Aufnahme Maus Ultraschall Vocalizations soziale Kommunikation zur Bewertung

Zusammenfassung

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Zusammenfassung

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Einleitung

Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zeigen in der Regel Defizite in der sozialen Kommunikation (zB Patienten mit Autismus - Spektrum - Störungen, Schizophrenie oder Alzheimer - Krankheit) ^1. Gentechnisch veränderte Mäuse mehr und häufiger verwendet , um genetische Ursachen dieser Erkrankungen ² modellieren. Das Studium der sozialen Kommunikation in diesen Mausmodellen ist von großem Interesse für die Mechanismen der genetischen Mutationen zu verstehen, zu atypischen sozialen Dysfunktionen führen und für neue Therapien zu testen. Da Mäuse sind soziale Tiere und die Kommunikation mit der jeweils anderen mit Geruchs-, Tast-, optische und akustische Signale, sie sind geeignete Modelle der sozialen Kommunikation zu bewerten.

Maus Ultraschall-vocalizations sind jetzt aktuell als Proxy verwendet für die Modellierung der genetischen Grundlagen der Sprachkommunikation Defizite ^3,4 (aber die Existenz der Spracherwerb in dieser Art noch ^5,6 diskutiert wird, auch wenn die meisten neueren Studien ARGUe für das Fehlen von Spracherwerb ^7). Labormäuse wurden Ultraschall vocalizations in Mutter-Kind - Beziehungen, in männlich-weiblichen sozio sexuellen Interaktionen zu emittieren gefunden, die in gleichgeschlechtlichen sozialen Interaktionen ( zusammengefasst in Bezug auf ⁸⁾ und in Jugend-Jugend sozialen Interaktionen ^9. Maus Welpen emittieren Isolation Anrufe während ihrer ersten beiden Lebenswochen , wenn sie von Damm und littermates isoliert ^10. Männer emittieren Ultraschall-Laute , wenn sie in Gegenwart einer Brunst weiblichen (oder Harn-Signale von ihr) ^11,12. Männchen und Weibchen emittieren Ultraschall-Stimmgebung , wenn sie mit einem unbekannten Artgenossen des gleichen Geschlechts ^13,14 interagieren. Die Organisation und die Funktionen dieser vocalizations sind nicht ganz klar und brauchen weitere Untersuchungen. Das derzeitige Wissen über die funktionalen Aspekt wird in Mütter hören pup Isolation Anrufe, die Erleichterung der Nähe von erwachsenen Weibchen zu erwachsenen männlichen vocalizat zum Hervorrufen des Abrufs Verhalten begrenztIonen ¹⁵ und die erhöhte Explorationsverhalten von erwachsenen Männern zu hören erwachsenen weiblichen vocalizations ^16.

Charakterisierung der Anomalien in Sprachkommunikation in Mausmodellen von neuropsychiatrischen Erkrankungen sollten unter standardisierten Bedingungen durchgeführt werden, wichtigen Beitrag der experimentellen Bedingungen auszuschließen. Eine solche Charakterisierungen, mit der Bewertung der gleichzeitigen sozialen Interaktionen und neurobiologische Studien kombiniert, in verschiedenen genetischen Modelle sollten unser Wissen über die genetischen Beitrag zu den verschiedenen Aspekten der Maus Ultraschall-Kommunikation zu verbessern. Über eine lange Sicht sollte sie weiter Licht geben auf einige neurobiologischen Grundlagen der sozialen Kommunikation in den Menschen. Unser Ziel ist derzeit auf einfache Protokolle Bereitstellung zuverlässiger Ultraschall vocalizations während der Entwicklung auslösen und im Erwachsenenalter für männliche und weibliche Mäuse im Labor. Solche Protokolle sollten die Standardisierung von Aufnahmen erleichtern ultr noch zuverlässiger vergleichenAsonic Stimmgebung Emissionen zwischen Stämmen und Labors. Es sollte auch die Einrichtung solcher Aufnahmen im Labor erleichtern keine vorherige Erfahrung mit der Maus Ultraschall vocalizations Aufnahmen mit. Wir heben auch die aktuelle Möglichkeit Ultraschall vocalizations Daten zu kombinieren mit detaillierten Verhaltensdaten gleichzeitig in erwachsenen Mäusen während der sozialen Interaktionen gesammelt, entscheidende Informationen über sozialen Beeinträchtigungen zu erhalten sowie über den Kontext der Emission von Ultraschall vocalizations. Solche Analysen werden ein neues Licht auf die Organisation und die Funktionen der Maus Ultraschall vocalizations vergießen. Schließlich werben wir auch die Möglichkeit , mit der ganzen wissenschaftlichen Gemeinschaft auf der mouseTube Datenbank Ultraschall-Stimmgebung Aufnahmen zu teilen (http://mousetube.pasteur.fr). Offener Zugang zu Audio-Aufzeichnung von Daten sollten Kenntnisse über Maus Ultraschallkommunikation steigern, indem die Wissenschaftler ihre eigenen Daten mit Ultraschall-Laute in anderen Labo aufgezeichnet zu vergleichenrien (mit ähnlichen oder unterschiedlichen Stämmen / Protokolle), und / oder deren Analysemethoden herauszufordern Dateien mit unter verschiedenen Bedingungen aufgezeichnet.

Protokoll

Ethik-Anweisung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden vom Comité genehmigt d'Ethique en Expérimentation animale (Cetea) n ° 89 am Institut Pasteur in Paris.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Zur Aufzeichnung pup Isolation Anrufe erhalten schwangeren Frauen aus dem Mausstamm von Interesse. Hinweis: Rasse heterozygote Männchen und Weibchen mindestens 10 Würfe einschließlich Wildtyp zu erhalten, heterozygot und Knock-out-Welpen robuste Kontrolltiere zu erhalten.
2. Erhalten Sie zwei Kategorien von erwachsenen Mäusen vocalizations bei gleichgeschlechtlichen Interaktionen aufzeichnen.
   1. Erhalten Sie mindestens 12 Männchen oder 12 Frauen jedes Genotyps als Testmäuse aus dem Stamm von Interesse (zu berücksichtigen interindividuelle Variabilität). Hinweis: Dieses Protokoll ist gut geeignet für Erwachsene, aber es kann zu juveniles eingestellt werden, mit verringerter Isolationszeit vor dem Experiment ^9. Dieser Test funktioniert bei Männern oder Frauen. Allerdings Tests männlich vermeidens aus Mausstämmen, die einen klaren aggressiven Phänotyp in der männlich-männlich sozialen Interaktion Test anzuzeigen.
   2. Um die Menge an affiliative Wechselwirkungen zu maximieren, isolieren die Versuchstiere vor den Experimenten. Haus Männchen einzeln für 3 Wochen (zu reduzieren aggressive Interaktionen auf ein Minimum ^14,17) und Weibchen für 3 Tage (E. Ey, nicht veröffentlichte Daten) , um ihre soziale Motivation zu erhöhen.
   3. Erhalten Männchen oder Weibchen aus Stämmen repräsentativ für den genetischen Hintergrund der Teststamm sie als Neuankömmlinge zu nutzen (zB die Interaktion Mäuse, siehe 3.1.3). Zum Beispiel wird, wenn der mutierte Stamm wurde erzeugt auf dem C57BL / 6J Hintergrund studiert, verwenden C57BL / 6J-Mäuse als Neuankömmlinge. Berechne die Anzahl der Tiere benötigt, so daß jeder dieser Mäuse nicht mehr als 2-mal täglich wie Neuling benutzt wird. Haus in Gruppen.
3. Erhalten Sie zwei Kategorien von erwachsenen Mäusen zu männlichen vocalizations in Gegenwart einer Brunst weiblichen aufzeichnen.
   1. Erhalten Sie bei lOsten 12 geschlechtsreife Männchen von jedem Genotyp des Stammes von Interesse (zu berücksichtigen interindividuelle Variabilität). Hinweis: Wenn die Männchen noch nie Erfahrung mit Frauen hatte, steckte sie in Einzelkäfigen und lassen sie mit einem weiblichen 2 Tage eine Nacht verbringen , bevor der Test ihre Motivation zu erhöhen ⁶ Ultraschall-vocalizations zu emittieren.
   2. Erhalten geschlechtsreife Weibchen aus dem Hintergrundstamm der aufgenommenen Männer. Wenn beispielsweise die mutanten Männchen auf die erzeugt wurden C57BL / 6J-Hintergrund untersucht, verwenden C57BL / 6J-Weibchen. Berechnung der Anzahl der Frauen benötigt, so daß jeder dieser Mäuse nicht mehr als 3 Mal pro Tag verwendet wird. Haus in Gruppen.

2. Pup Isolation Calls

1. Pup Identification
   1. Drei Tage vor dem vorausgesagten Tag der Geburt, isolieren die schwangeren Frauen.
   2. Schauen Sie sich die Frauen für die Geburt jeden Morgen und jeden Abend. Notieren Sie sich den Tag der Geburt als P0.
   3. Identifizieren Sie die Welpen an P1 mit lang anhaltenden Pfote Tätowierungen (subkutane Injektion von grünen Tattoo Paste mit einem 0,3 mm x 13 mm [30 G ½ "] Nadel). Erstellen Sie einen Code mit einem, zwei, drei oder vier Pfoten markiert. Seien Sie als schnell wie möglich auf die minimal die Welpen stören, und setzen sie sie so schnell wie möglich in das Nest zurück.
2. Stellen Sie den Käfig zu Datensatz Pup Isolation aufruft.
   1. Verwenden Sie entweder eine selbstgemachte schalldicht Kammer (1A) oder ein einfaches Styropor - Box. Legen Sie ein Thermometer in der Box die Temperatur für jede Aufnahme zu überwachen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur zwischen 18 ° C und 22 ° C bleibt.
   2. Legen Sie ein Mikrofon an der Spitze (durch ein Loch in der Spitze der Box). Stellen Sie die Höhe des Mikrofons, so dass die Membran des Mikrofons 12-15 cm über dem Boden des Kastens ist, wo der Welpe hinlegen wird. Schließen Sie das Mikrofon an die Soundkarte und die Soundkarte auf den Computer.
   3. Um die Verstärkung des sou einstellennd Karte, führen Sie eine Aufnahme-Studie mit einem Welpen, die nicht in dem Experiment verwendet werden. Setzen Sie den Welpen in den gleichen Bedingungen wie bei dem Experiment (siehe 2.3.1). Schließe die Tür. Stellen Sie die Verstärkung auf der Soundkarte, so dass es auf dem Maximalwert ist (die höchste Amplitude für die vocalizations möglich zu haben), aber ohne Überlastung (Check auf dem Live-Spektrogramm-Anzeige auf der Aufnahme-Software).
      Hinweis: Ein paar Anrufe könnten überlastet werden, wenn die Amplitude der Mehrheit der Anrufe auf höchstem Niveau möglich gehalten wird.
   4. Registrieren Sie den Verstärkungspegel für jede Sitzungsaufzeichnung und nicht ändern, es nicht zwischen Welpen / Würfe / Sitzungen. Variationen in aussteuern zu ungenauen Anruferkennung und akustische Variablen, die den gleichen Schwellenwerte in den Analysen der automatischen Erkennung und Messungen mit führen würde (siehe 5.1 bis 5.4).

Abbildung 1: Richten Sie für die Isolierung der Aufnahme Anrufe von Maus Welpen und Spektrogramme von Ultraschall - vocalizations (A) Beispiel für eine selbstgemachte schalldichten Kammer pup Isolation Anrufe aufzuzeichnen.. (B) Spektrogramme der verschiedenen Anruftypen in der vorliegenden Anruftyp Einstufung verwendet wurde ; siehe Beschreibung in Tabelle 1 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Führen Sie die Aufzeichnung der Welpe Isolation alle zwei Tage nennt. Führen Sie Aufnahmen am Morgen für Welpen in der Nacht geboren, und am Nachmittag für Welpen während des Tages geboren Kategorisieren in der gleichen Altersklasse Welpen zu vermeiden, mit einem halben Tag von Altersunterschied. Dies ist am deutlichsten für die sehr jungen Stadien P2 und P4.
   1. Nehmen Sie einen Welpen im Wurf. Stellen Sie sie so schnell und schonend wie möglich in einem Kunststoff Empfänger mit Ethanol gewaschen und getrocknet, 10% (Durchmesser: 9cm; Höhe: 10 cm vom Mikrofon bedeckt aus dem Bereich der Flucht) ältere Welpen zu verhindern. Setzen Sie den Empfänger direkt unter dem Mikrofon.
   2. Schließen Sie das Feld so schnell und so leise wie möglich. Starten Sie die Aufnahme von pup Ultraschall vocalizations in der Aufzeichnungssoftware (16-Bit-Format, 300 kHz Abtastfrequenz zu erfassen Schallamplitude von bis zu 150 kHz mit hoher Qualität).
   3. Nachdem die erforderliche Zeit der Aufzeichnung (bis zu 5 min) abgelaufen ist, die Aufnahme zu stoppen. Nehmen Sie den Welpen aus dem Kasten heraus. Notieren Sie sich die Pfote Tätowierungen des Welpen nach unten.
   4. Nehmen Sie die Axillartemperatur des Welpen mit einer Sonde-Thermometer. Markieren Sie den Welpen auf dem Rücken mit einem winzigen Punkt mit einem Geruch losen Stift (Wasserfarbe), zu erkennen, leichter die bereits aufgenommenen Jungen im Nest, wenn der nächste gewählt wird und zu vermeiden, alle Welpen Manipulation jedes Mal neu ist gewählt. Setzen Sie den Welpen in das Nest zurück.
   5. Waschen Sie die Kunststoff-Empfänger und die Kunststoff seinem Boden mit 10% Ethanol abdecken und trocknen Sie es gutbevor der nächste Welpe, der innerhalb setzen.
   6. Wählen Sie die nächste Welpe im Wurf und wiederholen 2.3.
4. Überprüfen Sie das Körpergewicht, motorische Koordination, negativ geotaxis und Entwicklungsmarken (für Details der reduzierten Testbatterie finden Sie in die Verfahrensabschnitte in Schmeisser siehe et al. ¹⁸ und in Ey et al. ¹⁹⁾ nach einer Ruhezeit von 1 Stunde zu ermöglichen die Welpen nach der anstrengenden Emission von Ultraschall vocalizations zu erholen. Verwenden Sie eine andere Gruppe von Tieren , wenn die komplette Entwicklungstestbatterie wie in Chadman et al. ²⁰ und Scattoni et al. ²¹ durchgeführt wird.
5. Wiederholen Sie diese Aufnahmen alle zwei Tage zwischen P2 und P12 pup Stimmverhalten und Entwicklung in den ersten zwei Lebenswochen zu charakterisieren.

3. Ultraschall Vocalizations während Gleichgeschlechtliche Soziale Interaktionen

1. vocalization Recordings
   1. Bereiten Sie einen Testkäfig (50 x 25 cm x 30 cm ^3; Plexiglas, 100 Lux [geringer Intensität weißes Licht]) mit Seifenwasser gereinigt, getrocknet und mit 2 cm frische Bettwäsche in der schallisolierten Kammer gefüllt.
      1. Stellen Sie das Mikrofon, so dass vocalizations aus allen Ecken des Käfigs emittiert wird, kann aufgezeichnet werden. Befestigen Sie das Mikrofon in einer Ecke des Testkäfig (entweder auf dem Käfig oder auf einem Stativ) und stellen Sie den Winkel Mikrofon-Käfigboden des Käfigs gesamte Oberfläche zu bedecken.
         Hinweis: Ultraschall sind sehr direktional.
      2. Legen Sie eine Videokamera auf der Oberseite der schalldichten Kammer, um die gesamte Oberfläche des Testkäfigs zu erfassen.
         Hinweis: Überprüfen Sie, dass das Mikrofon nicht an einer Ecke des Testkäfig auf dem Video zu verstecken.
      3. Vor der Prüfung stellen Sie die Verstärkung der Soundkarte mit einem Ersatz männlichen und einem Ersatz-Weibchen, das im Experiment nicht später verwendet wird. Setzen Sie diese Tiere in der Testkäfig in der Aufnahmekammer. Stellen Sie den Gain-Pegel auf der Soundkarte, die Amplitude der aufgezeichneten vocalizations zu maximieren but zu minimieren, wie in der Live-Spektrogramm-Darstellung von der Aufnahmesoftware gesehen Überlastung.
         Anmerkung: Die Verstärkung hängt von der Entfernung zwischen dem Mikrofon und dem vocalizing Tiere.
   2. Führen Sie das Tier getestet werden (männlich oder weiblich; es wird die "Insassen" bezeichnet werden) in den Testkäfig auf frische Bettwäsche. Lassen Sie es für 20 Minuten an den Testkäfig in der schalldichten Kammer habituate zu sein Interesse für den unbekannten Artgenossen in 3.1.3 eingeführt maximieren.
   3. Nach dieser Gewöhnungszeit, führen die ^2. Tier für die Interaktion (männlich oder weiblich, gleichen Geschlechts wie der Insasse, aber verschiedene Ohrmarken / Pfote Tätowierung sie später zu identifizieren; es wird der "Neuankömmling" bezeichnet werden).
      1. Starten Sie die Ultraschall vocalizations Aufnahme (16-Bit-Format, 300 kHz Abtastfrequenz Schallamplitude zu erfassen bis zu 150 kHz mit hoher Qualität) und das Video auf die Einführung des neuen Ankömmling im Testkäfig einzufangen. Starten Sie die u Aufnahmeltrasonic vocalizations während Gewöhnung (Insasse allein), wenn ein Vergleich zwischen dem Basisniveau der Stimmgebung Emission während Käfig Exploration und der sozialen Interaktion erforderlich ist.
      2. Synchronisieren Sie manuell / visuell die Audio- und Videoaufnahmen von der Zeit Uhr drücken ( "bip" Sound in der Nähe des Mikrofons) genau dann, wenn die Hinterpfoten der Ankömmling Maus den Boden berühren.
      3. Lassen sich die beiden Tiere, für die gewünschte Zeit zu interagieren (beispielsweise 4 min, eine Dauer, die ausreichend genug Ultraschall vocalizations zu sammeln).
   4. Setzen Sie den Insassen und den Ankömmling zurück in ihren jeweiligen Heimatkäfige. Leeren Sie den verwendeten Betten aus dem Testkäfig, waschen Sie es mit Seifenwasser und trocknen Sie sie mit Papiertüchern. Setzen Sie frische Bettwäsche und legen Sie sie in den schallisolierten Kammer für den nächsten Test zurück.

4. Male Vocalizations während der Interaktion mit einem Estrus Weiblich

1. Früh am Morgen der Tag der Prüfung vonMänner, nehmen von jedem weiblichen vaginalen Abstrichen ihre sexuellen Status innerhalb der Rosse zu bestimmen.
   1. Halten Sie das Weibchen durch den Schwanz und halten sie auf dem Käfig Gitter. Verwenden Sie eine Pipette die Vagina mehrmals mit 20 & mgr; l PBS zu spülen (dh injizieren und erinnern die gleichen 20 & mgr; l PBS mehrmals). Erinnere die 20 & mgr; l PBS mit der gleichen Pipettenspitze. Verwenden Sie sterile PBS, eine Infektion zu vermeiden, wenn Frauen für mehrere aufeinander folgende Tage getestet werden sollen.
   2. Verbreiten Sie die PBS, die Aussetzung der vaginalen Zellen auf einem Objektträger enthält. Stellen vier Proben auf einem Objektträger (Identifizierung der Personen an der Seite des Schiebers mit einem Bleistift). Lassen Sie die Folien trocknen, bevor die Färbung durch.
   3. Die Arbeiten im Rahmen der Laborabzug.
      1. Bereiten ein Bad aus reinem May-Grünwald, ein Bad aus Phosphatpufferlösung (0,1 M) und ein Bad aus Giemsa R (1/20 in Phosphatpufferlösung).
      2. Legen Sie die Folien in das Bad aus reinem May-Grünwald für 3 Minuten, dannspülen Sie sie in das Bad der Phosphatpufferlösung für 1 min und sie schließlich übertragen 10 Minuten im Bad von Giemsa R (1/20 in Phosphatpufferlösung).
      3. Danach gründlich wieder die Dias in das Bad der Phosphatpufferlösung für 10 Sekunden und lassen Sie sie trocknen.
   4. Untersuchen Sie die gefärbten Objektträger unter dem Mikroskop. Frauen, die während des Tages verwendet werden können, sind diejenigen, deren Proben vorhanden nur große verhornten Epithelzellen (ohne Zellkern, in Blau gefärbt, voller Brunst).
2. Setzen Sie die Männer in den Testraum mindestens 30 min vor ihnen zu testen.
3. vocalization Recordings
   1. Wiederholen 3.1 falls erforderlich.
   2. Führen Sie die männlichen (auf frische Bettwäsche) getestet werden. Lassen Sie ihn für 10 Minuten in den schallisolierten Kammer mit dem Testkäfig habituate.
   3. Nach dieser Gewöhnungszeit, ein Weibchen in der Brunst (unter den von der Färbung ausgewählten) einzuführen.
      1. Starten Sie die Ultraschall-Laute und die Videoaufzeichnungdie Einführung des Weibchens in der Testkäfig zu erfassen. Starten Sie die Ultraschall vocalizations während Gewöhnung Aufnahme (männlich allein), wenn ein Vergleich zwischen dem Basisniveau der Stimmgebung Emission während Käfig Exploration und der sozialen Interaktion erforderlich ist.
      2. Synchronisieren Sie manuell / visuell die Audio- und Videoaufnahmen von der Zeit Uhr drücken ( "bip" Sound in der Nähe des Mikrofons) genau dann, wenn die Hinterpfoten der weiblichen Maus den Boden berühren.
      3. Lassen sich die beiden Tiere, für die gewünschte Zeit zu interagieren (beispielsweise 4 min, eine Dauer, die ausreichend genug Ultraschall vocalizations zu sammeln).
   4. Setzen Sie den männlichen und den weiblichen in ihren jeweiligen Heimatkäfige zurück. Leeren Sie den verwendeten Betten aus dem Testkäfig, waschen Sie es mit Seifenwasser und trocknen Sie sie mit Papiertüchern. Setzen Sie frische Bettwäsche und legen Sie sie in den schallisolierten Kammer für den nächsten Test zurück.
      Hinweis: Es ist optimal jeder Brunst Weibchen zu verwenden jeden Tag nur ein einziges Mal (aber bei Bedarf kann eswerden bis 3 mal am selben Tag verwendet, aber nicht in einer Reihe).

5. Variablen zu extrahieren

1. Bereiten Sie Audiodateien für die Analysen. Hinweis: Das folgende Verfahren spezifisch zu A ViSoft SASLab Pro und können je nach der verwendeten Software ändern.
   1. Schneiden Sie die Dateien so, dass sie genau an der "bip" der Zeit Uhr beginnen und enden nach der gewünschten Dauer (5 min für pup Aufnahmen, 4 min für Erwachsene Aufnahmen).
   2. Filtern die Amplitude unter 30 kHz durch ein Hochpassfilter (Bearbeiten> Filter> FIR Time Domain Filter; High Pass mit 30 kHz Frequenz abgeschnitten). Verwenden Sie die Stapelverarbeitung alle Dateien von Interesse zu filtern (Aktionen> Batch-Verarbeitung> FIR-Filter).
   3. Identifizieren jedes Ultraschall Stimmgebung, indem sie mit der Software-Kennzeichnung.
      1. Verwenden Sie die automatische Erkennung für pup Aufnahmen (Tools> Etiketten> Abschnitt Etiketten von Wellenform Ereignisse erstellen). Stellen Sie Schwelle, Haltezeit und Marge foder die genaueste Erkennung. überprüfen Sie manuell die Erkennung und passen Etiketten bei Bedarf (empfohlen).
      2. Verwenden Sie visuelle Erkennung (manuelles Einlegen von Etiketten) für erwachsene Aufnahmen mit Hintergrundgeräuschen (die vocalizations auswählen, rechts klicken, und Abschnitt Etikett von Marker einfügen).
   4. Erstellen Sie das Spektrogramm. Aktivieren der automatischen Parametermessungen (Extras> Automatische Parametermessungen> Automatische Parametermessungen Einstellungen).
   5. Überprüfen Sie die "Enable automatische Messungen", die "Compute-Parameter von gesamten Spektrogramm", und die "Automatische Aktualisierung" Boxen. Wählen Sie "Element Trennung": interaktiv (Abschnitt Etiketten).
   6. Kontrollkästchen die gewünschten zeitlichen Parameter (Dauer des Elements, Intervall, Start- / Endzeit) und spektrale Kennwerte (Peak-Frequenz) und die Lage der Messungen (Start des Elements, Ende des Elements, Mittelwert, Max, Min) zu berechnen .
   7. Kopieren Sie die Messungen und fügen Sie denm in einer Kalkulationstabelle.
      Hinweis: Bei Aufnahmen mit Erwachsenen durchgeführt, Messungen der spektrale Kennwerte könnten aufgrund von Hintergrundrauschen unmöglich. Verwenden Sie die manuelle Messungen der Spitzenfrequenz von über die verschiedenen Frequenzwerte direkt auf dem Spektrogramm klicken und die Werte manuell in einer Tabelle einfügen.
2. Bestimmen Sie Anrufrate, dh die Anzahl der Anrufe pro Minute , indem man zuerst die Anzahl der vocalizations Bestimmung emittiert (Gesamtzahl der Etiketten). Dann berechnen Sie die Anrufrate durch die Gesamtzahl der vocalizations um die Dauer aufgezeichnet Teilung (in Minuten) der Datei.
3. Bestimmen Sie zeitliche Organisation, das heißt, die Verteilung der Zeitintervalle zwischen den Anrufen Ablauforganisation zu bestimmen.
   1. Berechnen Sie die Zeitintervalle zwischen dem Ende der Stimmgebung n und dem Beginn der Stimmgebung n + 1 unter Verwendung des Start- / Endzeit jedes Etiketts.
   2. Stellen Sie die Verteilungsdichte der Zeitintervalle zwischen ultrasonic vocalizations.
4. Bestimmen Sie Anruf Repertoire, das heißt, definieren Sie die Anruftypen , die in der Aufnahme. Verwenden Sie das Beispiel der Klassifikation , die in Tabelle 1 und Abbildung 1B.
   1. Wenn in 5.1.3 jede Stimmgebung Beschriftung, schreiben Sie den Namen des Anruftyp in dem Etikett.
   2. Berechnen Sie die genaue Anzahl und des Anteils der einzelnen Anruftyp das Stimmrepertoire aufzubauen.
5. Bestimmen akustischen Eigenschaften für jede Vokalisierung, dh, die Dauer, Spitzenfrequenz (dh Frequenz mit der höchsten Amplitude) am Anfang und am Ende des Anrufs, maximalen und minimalen Spitzenfrequenz und die mittlere Frequenz , wenn die automatische Messung möglich ist (1B) .
   1. Verwenden Sie die automatische Parametermessungen Funktion in der Software automatisch Dauer zu messen, Spitzenfrequenzeigenschaften (zB Start, Ende, Mittelwert, Maximum, Minimum) in pup - Aufnahmen.
   2. Verwenden Sie die Dauer des Etiketts als die Dauer der Stimmgebung für erwachsene Aufnahmen. Messen Sie manuell auf dem Spektrogramm - Fenster die Spitzenfrequenz - Eigenschaften (zB Start, Ende, Maximum, Minimum).
6. Paar Ultraschall-Stimmgebung Daten und sozialen Interaktionsdaten (MiceProfiler Plugin von der ICY - Plattform ^22).
   1. Stellen Sie sicher, so genau wie möglich, die Audio- und die Videoaufnahmen, wie beschrieben in dem Protokoll zu synchronisieren.
   2. Encode das Video von der sozialen Interaktion mit dem Mäuse Profiler Tracker Plugin der ICY - Plattform , wie in de Chaumont et al. ^22. Starten Sie das Tracking genau dann, wenn die Hinterpfoten des eingeführten Tier den Boden berühren.
   3. Laden Sie die codierte Videodatei und die entsprechende XML - Datei (erzeugt durch Mäuse Profiler Tracker) in der Mäuse Profiler Video Label Maker Plugin der ICY - Plattform , wie in de Chaumont et beschriebenal. ^22.
      Hinweis: Die Mäuse Profiler Video Label Maker Plugin wird automatisch die Videodatei verknüpfen und die Textdatei aus der Analyse der Audiodatei generiert , wenn sie den gleichen Namen haben (siehe: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
   4. Nach der Überprüfung, dass die Maus Skala korrekt, klicken Sie auf "Erstellen USV-Statistik" für jede Datei, die Anzahl und den Anteil der vocalizations bei jedem gesellschaftlichen Ereignis in einer separaten Datei emittiert zu erhalten.

6. Hochladen von Dateien auf der mouseTube Datenbank

1. Stellen Sie sicher, die Dateien auf einem Speicherserver, der von außerhalb der Institution zugegriffen werden kann.
   Hinweis: Server in einigen Institutionen mit hohen Sicherheitsstufen gehostet wird eine spezifische Konfiguration müssen die Menschen zugänglich sein, indem von außerhalb der Einrichtung zu verbinden.
2. Gehen Sie auf die Webseite mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Melden Sie sich an (Login einnd Passwort werden von den Administratoren, die jedem Benutzer zugeschrieben).
3. Überprüfen Sie, ob die Mausstamm aufgezeichnet bereits in der durch einen Klick mouseTube Datenbank existiert auf der "Stämme" -Taste. Wenn nicht, fragen Sie die Administratoren, es zu schaffen.
4. Erstellen Sie Themen, die mit "Wissenschaft> Erstellen". Geben Sie die Identifikationscodes der aufgenommenen Tiere. Sammeln Sie sie in Gruppen späteren Abruf von Daten zu erleichtern.
5. Geben Sie die Beschreibung des Protokolls verwendet, um Ultraschall vocalizations notieren Sie die Verwendung von "Protokolle> Erstellen".
6. Erstellen Sie ein Experiment für jede Aufnahmesitzung die Verwendung von "Versuche> Erstellen". Geben Sie das Protokoll, die Gruppe von Personen, die aufgezeichnet wurde, die Hard- und Software verwendet, und ihre Besonderheiten.
   Hinweis: Das Experiment alle Metadaten sammelt der Stimmgebung Dateien entspricht.
7. Erstellen Sie den Link zu den Stimmgebung Dateien, die die "vocalisations mit> Create & #34; Taste. Wählen Sie das Experiment in der Liste. Kopieren Sie die URL der Stimmgebung Datei (dieser Link beginnt mit http: // ...) in das entsprechende Feld der "Files auf" Spalte. Bestätigen Sie die Eingabe durch einen Klick auf die Schaltfläche "Erstellen Sie eine Verknüpfung zwischen mouseTube und den Dateien".
   Hinweis: Es ist nicht erforderlich, um jede Box für jede Datei in der gleichen Zeit zu füllen.
8. Falls erforderlich, ändern Sie die Links jederzeit eingegeben, und fügen Sie Details im Abschnitt "Hinweise". Zögern Sie nicht, Notizen aufzuschreiben, um weitere Details zu geben. wenn ein Link zu einer Videodatei zum Beispiel, die gleichzeitig mit der Audiodatei aufgezeichnet wurde eingegeben wurde, kann dies in den "Anmerkungen" angegeben werden.

Ergebnisse

Mit den vorliegenden Protokollen, sind wir für das Stimmverhalten von Mäusen fehlt ProSAP1 / SHANK2, ein Gen im Zusammenhang mit Autismus - Spektrum - Störungen (ASD) ^23-25. ASD durch Defizite in der sozialen Kommunikation und klischee Verhaltensweisen ¹ gekennzeichnet. Unsere SHANK2 ^{- / -} Mäuse zeigten Hyperaktivität, erhöhte Ängstlichkeit und atypische Sprachkommunikation ^18,26. Tatsächlich haben wir festgestellt , dass SHANK2 ^{- / -} Mäusen eine atypische Entwicklungsprofil in ihre Emissionsrate von pup Isolation Anrufe im Vergleich mit dem typischen umgekehrten U-förmigen Kurve in ihrem Wildtyp littermates angezeigt SHANK2 ^{-. / -} Mäuse zeigten eine erhöhte Anrufrate bei P4 und verringert im Vergleich zu ihren Wildtyp - Geschwister (Abbildung 2) bei P6 anrufen. Wir beobachteten auch eine verringerte Anrufrate bei weiblichen Interaktionen ein SHANK2 beteiligt ^{- / -} Weibchen in VERGLEICHn mit Wechselwirkungen ein Wildtyp - littermate beteiligt (Abbildung 2). Wir untersuchten das Repertoire der 5 verschiedenen Anrufkategorien. Es schien zwischen Welpen unterschiedlich zu sein (zum Beispiel hier , P2, P6 und P10) und Erwachsenen (Abbildung 3). Genotype bedingte Unterschiede waren signifikant meist im Erwachsenenalter. Während soziale Interaktionen mit adulten SHANK2 ^{- / -} Männchen oder Weibchen mit einem C57BL / 6N weiblich, mehr kurze Anrufe und unstrukturierten Anrufe wurden im Vergleich zu Interaktionen aufgezeichnet ihren Wildtyp - Geschwister beteiligt (3D und E). Weniger komplexe Anrufe und Frequenzsprünge Anrufe auch bei Interaktionen mit einer C57BL / 6N Weibchen mit adulten SHANK2 aufgezeichnet wurden ^{- / -} Weibchen im Vergleich zu Wechselwirkungen SHANK2 ^{+ / +} Weibchen (Abbildung 3E) beteiligt sind . Schließlich haben wir auch manuell akustischen Variablen gemessen. Es gab keinen signifikanten Genotyp bedingte Differenz duRing Entwicklung. Im Gegensatz dazu ist die Dauer der Anrufe während der Interaktionen mit adulten SHANK2 aufgezeichnet ^{- / -} waren Frauen kürzer als jene , die während Interaktionen aufgezeichnet ihren Wildtyp - Geschwister (4A) beteiligt sind . Wir konnten zeigen auch , dass die Spitzenfrequenz von Ultraschall vocalizations während pup Entwicklung ohne signifikante Genotyp bedingte Differenz ²⁶ erhöht. Während Wechselwirkungen zwischen SHANK2 ^{- / -} Männchen oder Weibchen mit einem C57BL / 6N weiblich, hatte Ultraschall vocalizations eine niedrigere Spitzenfrequenz im Vergleich zu Anrufen während Wechselwirkungen mit ihren Wildtyp - Geschwister (4B) aufgezeichnet.

Darüber hinaus erlaubt das vorliegende Protokoll auch den Kontext der Emission von Ultraschall vocalizations zu untersuchen , indem die Daten von Audio - Aufnahmen zu den Verhaltensdaten extrahiert aus MiceProfiler (ICY - Software, Institut Vergangenheit kombinierteur, Paris). So wurden zum Beispiel in weiblich-weiblich-Wechselwirkungen, die meisten Ultraschall-vocalizations emittiert, wenn die Tiere in Kontakt waren und insbesondere den Insassen des neuen Ankömmling des ano-genitale Region Schnupfen, oder zumindest die Insassen hinter dem neuen Ankömmling zu sein. Mäuse auch viele Ultraschall vocalizations emittiert wird, wenn der Insasse näherte sich dem Ankömmling (Bild 5, oben). Weniger vocalizations wurden aufgezeichnet , wenn der Insasse SHANK2 ^{- / -} Mäuse in physischen Kontakt waren mit dem neuen Ankömmling (zB die ano-genitale Bereich der Ankömmling Sniffing) , als wenn der Insasse war ein Wildtyp - Maus. Weniger vocalizations wurden ausgelöst , wenn der Insasse hinter dem Neuankömmling einen SHANK2 war ^{- / -} Maus , als wenn es war ein Wildtyp - Maus. Mehr vocalizations wurden aufgezeichnet auch wenn der Neuling im Gesichtsfeld des Insassen Maus war, und um so mehr in den Wildarten als in den Mutanten (Abbildung 5, unteres Bild).

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Abbildung 2:. Emissionsrate von Ultraschall vocalizations während der Entwicklung und in erwachsenen männlichen und weiblichen SHANK2 ^{- / -} Mäusen und Wildtyp littermates Anrufrate von Welpen (alle zwei Tage von P2 bis P12, n = 18-19 SHANK2 ^{+ / +,} n = 15-16 SHANK2 ^{- / -)} und Erwachsene in der männlich-weiblichen Brunst Wechselwirkungen (n = 15 SHANK2 ^{+ / +,} n = 16 SHANK2 ^{- / -)} und weiblich-weiblich - Wechselwirkungen (n = 15 SHANK2 ^{+ / +,} n = 13 SHANK2 ^{- / -)} in Wildtyp - Mäusen (links) und SHANK2 ^{- / -} Mäusen (rechts). Daten werden als Mittelwert +/- SEM dargestellt und einzelnen Punkten (ungepaarten Wilcoxon Tests: * p <0,05, ** p <0,01 *** p <0,001).ge.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3:. Vocal Repertoire von SHANK2 ^{- / -} Mäusen und Wildtyp littermates Proportions der fünf verschiedenen Rufarten von P2 Welpen emittiert (A; n = 20 SHANK2 ^{+ / +,} n = 18 SHANK2 ^{- / -),} P6 Welpen (B; n = 19 SHANK2 ^{+ / +,} n = 18 SHANK2 ^{- / -),} P10 Welpen (C; n = 20 SHANK2 ^{+ / +,} n = 18 SHANK2 ^{- / -),} erwachsene Männer mit einer Brunst weiblich (D ; n = 16 SHANK2 ^{+ / +,} n = 16 SHANK2 ^{- / -)} und adulte Weibchen mit einem anderen weiblichen (E; n = 15 SHANK2 ^{+ / +,} n = 13 SHANK2 ^{- / -)} in Wildtyp - Mäusen (linke Felder) und SHANK2 ^{- / -} Mäuse (rechte Felder). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt +/- SEM und einzelne Punkte (Chi-Quadrat - Tests: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4:. Akustische Variablen aus Ultraschall-Laute in SHANK2 extrahiert ^{- / -} Mäusen und Wildtyp - Geschwister (A) Dauer von allen Rufarten verwechselte von P2 Welpen emittiert (n = 20 SHANK2 ^{+ / +,} n = 18 SHANK2 ^{- / -} ), P6 Welpen (n = 19 SHANK2 ^{+ / +,} n = 18 SHANK2 ^{- / -),} P10 Welpen (n = 20 SHANK2 ^{+ / +} , n = 18 SHANK2 ^{- / -),} erwachsene Männer mit einer Brunst weiblichen (n 16 = SHANK2 ^{+ / +,} n = 16 SHANK2 ^{- / -)} und erwachsene Frauen mit einem anderen Weibchen (n = 15 SHANK2 ^{+ / +,} n = 13 SHANK2 ^{- / -)} in Wildtyp - Mäusen (links) und SHANK2 ^{- / -} Mäusen (rechts). (B) Der maximale Spitzenfrequenz auf allen Rufarten gemessen verwechselt in P2 Welpen, P6 Welpen, P10 Welpen, erwachsene Männer mit einer Brunst weiblichen und erwachsene Frau mit einem anderen Weibchen (gleiche Ns wie oben). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt +/- SEM und einzelne Punkte (ungepaarten Wilcoxon - Tests: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Kontext. s der Emission von Maus Ultraschall-Laute in weiblich-weibliche erwachsene soziale Interaktionen Anteil der Ultraschall-Laute von Paaren emittiert Beteiligung eine SHANK2 ^{+ / +} mit einem C57BL / 6N Maus (n = 16, A) und Paare eine SHANK2 beteiligt ^{- / -} mit ein C57BL / 6N Maus (n = 13, B) während der folgenden Arten von Verhaltens Ereignisse (rot: Insasse, grün: Ankömmling): soziale Kontakte, oro-oralen Kontakt, ano-genitale Schnüffeln von dem Insassen Maus, elo- Genital schnüffeln von der Ankömmling Maus, Insassen hinter Ankömmling, Ankömmling hinter Insassen, Unbeweglichkeit der Insassen, Unbeweglichkeit der Ankömmling, Ansatz von dem Insassen und die Flucht aus dem neuen Ankömmling, Ansatz von der neuen Ankömmling & Flucht aus dem Insassen, Ansatz und die Flucht aus dem Insassen, Ansatz und die Flucht aus dem neuen Ankömmling, Insasse nach dem Ankömmling, Neuling im Blickfeld des Insassen, Insassen im Blickfeld des Neulings. Daten sind pals Mittelwert +/- SEM und einzelnen Punkten übelgenommen (ungepaarten Wilcoxon Tests: * p <0,05, ** p <0,01). Nicht veröffentlichte Daten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Rufarten	Beschreibung
kurz	Dauer ≤5 ms und Frequenzbereich ≤6.25 kHz
einfach	Dauer> 5 ms und Frequenzbereich ≤6.25 kHz (flach) oder Frequenzmodulation nur in eine Richtung (aufwärts oder abwärts) mit Frequenzbereich> 6,25 kHz
Komplex	Frequenzmodulationen in mehr als eine Richtung und Frequenzbereich> 6,25 kHz (moduliert) oder die Aufnahme von einem oder mehreren zusätzlichen Frequenz cls Bestandteil (harmonische oder nicht-lineare Phänomene, aber keine Sättigung), aber keine Einschränkung für Frequenzbereich (Komplex)
Frequenzsprünge	Einbeziehung von einem Sprung (ein Frequenzsprung) oder mehr Sprünge (Frequenzsprünge, andere) in der Frequenz ohne zeitliche Abstand zwischen den aufeinanderfolgenden Frequenzkomponenten, mit (gemischt) oder ohne laute Teil innerhalb des reinen Ton-Ruf
unstrukturierten	kein reiner Ton Komponente identifiziert werden können; "Lauten" Anrufe

Tabelle 1:. Eigenschaften der fünf Arten von Maus Ultraschall vocalizations Beispiele für Kriterien der Dauer, Frequenzbereich, Frequenzmodulationen und Frequenzsprünge verwendet , um 5 Arten verschiedene Anrufultraschall Vokalisationen innerhalb von Maus zu bestimmen.

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellten bietet standardisierte und zuverlässige Art und Weise Maus Ultraschall-Laute im Labor zu sammeln. Diese sehr eingeschränkten Situationen haben den Vorteil der Standardisierung. Sie werden mit Erfolg verwendet , um Stämme oder Genotypen innerhalb Stämme ^18,19,26,27 zu vergleichen. Wie in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt, ermöglichen diese Verfahren die Identifizierung von atypischen sozialen Kommunikation in Mäusen für SHANK2 mutiert, ein Gen mit Autismus - Spektrum - Störungen in Verbindung gebracht. Vergleiche zwischen den Mausstämmen, zwischen unterschiedlichen Kontexten oder sogar zwischen verschiedenen Labors wird durch die Verfügbarkeit von größeren Datenmengen auf der mouseTube Datenbank ausgelöst werden. Dieses Tool sollte steigern Studien über Maus Ultraschall-vocalizations durch multivariate Analysen ermöglicht.

Die Protokolle werden hier beschrieben optimiert Mäuse verschiedener Genotypen innerhalb einer Belastung zu testen, da es in der Mehrzahl der Studien durchgeführt wird, um die genetische c ModellierungEITRAG zu neuropsychiatrischen Störungen. Es wird empfohlen, experimentell jede Studie zu entwerfen, um die besten Kontrollen möglich zu haben. Tatsächlich Wurf Effekte könnten Maske oder künstlich genetische Effekte ^28,29 aufzublasen. Es ist daher ratsam, littermate Kontrollen für jeden Genotyp aufzunehmen. Zucht heterozygote Eltern sollten daher bevorzugt werden, da sie die korrekte Abstimmung von mutanten und Kontrollmäuse innerhalb eines Wurfes zu ermöglichen. Dies rechtfertigt die Pfote Tätowierung aller Welpen Kennzeichnung (geblendet Genotyp) Personen alle zwei Tage während der Aufnahmen zu verfolgen. Genotypisierung wird bei der Entwöhnung getan, um Proben Schwanz nehmen. Wenn pup Isolation Anrufe von P2 Aufnahme auf, würden wir nicht empfehlen Proben bereits bei Welpen Schwanz nehmen, da dieser Vorgang ergänzende Manipulation und Stress sehr zeitnah zu einer Aufnahme-Session enthält.

Die Protokolle hier vorgeschlagen, um Ultraschall-Laute bei Erwachsenen entlocken ist eine eindeutige Identifizierung des EWI nicht zulassen,tter der vocalizations. Dies erklärt, warum wir die Motivation des Versuchstieres zu manipulieren. Tatsächlich sind die Testmäuse isoliert und nicht der Neuling und die Versuchstiere für eine lange Zeit auf den Testkäfig während gleichgeschlechtlichen Wechselwirkungen gewöhnen. Bei männlichen-weiblichen Wechselwirkungen ist die eingeführte Weibchen nicht isoliert, und der Test männlichen gewöhnt für kürzere Zeit, da die Motivation in diesem sexuellen Kontext höher sein könnte. Diese Manipulationen Motivations sollte die Wahrscheinlichkeit der Testmaus maximieren die vocalizations emittierenden und nicht die eingeführte ein. Männlichen Ultraschall vocalizations in einem sexuellen Kontext, eine einfache Wattestäbchen mit frischen (dh nicht gefroren) Urin eines Brunst weiblichen aufzeichnen kann auch in den Käfig ³⁰ eingeführt werden. Dieses Verfahren erlaubt die Zuordnung von Ultraschall-vocalizations zum Test männlich mit 100% iger Sicherheit, aber es verhindert, dass bestimmte Informationen über den aktuellen sozialen Kontext der Emission dieser vocalizations zu sammeln. Daher bevorzugen wir die Protocol beschrieben hier (mit einem frei beweglichen Brunst weiblich). Wir empfehlen auch immer aus dem gleichen Stamm eingeführt Mäuse zu verwenden, wenn Mäuse aus einem mutierten Stamm zu testen und Vokalisierung, die Daten als ein Paar von Mäusen zu analysieren. Eine kürzlich durchgeführte Studie fördert die Verwendung von Triangulation den Emitter ³¹ zu lokalisieren. In dieser Studie wurden Frauen fanden auch Ultraschall vocalizations während Begegnungen mit einem männlichen emittieren. Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass sie für mindestens zwei Wochen vor der Aufnahme-Session isoliert. Die Verallgemeinerung der Verwendung der Triangulation in dieser Studie vorgeschlagen, sollten jedoch die Identifizierung des Emitters des vocalizations in den meisten Fällen ermöglichen, wenn Videoaufnahmen korrekt synchronisiert sind.

Die Isolation Anrufe von Welpen während der Entwicklung aufgezeichnet werden nicht durch Hintergrundgeräusche vom Bettzeug gestört. Üblicherweise wird eine automatische Analyse funktioniert sehr gut die wichtigsten Variablen zu extrahieren. Im Gegensatz dazu von den Erwachsenen aufgenommen vocalizations sind disturbed durch Hintergrundrauschen von den Tieren in den Betten zu bewegen. Automatische Analyse scheitern könnte, und deshalb sollten manuelle Analyse verwendet werden. Dennoch sollten die Bedingungen in den Testkäfig Betten Zugabe liefern, die weniger belastend sind für die Tiere als nackten Boden (die Mäuse nicht gefällt). Weitere Anstrengungen in der Gemeinschaft sind auf die Verbesserung der automatischen Erkennung von Ultraschall vocalizations unter verschiedenen Bedingungen konzentriert, auch die impliziert Hintergrundgeräusche. Zum Beispiel erlaubt die Voice - Software vocalizations zu analysieren, die für das Fehlen von Hintergrundrauschen ³² manuell ausgewählt worden waren. In dieser Software ist die Extraktion der akustischen Variablen automatisch, sondern muss die anfängliche manuelle Auswahl.

Es sollte beachtet werden, dass die interindividuelle Variabilität in der Stimmverhalten von Mäusen sehr wichtig ist. Zum Beispiel wird die Anrufrate der erwachsenen Männer in Anwesenheit eines Brunst weiblichen sehr verteilt (Abbildung 1). Wir suggest diese standardisierte Protokolle zu Ultraschall-vocalizations entlocken bereits die Variabilität der experimentellen Kontext mit Bezug zu begrenzen. Dennoch möchten wir auf die Bedeutung hinweisen, der nicht nur den Mittelwert und SEM für die Daten zu liefern , aber am wichtigsten ist, die einzelnen Punkte in Proben von geringer Größe ^33. Es ist auch sehr wichtig - wenn nicht notwendig - mindestens 12 Individuen jeder Gruppe / Genotyp aufzuzeichnen repräsentative Daten zu sammeln. In vielen Fällen sollte die interindividuelle Variabilität nicht ausgeblendet werden (in der Regel es nicht sein kann), und es könnte von großer Bedeutung sein, Personen zu identifizieren, die genetische Mutation untersucht tragen aber keine atypischen Phänotyp anzeigt. Solche Personen könnten Hinweise über Kompensationen schaffen, die neue Wege für Therapien von genetischen Störungen öffnen könnten.

In den meisten Verhaltens Charakterisierungen von Mausmodellen für neuropsychiatrische Störungen, Stimmverhalten und die sozialen Kontakte sind berücksichtigened auseinander (zB ^{19,27,34,35).} Recent Analyseverfahren bieten nun eine halbautomatische detaillierte Charakterisierung der gesellschaftlichen Ereignissen und Ereignisfolgen während einer Interaktion (mit MiceProfiler zum Beispiel) ^36, sowie die Möglichkeit , diese Analyse mit Daten von Audioaufzeichnungen zu kombinieren. Der Hauptvorteil dieser Methode ist es, einen umfassenden Überblick über die soziale Kommunikation in Mausmodellen von ASD zu schaffen, genauer zu erkennen, welche Aspekte der sozialen Kommunikation betroffen sind. Im vorliegenden Protokoll ist die Synchronisation noch manuell, aber dies kann durch die Auslösung der Videoaufzeichnung durch die Audio-Recording-Software verbessert werden. Diese Art von Analysen sollten zum Standard eine umfassendere Sicht der sozialen Kommunikation Defizite in Mausmodellen von neuropsychiatrischen Störungen zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich Bisher werden Vokalsignale meist von der Emitterseite analysiert (dh sind Tests gebaut , um die Emission von vo zu bevorzugencal Signale, die von dem getesteten Maus, wie in den vorliegenden Protokolle). Der Schwerpunkt sollte nun auch auf dem Empfänger dieser Signale gesetzt werden, um besser auf die Funktionen dieser akustischen Signale zu identifizieren. Dies sollte durch die Auswertung auch das Verhalten der neuen Ecken Mäuse in den vorliegenden Protokolle bei Erwachsenen (mit MiceProfiler zum Beispiel) ^36, unter Verwendung von Wiedergabeexperimente ¹⁶ oder durch die Einrichtung von neuen Protokollen erfolgen. Tatsächlich stellen die vorliegenden Protokolle sehr eingeschränkten Situationen, die nicht die genauen ethologischen Bedingungen der Stimmgebung Emission bei Mäusen, beeinträchtigen könnten. Die spontane Emission von Ultraschall vocalizations werden müssen besser charakterisierte unter Verwendung einer kontinuierlichen Audio- und Videoaufnahmen, um mehr Licht auf die spontane Gesangsverhalten von Mäusen zu vergießen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions