 여성의 상호 작용 (N = 15 Shank2 ^{+ / +,} N = 13 Shank2 ^{- / -)} 야생형 마우스 (왼쪽 패널) 및 Shank2에 ^{- / -} 마우스 (오른쪽 패널). 데이터는 같은 평균되게됩니다 +/- SEM 및 개별 포인트 (윌 콕슨이 테스트가 아닌 쌍 : * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).ge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3. Shank2 보컬 레퍼토리 ^{- / -} P2 새끼 의해 방출 된 다섯 가지 호출 유형의 마우스와 야생형 한배 새끼에 비율 (A; N = 20 Shank2 ^{+ / +} N = 18 Shank2 ^{- / -),} P6 새끼 (B, N = 19 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -),} P10 새끼 (C, N = 20 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -),} 발정 여성과 성인 남성 (D n은 = 16 Shank2 ^{+ / +,} N = 16 Shank2 ^{- / -} 다른 여성 (E)와 성인 여성, N = 15 Shank2 ^{+ / +,} N = 13 Shank2 ^{- / -)} 야생형 마우스 (왼쪽 패널)과 Shank2로 ^{- / -} 마우스 (오른쪽 패널). 데이터는 같은 평균되게됩니다 +/- SEM 및 개별 포인트 (카이 제곱 테스트 : * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 :. Shank2 초음파 발성에서 추출한 음향 변수 ^{- / -} 모든 호출 유형의 마우스와 야생형 한배 새끼 (A) 지속 시간 (N = P2 새끼 20 Shank2 ^{+ / +} N = 18 Shank2 방출 혼동 ^{- / -} ), P6 새끼 (N = 19 Shank2 ^{+ / +,} N = 18 Shank2 ^{- / -),} P10 새끼 (N = 20 Shank2 ^{+ / +} , N = 18 Shank2 ^{- / -),} 성인 발정 여성과 남성 (N = 16 Shank2 ^{+ / +,} N = 16 Shank2 ^{- / -} 다른 여성과) 및 성인 여성 (N = 15 Shank2 ^{+ / +,} N = 13 Shank2 ^- 야생형 생쥐) (왼쪽 패널) 및 Shank2 ^{- - / / -} 마우스 (오른쪽 패널). 모든 호출 유형에 측정 (B)의 최대 피크의 주파수가 다른 암 (동일한 NS 개의 위와)와 발정 여성 및 성인 여성으로 P2 새끼, 새끼 P6, P10 새끼, 성인 남성에서 혼동. 데이터는 같은 평균되게됩니다 +/- SEM 및 개별 포인트 (윌 콕슨이 테스트가 아닌 쌍 : * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : 컨텍스트. 참여 쌍에 의해 방출 된 초음파 발성의 여성 - 여성 성인 사회적 상호 작용에 마우스 초음파 발성의 방출의 비율 Shank2 ^{+ / +} A C57BL / 6N 마우스 (N = 16, A)을하고 Shank2를 포함하는 쌍 ^{- / -와} C57BL / 6N 마우스 (N = 13, B) 행동 이벤트 다음과 같은 유형의시 (적색 : 탑승자 : 녹색, 새로운 코너) : 사회 연락처, 오로 구강 접촉, 탑승자 마우스에서 항문 - 성기 스니핑, ano- 새로운-활발 마우스에서 스니핑 생식기는, 탑승자 및에서 새로운 활발, 탑승자 뒤에 새로운 코너, 탑승자의 부동, 새로운 코너의 부동, 접근 뒤에 탑승자가 새로운 코너에서, 새로운-코너에서 접근 탈출 & 탑승자 새로운 코너의 비전 분야에서 탑승자, 탑승자의 비전 필드에 새로운 코너, 새로운 활발 다음, 탑승자, 접근 방식에서 탈출 및 탑승자, 접근 방식에서 탈출 및 새로운-코너에서 탈출. 데이터 페이지입니다분개으로 평균 +/- SEM 및 개별 포인트 (비 쌍 윌 콕슨 시험 : * P <0.05, ** p <0.01). 게시되지 않은 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전화 유형	기술
짧은	시간 ≤5 밀리 주파수 범위 ≤6.25 kHz에서
단순한	주파수 범위> 6.25 kHz에서 함께 하나의 방향 (상향 또는 하향)의 길이> 5 밀리 주파수 범위 ≤6.25 kHz의 (평면) 또는 주파수 변조
복잡한	주파수 이상의 방향 및 주파수 범위> 6.25 kHz에서의 변조 방식 (변조), 또는 하나 이상의 추가 주파수 C를 포함creationComplete 컴퍼넌트 (고조파 또는 비선형 현상 있지만 채도)하지만 주파수 범위에 아무런 제약 (단지)
주파수 점프	와 연속 주파수 구성 요소 사이의 시간 간격없이 주파수의 한 점프 (하나의 주파수 점프) 이상 점프 (주파수 점프, 등)의 포함 (혼합) 또는 순수한 톤 호출 내의 잡음이 부분없이
구조화	더 순수 톤 구성 요소 식별 할 수 없다; "시끄러운"통화

표 1. 마우스 초음파 발성 다섯 종류의 특징 마우스 초음파 발성 내의 5 개의 다른 호출 유형을 결정하는 데 사용되는 지속 시간, 주파수 대역, 주파수 변조 및 주파수 점프 조건의 예.

토론

여기에 제시된 프로토콜은 실험실에서 마우스 초음파 발성를 수집하는 표준화하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이들은 매우 제한된 상황 표준화의 이점을 제시한다. 그들은 균주 ^18,19,26,27 내 균주 또는 유전자형을 비교하는 데 성공 사용된다. 대표 결과에서 제시된 바와 같이, 이러한 방법은 Shank2, 자폐증 스펙트럼 장애와 관련된 유전자 돌연변이 생쥐의 전형적인 사회적 의사 소통의 식별을 할 수 있습니다. 실험실 다른 컨텍스트 사이 또는 사이에 마우스 변종 사이의 비교는 mouseTube 데이터베이스에 더 큰 데이터 세트의 가용성에 의해 트리거됩니다. 이 도구는 다변량 분석을 허용하여 마우스의 초음파 발성에 대한 연구를 강화해야한다.

이 유전자 C 모델링 대부분의 연구에서 수행 된 바와 같이 여기에 설명 된 프로토콜은 변형 내의 다른 유전자형 생쥐를 테스트하기 위해 최적화신경 정신 질환에 ontribution. 이는 실험적으로 최상의 컨트롤이 각 연구를 설계하는 것이 좋습니다. 사실, 쓰레기 효과는 마스크 또는 인위적으로 유전 적 영향 ^{(28, 29)을} 팽창 수 있습니다. 각각의 유전자형에 대한 한배의 새끼 컨트롤을 포함하는 것이 바람직하다. 그것은 쓰레기에서 돌연변이 및 제어 마우스의 정확한 일치를 허용하기 때문에 사육 이형 부모는 따라서 선호한다. 이 매 2 일 녹음을 통해 개인을 추적하는 (유전자형에 눈을 멀게) 모든 강아지의 마킹 발 문신을 정당화. 유전자형은 꼬리 샘플을 채취하여 이유에서 이루어집니다. P2에서 강아지 격리 전화에 기록 할 때, 우리는이 작업이 추가 조작 및 녹음 세션에 시간에 아주 가까이 스트레스를 포함하기 때문에, 새끼 이미 꼬리 샘플을 채취 권하고 싶지 않다.

여기에 제안 된 프로토콜은 EMI의 명확한 식별을 허용하지 않는 성인에서 초음파 발성을 유도합니다발성의 라 자세 히. 우리가 실험 동물의 의욕을 조작하는 이유에 대해 설명합니다. 실제로 테스트 마우스 고립되어 아닌 새로운 코너 및 시험 동물 동성 상호 작용하는 동안 테스트 케이지에 오랫동안 길들. 암수 상호 작용에서, 도입 여성 격리되지 않고, 시험 남성 동기 성이 문맥에서 더 높을 수 있으므로 짧은 시간 habituates. 동기 이러한 조작은 발성되지 도입 한 발광 시험 마우스의 확률을 최대화한다. 성적인 맥락에서 남성 초음파 발성을 기록하기 위해, 발정 여성의 신선한 (즉, 냉동하지 않음) 소변으로 간단한 면봉도 케이지 ^(30)에 도입 될 수있다. 이 방법은 100 % 확실성 테스트 남성 초음파 발성의 할당을 허용하지만, 이들 발성 방출 실제 사회 상황에 대한 특정 정보를 수집하는 것을 방지한다. 따라서, 우리는 protoco를 선호난 (자유롭게 이동 발정 여성으로) 여기에 설명. 또한 변이주에서 쥐를 테스트 할 때 항상 동일한 균주로부터 도입 마우스를 사용하고, 음독 생쥐 한 쌍의 데이터를 분석하도록 추천한다. 최근의 연구는 이미 터 ^(31)를 지역화하는 삼각 측량의 사용을 촉진합니다. 이 연구에서, 여성은 남성과 만남 동안 초음파 발성을 방출하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 그들이 기록 세션 전에 적어도 2 주 동안 단리 하였다는 사실에 의해 설명 될 수있다. 비디오 녹화가 적절히 동기화되는 경우 본 연구에서 제안하는 삼각 측량의 사용의 일반화 그럼에도 불구하고 대부분의 경우에 발성의 이미 터의 식별을 허용한다.

개발하는 동안 기록 된 새끼에서 분리 호출은 침대에서 배경 잡음에 의해 방해되지 않습니다. 일반적으로 자동 분석의 주요 변수를 추출하는 것은 매우 잘 작동합니다. 반면, 성인에서 기록 발성은 D이다침구으로 이동하는 동물 배경 잡음에 의해 isturbed. 자동 분석이 실패 할 수 있으며, 따라서 수동 분석을 사용한다. 그럼에도 불구하고, 테스트 케이지에서 침구를 추가하면 (마우스가 마음에 들지 않는 것이) 맨 손으로 흙보다 동물에 대한 스트레스를 덜 수 있습니다 조건을 제공해야한다. 지역 사회에서 또한 노력은 다양한 조건 하에서도 그 의미 배경 소음을 초음파 발성의 자동 검출 개선에 집중되어있다. 예를 들어, 음성 소프트웨어를 수동으로 배경 소음 ^(32)의 부재 선택했다 발성을 분석 할 수 있습니다. 이 소프트웨어에서 음향 변수의 추출은 자동이지만 초기 수동 선택이 필요합니다.

이 개체 간 변이 생쥐의 음성 동작에 매우 중요하다는 것을 주목해야한다. 예를 들어, 여성의 발정 존재 성인 남성의 전화 속도가 매우 (도 1)에 분포한다. 우리 스와실험 문맥과 관련된 변화를 제한하기 위해 이미 초음파 발성을 유도하기 위해 이러한 표준 프로토콜 ggest. 그럼에도 불구하고, 우리는 무엇보다도 작은 사이즈 ^(33)의 샘플의 개별 점 데이터의 평균값과 SEM뿐만 제시의 중요성을 지적하고 싶지만 것이다. 대표 데이터를 수집하기 위해 각 그룹 / 유전자형의 적어도 12 개인을 기록 - 그렇지 않으면 필요한 - 또한 아주 적합하다. 많은 경우, 개체 간 변이 (보통가 될 수 없음) 숨겨되지 않아야하고, 개인 연구 된 돌연변이 유전자를 운반하지만 어떤 비정형 표현형을 표시하지 식별 높은 중요 할 수도있다. 이러한 개인은 유전 질환의 치료를위한 새로운 경로를 열 수있는 보상에 대한 단서를 제공 할 수 있습니다.

신경 장애, 보컬 행동과 사회 연락처에 대한 마우스 모델의 대부분의 행동 특성 분석에서 고려하다에드 간격 (예를 들어, ^{19,27,34,35).} 최근의 분석 방법은 이제 (예 MiceProfiler 사용) 상호 작용 ^(36)뿐만 아니라 오디오 레코딩의 데이터를이 분석을 결합하는 가능성 동안에 행사 및 이벤트 시퀀스 반자동 상세한 특성을 제공한다. 이 방법의 주요 이점은 더 정확하게 사회적 통신의 양태가 영향을 받는지를 식별하는 ASD의 마우스 모델에서 사회적 통신의 광범위한 관점을 제공하는 것이다. 본 프로토콜의 동기화가 여전히 수동이지만 이것은 음성 기록 소프트웨어를 통해 비디오 레코딩을 트리거링함으로써 개선 될 수있다. 분석이 종류의 신경 질환의 마우스 모델에서 사회적 통신 적자의보다 포괄적 인 뷰를 제공하는 표준이 될 것이다. 또한, 지금까지 대부분의 음성 신호는 이미 터 측으로부터 분석 (즉, 시험 VO의 방출을 선호 구축테스트 마우스에 의해 칼 신호, 본 프로토콜에서와 같이). 초점은 이제 더 이러한 음향 신호의 기능을 식별하기 위해,이 신호의 수신에 설정되어야한다. 이것은하거나 새로운 프로토콜을 설정하여 재생 ^실험을 이용하여 ^16도 (예 MiceProfiler 사용) 성인 본 프로토콜의 새로운 코너 마우스의 행동 ^(36)을 평가함으로써 수행한다. 실제로, 본 프로토콜은 마우스의 발성 방출의 정확한 ethological 조건을 반영하지 않을 수 있습니다 매우 제한된 상황을 제공한다. 초음파 발성의 자연 방출은 마우스의 자발적인 보컬 행동에 더 많은 빛을 흘렸다 지속적인 오디오 및 비디오 레코딩을 사용하여 더 나은 특성화해야합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions