ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

要約

このプロトコルは、カスタムメイドのポータブルFRET分析器を用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサデータの迅速かつ高感度定量を記載しています。デバイスは、糖度の実用的かつ効率的な評価を可能にする、検出感度を最大臨界温度範囲にマルトースを検出するために使用しました。

要約

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサにおける最近の改善は、イオンおよびアミノ酸を含む種々の小分子を検出するためのそれらの使用を有効にしています。しかしながら、FRETセンサーの生来の弱い信号強度を様々な分野での応用を防止し、高価な、ハイエンドの使用が必要な蛍光光度計になり大きな課題です。以前、我々は、特に、高い検出感度を達成するために、2つの発光波長帯域（530および480 nm）との比を測定することができる費用対効果の高い、高性能なFRET分析器を内蔵しました。 55゜C - 最近では、それは、細菌ペリプラズム結合タンパク質とのFRETセンサー50の臨界温度範囲で最大感度を有するリガンドを検出することが発見されました。このレポートは、温度固有のFRETセンサーと当社のポータブルFRET分析装置を用いて、市販の飲料試料中の糖含量を評価するためのプロトコルについて説明します。我々の結果は、追加予熱することを示しましたFRETセンサーのプロセスが大幅糖含有量のより正確な測定を可能にするために、FRET比の信号を増大させます。カスタムメイドのFRET分析器及びセンサが正常に商業飲料3種類の糖含有量を定量化するために適用しました。我々はさらに小型化や機器の性能向上は、ハイエンドの機器が利用できない環境で手持ち分析装置の使用を容易にするであろうことを期待しています。

概要

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、糖、カルシウムイオン、およびアミノ酸^1-4のような小分子を検出するための生体センサとして使用されてきました。 FRETバイオセンサーは、ペリプラズム結合タンパク質（のPBP）の両末端に融合される蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（CFPS）、および黄色蛍光タンパク質（YFPs）を含みます。糖は、その後のPBPの両端にある2つの蛍光タンパク質の距離と遷移双極子の向きを変化させるセンサに構造変化を引き起こし、FRETセンサーの中央に位置するのPBPに結合します。この変更は、EYFP（530 nm）をECFP（480 nm）での発光波長の比を測定することにより、糖度の定量分析を可能にします。高い感度、特異性、リアルタイムの監視能力、及びFRETバイオセンサーの速い応答時間のために、これらのセンサが広く、環境産業、および医療用途⁵で使用されています。また、ratiomセンサー濃度を容易に制御することができず、バックグラウンド蛍光が常に存在する複雑な生物学的試料中の成分を測定するために使用することができるようにFRETバイオセンサーを用いてetric測定は、重要な実用上の利点を有しています。

定量的な可視化のためのFRETベースのセンサのこれらの利点にもかかわらず、蛍光タンパク質の不完全なドメイン動き転送に小さな構造的変化は、本質的に弱い信号強度を生成します。この弱い信号は、 インビトロまたはインビボ分析 ⁶ に FRETベースのセンサの適用を制限します。その結果、ほとんどのFRETバイオセンサーは高価で高感度な装置の使用を必要とします。以前、我々は、既存の蛍光分析装置⁷と同様の機能を備えた安価なポータブルFRET分析装置を開発しました。この装置では、安価な405 nmの帯域紫外発光ダイオード（LED）は、目の励振を引き起こすために、光源として使用されました電子蛍光シグナル、高価なランプまたはレーザーを置き換えます。分析装置の検出システムは、効率的にシリコンフォトダイオードを有する2つの光検出器上に放熱蛍光信号を集束させます。 55°C大幅レシオメトリックFRETシグナル^8を拡大できた-より最近の研究では、50の検出温度の最適化があることを示しました。この温度固有のシグナル増強は、カスタムメイドのFRETアナライザと一緒に、迅速かつ高感度で、より一般的な診断用途でのFRETセンサーの使用を可能にします。

このプロトコルでは、我々は、商業的に入手可能な飲料の糖含有量を定量することにより、最適なFRET温度条件下FRET解析の一般的な適用可能性を実証しました。このプロトコルは、FRETデバイス動作の詳細、ならびにセンサーおよび試料調製の簡単な説明を提供します。我々は、この報告書は、ポータブルの潜在的な適用を促進することを期待します小規模な実験室環境でのアナライザとFRETベースのバイオセンサーと安価なオンサイト診断装置のさらなる発展のための基盤を提供します。

プロトコル

バイオセンサーの作製

1. 以前に確立されたプロトコル^2に従うことにより^{、CFP-MBP-YFP-}のHis6 -プラスミドpET21a（+）を構築します。
2. 大腸菌 DE3株の単一コロニーをルリアブロス（LB）の5ミリリットルを接種し、振盪しながら16時間37℃でインキュベートします。
3. 転送100 mlのLBを含有し、600 nmで（OD _600）での光学密度が0.5（約3時間）に達するまで振盪インキュベーター中、37℃でインキュベートした500mlフラスコ中にO / N培養物を1ml。
4. 4℃で20分間1000×gでの遠心分離によって50mlのコニカルチューブ中で細胞を収穫。
5. 4℃で20分間、1,000×gで50ミリリットルの氷冷蒸留水（DW）と遠心で各チューブに迅速にペレットを再懸濁。
6. 溶液（エレクトロ細胞）OD _600に達するまで穏やかに旋回することにより、10％（v / v）のグリセロールを氷冷DW50μlにペレットを再懸濁の100の。
7. エレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーションで氷冷エレクトロポレーションキュベットにCFP-MBP-YFP-のHis6 -エレクトロ細胞（OD 100の₆₀₀の細胞を50μl）の混合物を配置し、プラスミドpET21a（+）の10 ngの混合物（18キロボルト/ cmで、25μF）。
8. 迅速にキュベットに1ミリリットルSOC培地を加え、穏やかに15ミリリットル丸底チューブ中で振盪しながら1時間37℃での回復が続く、穏やかに細胞を再懸濁。
9. 100μg/ mlのアンピシリンを含むLBプレート上に細胞を広げ、12時間37℃でインキュベートします。
10. ループを使用して、単一のコロニーを単離し、12時間振とう機で37℃で100μg/ mlのアンピシリンを含むLB 10mlのコロニーを接種します。
11. 100μg/ mlのアンピシリンを含むLBの500ミリリットルに種培養の5ミリリットルを加え、37℃の振盪インキュベーター中で培養をインキュベートします。
12. 0.5mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）ときOD ₆₀₀に達するを追加0.5と24時間37℃で振盪インキュベーターでの培養をインキュベートします。
13. 遠心分離機20分（4℃）のために4500×gで細胞と穏やかに上清を除去します。
14. 5mLの結合緩衝液（20mMのトリス-HCl、pH8.0の、1mMのPMSF、0.5mMのEDTA、および1mM DTT）中でペレットを再懸濁します。
15. 各冷却の10秒でバースト以下、200-300 Wで6 10秒バーストで氷上で細胞を超音波処理します。
16. 10,000×で溶解液を遠心 細胞破片をペレット化し、4℃で30分間、G。新しいコレクションチューブに上清（可溶性タンパク質）を転送します。
17. Ni-NTAアフィニティーカラム（5mlの容量）にFRETセンサータンパク質のアフィニティー精製、負荷クリア細胞溶解物を4mlを達成し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー^{（FPLC）18を}使用して^、クロマトグラフィーアッセイを行います。
18. 洗浄緩衝液I（50mMリン酸緩衝液、300mMの塩化ナトリウム、10mMイミダゾール、pH7.0）での5カラム容量で一度カラムを洗浄します。
19. 洗浄バッファーIIの5カラム容量の（50mMリン酸緩衝液、300mMの塩化ナトリウム、20mMイミダゾール、pH7.0）で洗浄ステップを繰り返し。
20. 溶出緩衝液の5カラム容量の（50mMリン酸緩衝液、300mMの塩化ナトリウム、500mMイミダゾール、pH7.0）でセンサータンパク質を溶出させます。
21. 溶出された試料を濃縮し、脱塩するために、3000×gで10分間のサンプルと遠心機の最大20 mlの濃縮器（10,000 MWの膜サイズ）を記入してください。 0.8％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて濃縮器を補充。最初のサンプル20mlでコンセントレータを充填し、その後、PBSで再充填、二回、この手順を繰り返します。
22. 濃縮し、脱塩漬けセンサータンパク質を回収し、-80℃で保管してください。

FRET Analyzerを使用して、糖度の2.測定

注：FRETアナライザ構成の詳細は、私たちの前の仕事⁷で説明しました。

1. 0.2を含有する0.8％PBSの検出溶液を調製センサータンパク質のμM。
2. FRET分析装置の電源をオンにします。最適な温度を校正するために2秒間「UP」ボタンを押してください。 "UP"と "DOWN"ボタンを使用して53℃に温度を設定し、「SET」ボタンを押してください。
3. キャリブレーションのために、プレスおよび2秒間同時に「UP」と「DOWN」ボタンを押し続けます。 LEDパネルディスプレイ「CALIB」とは、「SET」ボタンを押していることを確認します。
4. アナライザのキュベットホルダーにバッファリングし、「SET」ボタンを押すだけで、PBSを含む12.5×12.5×45ミリメートル（高さ×幅×長さ）の直方体容器（キュベット）を配置します。
5. 砂糖なしのみ検出溶液（2.1を参照）（マルトース/スクロース）を含むものとキュベットを交換し、ベースラインを較正するための「SET」ボタンを押してください。
6. 10mMの砂糖を検出溶液を含むものとキュベットを交換し、「SET」を押してくださいボタン。
7. 飲料サンプルの糖度を測定するために、1分間16,000×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に1 mlの飲料サンプルを置きます。
   注：FRETセンサーベースの蛍光測定は、サンプルのわずか1％（V / V）が全容量に含まれているので、サンプルの特別な前処理を必要としないという利点を有します。しかし、我々は、蛍光測定（ 例えば、細胞、不溶性粒子、脂質、脂肪、または自家蛍光を持つ任意の材料）に影響を与える可能性のある物質を除去することをお勧めします。強酸、強塩基、剤（界面活性剤）を洗浄、又は乳化剤（乳化剤）が高濃度で存在し、FRET生体センサの特性に影響を与える可能性がある場合に加えて、それは、有機溶媒または使用して除去されるべきです中和剤。乳脂肪および乳化剤を凍結スナックから除去されたとき、例えば、試料を16,000×30分間、G、および液体betweeで微量遠心管中で遠心分離しますnは底質や乳製品脂肪のトップ層が抽出されます。ヘキサンの等量は、その後脂質を除去するために30分間、15,000×gで遠心分離し、続いて添加されます。
8. 1-mlシリンジで上清を除去し、シリンジフィルター（孔径0.2μm）を通してそれをフィルタリングします。
9. 静かに0.9ミリリットルのPBSと渦を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに飲料サンプルフィルタリング0.1ミリリットルを置きます。
   注：それは正しく飲料サンプルを希釈することが重要です。糖濃度は、装置のダイナミックレンジ内に入るであろうように、この場合には、1000倍希釈を行いました。私たちは、飲料のラベルで糖度を参照することにより、事前に対象の糖濃度を推定することをお勧めします。
10. 検出溶液の0.495ミリリットルを含むキュベットに希釈飲料サンプル（1％、v / v）での5μlを添加します。
11. FRET分析器のキュベットホルダーにキュベットを置き、53℃に試料溶液を予熱。
12. 糖度を測定するための「SET」ボタンを押してください。
    535分の488ナノメートル^7,8割合を読み取ることによって、温度制御用のペルチェ素子を備えたマルチラベルプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を使用して、FRET測定を評価することが可能であることに注意。ショ糖検出のために、CSY-LHセンサ²で1.1から2.12への手順に従ってください。

結果

FRET分析器を用いて糖度の定量分析を行うためには、観察されたFRET比から標的糖濃度を推定する近似曲線を構築することが必要です。 rは、480 nmでのCFPの発光強度の比とYFPの発光強度は、530nmで生成された定義でき（式1）。

ディスカッション

このプロトコルは、FRETセンサーのための最適な温度でカスタムメイドのFRET解析装置^7を使用して、飲料試料中の糖含量の迅速かつ効率的な定量化を可能にします。分析器は、光源とシリコンフォトダイオードと2つの光検出器として最近開発された、安価な405-nm帯の紫外LEDで設計されました。このデバイスは、より費用対効果の他の同等の蛍光光度計よりなります。デバイスは、特にF...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink